Jenis-Jenis Bakteri Gram Negatif Potensial Patogen Pada Ikan Kerapu Lumpur (Epinephelus tauvina)

(1)

(2)

Lampiran 1. Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua peralatan yang akan digunakan dalam penelitian disterilisasikan terlebih dahulu. Peralatan mikrobiologi disterilisasi dengan oven pada suhu 171˚C selama 1,5 jam. Alat-alat yang terbuat dari kaca sebelum digunakan dicuci dan dikeringkan. Alat-alat tersebut kemudian dibungkus dengan kertas dan disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121˚C selama 20 menit dan tekanan 1 atm. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven. Sedangkan media disterilisasikan pada 121˚C selama 15 menit dan tekanan 1 atm. Sterilisasi pembakaran yaitu jarum ose untuk inokulasi bakteri disterilisasi dengan membakarnya sampai berwarna kemerahan dengan menggunakan lampu Bunsen.

(3)

Lampiran 2. Pembuatan Media Bakteri

1. Pembuatan Media Thiosulfate Citrate Bile Sucrose (TCBS)

Sterilisasi aquades 100 ml dalam erlenmeyer 250 ml lalu di autoclave

selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media TCBS ditimbang secara teknis sebanyak 8,8 g. Kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer yang telah berisi aquades steril 100 ml. Campuran dipanaskan menggunakan hot plate hingga larut dan digoyangkan sampai homogen. Dituangkan kedalam cawan Petri, ditunggu sampai media mengeras kemudian media disimpan ke dalam kulkas.

2. Rimler Shotts Agar (RSA)

Ditimbang media RSA sebanyak 20 g, lalu ukur akuabides sebanyak 500 ml, setelah itu campurkan media RSA dengan akuabides ke dalam labu Erlenmeyer kemudian masukan magnetic stirrer ke dalamnya yang berfungsi untuk mengaduk larutan agar merata, setelah itu tutup erat bagian mulut labu Erlenmeyer dengan erat menggunakan kapas dan alumunium foil, kemudian panaskan larutan media RSA dengan menggunakan hot plate sampai mendidih kemudian dituang ke dalam cawan Petri, ditunggu sampai media mengeras dan disimpan ke dalam kulkas.

3. Mac Conkey Agar (MCA)

(4)

Lampiran 2. (Lanjutan)

Kemudian panaskan larutan media MCA dengan menggunakan hot plate sampai mendidih, lalu larutan media dimasukan di autoklave agar steril, kemudian dituang ke dalam cawan Petri, ditunggu sampai media mengeras dan disimpan ke dalam kulkas.

4. Media Tryptic Soy Agar (TSA)

Ditimbang media TSA sebanyak 20 g, lalu ukur akuabides sebanyak 500 ml, setelah itu campurkan media TSA dengan akuabides ke dalam labu Erlenmeyer kemudian masukan magnetic stirrer ke dalamnya yang berfungsi untuk mengaduk larutan agar merata, setelah itu tutup erat bagian mulut labu Erlenmeyer dengan erat menggunakan kapas dan alumunium foil, kemudian panaskan larutan media TSA dengan menggunakan hot plate sampai mendidih, lalu larutan media dimasukan di autoklave agar steril, kemudian dituang ke dalam cawan Petri, ditunggu sampai media mengeras dan disimpan ke dalam kulkas.

5. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)

(5)

6. Pembuatan Media Sulfit Indol Motility (SIM)

Sebanyak 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 liter air suling, dipanaskan hingga melarut, setelah itu dimasukkan ke tabung reaksi sebanyak 10 mL, disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121⁰C tekanan 15 lbs.

7. Pembuatan Media Metil Red-Voges Proskauer (MR-VP)

(6)

Lampiran 3. Pengambilan Sampel Ikan dan Sampel Air

Pengambilan Sampel Air

Pengambilan sampel air dengan menggunakan botol sampel yang diikatkan dengan tali

Pengukuran Kecerahan Pengukuran Suhu

(7)

Pengambilan Sampel Ikan

Ikan Kerapu (E. tauvina) Ikan KJA I

Ikan KJA II Ikan KJA III

Lampiran 4. Isolasi Bakteri Pada Ikan dan Air

(8)

Isolasi Bakteri

(9)

Lampiran 5. Isolat Pada Media Selektif

Media Selektif

Media TCBS Media Mc Conkey

(10)

Lampiran 6. Pewarnaan Gram

Prosedur Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan dengan membersihkan kaca objek dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api Bunsen, kemudian diambil isolat bakteri masing-masing media dengan jarum ose dan dioleskan pada kaca objek. Isolat bakteri kemudian ditetesi ungu violet dan dibiarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dianginkan hingga kering. Selanjutnya isolat bakteri ditetesi alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dialiri air dan dianginkan hingga kering.

Isolat bakteri kemudian ditetesi safranin selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan kertas penghisap dan dikering anginkan, kemudian dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Bakteri gram positif ditandai dengan warna ungu yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna kristal violet, sedangkan bakteri gram negatif ditandai dengan warna merah muda yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak mampu mengikat warna kristal violet dan hanya terwarnai oleh safranin (pewarna tandingan) (Hadioetomo, 1993).

(11)

Vibrio harveyi Aeromonas salmonicida

(12)

Lampiran 7. Uji Reaksi Biokimia

1. Uji Katalase

Uji katalase dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri dalam menghasilkan enzim katalase dengan menggunakan reagen hidrogen peroksida (H2S2) 3 %, hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena menginaktifkan enzim dalam sel. Katalase merupakan enzim yang digunakan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida menjadi H2O dan O2. Adapun prosedurnya adalah diambil isolate murni bakteri dengan jarum ose steril, goreskan isolate pada slide glass, teteskan H2O2 3% pada goresan isolate di slide glass, amati pembentukan gelembung udara yang terjadi pada saat koloni bakteri bercampur atau bereaksi dengan H2O2 3%. Katalase bersifat (+) akan terjadi gelembung udara dan katalase bersifat negatif (-) jika tidak terjadi gelembung udara.

2. Uji Oksidase

Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri dengan menggunakan paper oksidase yang dapat dilihat dari perubahan warna yang terjadi pada paper oksidase. Oksidase bersifat (+) akan terjadi perubahan warna ungu dan oksidase bersifat negatif (-) jika tidak ada perubahan warna pada paper oksidase.

3. Uji KOH

(13)

Adapun prosedurnya adalah bakteri murni diambil dengan menggunakan jarum ose steril dan digoreskan ke slide glass yang telah ditetesi KOH 3%. KOH bersifat positif (+) akan mengeluarkan lender dan KOH bersifat (-) jika tidak ada lender yang ditimbulkan. Hasil gram strain dapat diketahui dengan mengetahui KOH positif (+) maka gram (-) dan jika KOH (-) maka gram (+).

4. Uji Indol

Uji Indol dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri menghasilkan indol dari asam amino tryptophan. Adapun prosedur dalam uji indol adalah Inokulum bakteri diambil menggunakan jarum ose untuk ditanam dalam media SIM, diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam. Lalu diteteskan reagen Kovacks (terdiri dari dimetil aminobenzaldehid, n-amyl alkohol & HClp). Hasil positif (+) ditunjukkan dengan terbentuknya cincin merah. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan terbentuknya cincin kuning.

5. Uji SIM (Sulfit Indol Motility)

(14)

6. Uji O/F (Oksidatif/Fermentatif)

Uji O/F medium (Oksidatif/Fermentatif) dilakukan untuk mengetahui sifat oksidatif atau fermentatif bakteri terhadap glukosa dengan menggunakan dua tabung media yang salah satunya ditutup dengan menggunakan paraffin, sehingga diharapkan di dalam media tidak terdapat udara yang dapat mendukung terjadinya fermentasi. Adapun prosedurnya adalah inokulasikan bakteri kedalam media O/F secara tegak lurus, inkubasi pada suhu ruangan selama 24-48 jam. Jika kedua larutan tetap hijau maka NR (No Reaction). Jika yang tanpa parafin kuning maka oksidatif dan jika keduanya kuning maka fermentatif.

7. Uji Metil Red (MR)

Uji Metil Red dilakukan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran, sehingga dapat mengubah indikator metil merah menjadi merah. Pada Uji Metil Red diinokulasi bakteri dengan menggunakan jarum ose ke dalam media MR-VP. Kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Lalu diteteskan 2 tetes reagen metil red. Hasil positif (+) ditunjukkan dengan terbentuk cincin merah. Hasil negatif (-) ditunjukkan tidak terdapat cincin merah.

8. Uji Voges Proskauer (VP)

(15)

9. Uji Citrat

Pengujian citrat dilakukan untuk membedakan Enterobacteriaceae dan bakteri gram negatif tertentu berdasarkan penggunaan citrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Prosedurnya adalah diambil bakteri dengan menggunakan jarum ose dan diinokulasikan ke dalam media Simmon Citrate Agar, inkubasi pada suhu 35⁰C selama 48-96 jam. Hasil positif (+) ditunjukkan dengan perubahan media dari hijau menjadi biru. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan tidak terjadi perubahan warna media tetap hijau.

10. Uji Urease

Uji urease dilakukan untuk menentukan bakteri yang mampu mengurai urea oleh ezim urease. Diambil isolat bakteri yang akan diidentifikasi menggunakan jarum ose. Setelah itu, satu ose koloni bakteri digoreskan pada media urea dengan teknik gores zig-zag. Media diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 jam. Hasil positif (+) ditunjukkan dengan warna media menjadi merah muda. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan tidak terjadi perubahan warna pada media. 11. Uji LIA (Lysin Iron Agar)

(16)

12. Uji MIO (Motility Indole Ornitin)

Uji MIO dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri pada daerah anaerob. Prosedur kerjanya bakteri diinokulasikan kedalam media MIO secara tegak lurus, Inkubasi pada suhu ruangan selama 18-24 jam. Hasil positif (+) apabila semakin ungu dan negatif (-) jika semakin kuning.

13. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Uji TSIA dilakukan untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan kemampuan memecah dextrose, laktosa, sukrosa dan pembebasan sulfide, selain itu Uji TSIA berfungsi untuk mengetahui bakteri menghasilkan gas dan H2S atau tidak. Media yang digunakan mempunyai dua bagian, yaitu slant (miring) dan butt

(tegak).

Prosedur kerjanya adalah inokulum bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril. Inokulasikan kedalam media TSIA dengan cara tusukan dan goresan, inkubasikan ke dalam media TSIA dengan cara tusukan dan goresan, inkubasikan dengan ruangan selama 24 jam. Amati perubahan warna pada test tube pada bagian slant (miring) dan butt (tegak). Jika berwarna merah berarti

(17)

14. Uji Gelatin

Pengujian gelatin digunakan untuk melihat kemampuan bakteri dalam mencerna gelatin. Uji gelatin dapat juga digunakan untuk mendeteksi aktivitas proteolytic antara bakteri. Inokulum bakteri diambil dengan jarum ose steril. Inokulasikan ke dalam media gelatin dengan cara ditusuk tegak satu garis. Media gelatin diinkubasikan pada suhu ruangan selama 24 jam. Setelah diinkubasi, masukan biakan ke dalam kulkas selama 10-20 menit. Hasil positif (+) ditunjukkan dengan media mencair. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan media membeku.

15. Uji Gula

Uji gula dilakukan dengan tujuan mendeterminasi kemampuan bakteri dalam mendegradasikan gula dan menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap-tiap jenis gula, yaitu glukosa, sukrosa, maltosa, manitol, sukrosa, sorbitol, laktosa, dan arabinosa.

(18)

(19)

Lampiran 8. Hasil Bakteri Pada Media TSA

Vibrio harveyi Aeromonas salmonicida