LAPORAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI ENZYM
Percobaan 4: ELEKTROFORESIS PROTEIN ENZIM
AVNER DANIEL GONIE
31120021
FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
YOGYAKARTA
BAB I
PENDAHULUAN
A. TUJUAN
1. Mengerti prinsip dasar elektroforesis
2. Menggunakan teknik SDS-PAGE untuk memisahkan protein - protein darah.
B. LANDASAN TEORI
Enzim merupakan protein yang khusus disintesis oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi yang berlangsung di dalamnya. Fungsi khusus dari enzim adalah untuk menurunkan energi aktivasi, mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan yang tetap tanpa mengubah besarnya tetapan keseimbangan dan sebagai pengendali reaksinya (Martoharsono, 1994).
Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni yang telah diamati sampa saat ini adalah protein. Aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang sederhana, sampai ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya (Lehninger, 1995).
Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.
Elektroforesis Kertas: merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks) sebagai fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut (Boyer, 2004).
Elektroforesis Gel: merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama. Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruhmedan listrik. Media atau gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel (elektroforesis protein). Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran molekul, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutanbuffer elektroforesis (Martin,
2006).
Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung s ampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya. (Yuwono, 2008).
SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik (Anam, 2009).
Tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis yaitu untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis protein dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan digunakan sebagai metode pemisahan untuk menentukan komponen dari protein (Wibowo, 2010).
Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan molekul protein yang kecil. Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein. Pada proses pembuatan gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen
(Prihanto, 2011).
Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, proteinakan tertarik ke bagian bawah arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul palingkecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar akan berada pada bagian atas dari gel (Utami,
2007).
Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDS-PAGE. Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis yaitu untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentukpada gel pemisah. Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol. Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis (Anam, 2009).
BAB II
METODE
A. ALAT dan BAHAN 1. Alat : Sentrifus Microsentrifuge Kotak es Sonikator Vorteks
Tabung sentrifus cap 10 ml
Sampel darah
B. CARA KERJA
Untuk mengisolasi protein darah diperlukan beberapa tahapan yaitu : 1. Pemisahan sel-sel darah dengan plasma darah
2. Isolasi protein dari sel-sel darah
3. Salting out menggunakan garam berkonsentrasi
2. Bahan :
PBS 0,1 M pH 7,4.
Separating gel 3 ml (5,4 ml larutan A ; 3,75 ml
larutan B; 5,85 ml dH2O; 100 µl APS 10%; 40
µl TEMED ).
Stacking gel 3% sebanyak 3 ml dibuat dengan
susunan : 0,45 ml larutan A; 0,567 ml 1 M Tris-Cl pH 6,8;0,045 ml SDS 10% 1,938 ml dH2O;
30 µl APS 10%; 5 µl TEMED.
Larutan A : campuran 29,2 g acrylamid dan 0,8
bis-acrylamid dalam 100 ml akuades.
Larutan B : (4X separating gel buffer) :
campuran dari 75 ml 2M Tris-HCl (pH 8,8) 4 ml 10% SDS dan 21 ml H2O.
100 ml buffer cuci (150 mM NaCl, 5 mM
Na2PO4, 0,1mM EDTA pH 7,4). Simpan dalam
kondisi dingin.
100 ml buffer hemolisis (5 mM Na2PO4, 0,1
a. Pemisahan sel-sel darah dan plasma darah
b. Isolasi protein dari sel-sel darah
diambil 5 ml sampel darah dimasukan dalam tabung sentrifugasi 10 ml, sentrifus dengan kecepatan
5000 rpm selama 15 menit
diambil 500 µl bagian supernatan (sebagai plasma darah) disimpan dalam tabung
mikrosentrifuse 2 ml dan tandai dengan kode PD. Dibuat dalam 2
tabung ulangan
dibuang secara perlahan sisa supernatan, kemudian ditambahkan
6 ml buffer cuci (dalam kondisi dingin)
Divorteks dan disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit
dibuang supernatan dengan hati-hati dilakukan ulangan dari langkah 4-6
sekali lagi. Endapan yang diperoleh merupakan sel-sel darah.
ditambahkan 6 ml buffer hemolisis (dalam kondisi dingin) pada endapan
sel-sel darah yang diperoleh pada langkah bagian A
divorteks, kemudian disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama
15 menit
diambil 1 ml supernatan dengan pipet secara hati-hati dan simpan dalam
tabung mikrosentrifuse 2 ml dan tandai dengan protein sitoplasmik
(PS) disimpan dalam lemari es
c. Pengendapan protein plasma dengan kadar garam tinggi
diambil mikrosentrifus cap 2 ml dan ditambahkan 250 µl larutan
(NH
4)2SO4 yang jenuh
ditambahkan 500 µl sampel plasma darah dari tabung kode PD
divorteks dan diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit
disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit dibuang kira-kira sebanyak 5 ml sisa
supernatan pada tabung
ditambahkan 7 ml buffer hemolisis dingin, divorteks
disentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selama 15 menit
dibuang supernatan dengan hati-hati, sisakan sekitar 2 ml berikut endapan
dipindahkan kedalam mikrosentrifuse baru, beri kode protein membran
(PM)
disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 30 menit
dibuang supernatan hati-hati dan simpan dalam kotak es
d. Pengendapan protein plasma dengan etanol
diambil bagian supernatan dan simpan dalam tabung sentrifuse
diberi kode PSG dan simpan dalam suhu dingin
ditambahkan kembali 1 ml larutan 50% (NH
4)2SO4 (yang tak jenuh)
dihomogenkan dengan pipet
diambil mikrosentrifuse cap 2 ml dan ditambahkan 250 µl larutan
(NH4)2SO4 yang jenuh
ditambahkan 500 µl sampel plasma darah dari tabung kode PD
divorteks dan diinkubasi pada suhu dingin selama 5 menit
disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 rpm selama 3 menit
dibuang bagian supernatan dan keringkan bagian endapan
diberi kode sampel PEG pada bagian endapan merupakan sampel protein
hasil pengendapan dengan garam berkonsentrasi tinggi
e. Elektroforesis SDS-PAGE
diambil bagian supernatan dan simpan dalam tabung sentrifuse
diberi kode PSE dan simpan dalam suhu dingin
ditambahkan kembali 1 ml etanol dalam kondisi dingin dihomogenkan dengan pipet
disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit
dibuang bagian supernatan dan keringkan bagian endapan
diberi kode sampel PEE pada bagian endapan merupakan sampel protein
hasil pengendapan dengan garam berkonsentrasi tinggi
diambil masing-masing sampel dengan kode PS, PSG, dan PSE
sebanyak 50 µl
ditambahkan 450 µl buffer sampel dan 25µl ß-merkaptoetanol ke setiap
tabung.
BAB III
HASIL dan PEMBAHASAN
A. HASILdimasukan sampel ke dalam sumur yang terbentuk
dielektroforensis pada voltage 120 mV selama 1 jam,
diikuti dengan pewarnaan gel dengan menggunakan coomassie blue
direndam gel dalam larutan
coomassie blue semalam (digoyang
pelan) diambil masing-masing sampel
dengan kode PS, PSG, dan PSE sebanyak 50 µl
ditambahkan 900 µl buffer sampel dan 25µl ß-merkaptoetanol ke setiap
tabung
2
divorteks 1 & 2 diwaterbath dalam kondisi mendidih selama 5 menit. disentrifugasi dengan
kecepatan tinggi selama 3 menit..
B. PEMBAHASAN
BAB IV
KESIMPULAN
BAB V
DAFTAR PUSTAKA
Anam, K. 2009. SDS-PAGE dengan Silver Staining dan Zimogram. Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
Boyer, R. 2004. Modern Experimental Biochemistry. California: The Benjamin Publishing Company
Lehninger, L. A., (1993), Dasar-Dasar Biokimia, Maggy T, penerjemah. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari School of Medicine.
Martin, R. 2006. Gel Electroforesis: Nucleid Acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd.
Martoharsono, S. (1994). Biokimia jilid 1. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Prihanto, A.A. 2011. Teknik Molekuler: Elektroforesis. http://asep.lecture.ub.ac.id. Diakses Tanggal 15 Mei 2014
Utami, E.S.W., dkk. 2007. Sintetis Protein Selama Embriogenesis Somatik Anggrek Bulan Phalaenopsis amabilis (L.). Jurnal Biodiversitas. Vol.8, No.3, Hal.188-191
Wibowo, M.S. 2010. Elektroforesis. Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Penerbit Erlangga
