66
Pengaruh Pengasaman terhadap Fotodegradasi Klorofil a
Aji Wahyu Budiyanto1), Soenarto Notosudarmo1,2), dan Leenawaty Limantara3)1)Magister Biologi Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga 2)Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga
3)Ma Chung Research Center for Photosynthetic Pigments,Ma Chung University, Malang e-mal: [email protected]
Diterima 17 Juli 2008, disetujui untuk dipublikasikan 10 September 2008
Abstrak
Klorofil merupakan pigmen tetrapirol yang potensial untuk dikembangkan sebagai agen fotosensitiser pada terapi fotodinamika kanker. Kondisi lingkungan serta sifat sensitiser selama berinteraksi merupakan parameter penting untuk mengetahui nasib sensitizer selanjutnya. Lingkungan yang bersifat asam merupakan salah satu kondisi dominan pada penderita kanker. Penelitian iradiasi klorofil a pada larutan asam bertujuan untuk melihat pengaruh asam terhadap fotostabilitasnya yang diamati melalui pola spektranya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa titrasi asam asetat 3 M kurang dari 250 µL menyebabkan degradasi klorofil semakin meningkat. Volume serta jenis asam tidak hanya menyebabkan feofitinisasi, namun juga menyebabkan proses deagregasi feofitin yang ditandai dengan bergesernya serapan Qy ke arah λ yang lebih pendek (hipsokromik).
Kata kunci: Deagregasi, Klorofil a, Iradiasi
Abstract
Chlorophyll is tetrapyrole pigment, which is potential to be developed as photosensitizer agent on cancer photodynamic therapy. Its environments and properties during interaction are an important parameter to know the next fate of the sensitizer. Acidic environment is one of the key factors on cancerous patients. The research was carried out to determine the acidification effect against photostability of chlorophyll a that was observed by its spectral pattern. Result showed that titration of less than 250 µL acetic acid 3 M caused degradation of chlorophyll a more rapidly. Volume and type of acid properties didnot only influenced pheophytinization reaction, but also caused pheophytin a to deaggregate, that was characterized by hypsochromic shift of Qy band.
Keywords: Chlorophyll a, Disaggregation, Irradiation. 1. Pendahuluan
Klorofil (Gambar 1) merupakan pigmen utama yang berperan dalam reaksi fotokimia pada pusat reaksi fotosintesis. Fungsi utama klorofil di dalam perangkat fotosintesis diantaranya sebagai penyerap cahaya, pentransfer energi eksitasi ke pusat reaksi dan pemisah muatan pada membran fotosintetik (Schaber dkk., 1984; Limantara dkk., 1998; Scheer, 2006).
Keberadaan molekul klorofil di dalam perangkat fotosintesis ternyata mampu memproduksi energi secara efisien dengan meminimalisasi energi yang hilang. Penyerapan energi yang tinggi selama proses fotosintesis disebabkan oleh adanya tahapan eksitasi klorofil yang relatif lama (≤ 10-8 detik).
Semakin lama tahapan eksitasi singlet klorofil, semakin besar konversi energi elektronik dari tingkatan dasar ke tingkatan tereksitasi triplet dapat terjadi. Kelebihan energi pada tingkatan tereksitasi triplet memberi peluang klorofil untuk mentransfer energinya ke molekul oksigen di sekitarnya. Reaksi ini memproduksi singlet oksigen reaktif (reactive oxygen spesies/ROS)
yang bersifat merusak (Fiedor dkk., 2002; Agostiano dkk., 2003; Limantara dkk., 2006).
Gambar 1. Struktur klorofil.
Substitusi inti logam dan R2 pada tabel menunjukkan
turunan dari klorofil a.
N N N N CH3 O C O H3CO Mg H2C H2C C O R2-O H2C -CH3 CH3 H H Gugus Fitil = (-C20H39) 3 5 7 13 10 20 15 I II III IV V Nama Mg R2 Klorofil a + Fitil Klorofilid a + H Feofitin a - Fitil Feoforbid a - H
Pada organisme fotosintetik, ROS yang ditimbulkan selama reaksi fotokimia dapat diredam dengan kehadiran karotenoid (Chen dan Huang, 1998; Frank dkk., 1999). Proses ini sangat berbahaya apabila terjadi pada organisme nonfotosintetik karena dapat merusak sel. Sifat fototoksisitas klorofil yang timbul ketika berinteraksi dengan cahaya tersebut, kemudian dikembangkan untuk aplikasi perusakan/penghancuran sel kanker yang dikenal sebagai terapi fotodinamika tumor dan kanker (Agostinis dkk., 2004; Riberio dkk., 2004; Limantara dkk., 2006).
Dalam beberapa dekade terakhir, klorofil dan turunannya dikembangkan sebagai fotosensitiser generasi ketiga. Klorofil a merupakan substansi yang baik dalam menstimulasi terbentuknya singlet oksigen serta merupakan prekursor potensial untuk sintesis sensitiser baru (Brandis dkk., 2006). Selain itu, klorofil memiliki sifat fotofisika yang menyerupai porfirin. Karena klorofil mempunyai wilayah serapan serta intensitas yang lebih besar dari porfirin, maka klorofil lebih banyak dikembangkan untuk aplikasi terapi fotodinamika tumor dan kanker daripada porfirin (Bonnett dan Martinez, 2001; Derosa dan Crutchley, 2002). Kelebihan lain dari sensitiser golongan ini adalah mudah terakumulasi pada jaringan kanker (Maestrin dkk., 2004).
Interaksi senyawa klorin (termasuk di dalamnya klorofil) dengan protein serta air di dalam sel dapat terjadi secara aktif. Ikatan ketiga molekul tersebut dapat menghasilkan agregat. Dalam pengobatan terapi fotodinamika tumor dan kanker, proses agregasi ini tidak dapat dihindarkan sehingga analisis skala laboratorium terus dikembangkan untuk meneliti sifat serta karakteristik dari agregat klorofil tersebut. Secara in vitro, agregasi terjadi ketika klorofil berinteraksi dengan sistem campuran pelarut/air. Ikatan hidrogen yang terbentuk antara klorofil dengan sistem campuran dua pelarut tersebut merupakan bentuk ikatan hidrogen dari gugus peptida dalam protein. Agregasi klorofil di dalam suatu pelarut tidak hanya berdampak pada struktur elektroniknya, namun juga berpengaruh terhadap sifat fotokimia maupun fotofisikanya (Katz dkk., 1991; Scherz dkk., 1991; De Paula dkk., 1995).
Kondisi lingkungan serta struktur dari sensitiser merupakan parameter penting untuk menentukan nasib sensitizer selama iradiasi (Limantara dkk., 2006). Situasi asam merupakan salah satu kondisi yang dominan pada teknik pengobatan penyakit kanker. Biasanya, jaringan kanker mempunyai nilai pH yang rendah. Tingkat keasaman di luar jaringan sel kanker mencapai kurang dari 6 (pH<6) karena produksi asam yang dihasilkan selama proses metabolisme relatif tinggi (Breedveld dkk., 2007). Penelitian mengenai pengaruh asam yang pernah dilaporkan umumnya terkait dengan kajian-kajian stabilitas struktur terhadap
asam dan proses pembentukan produk degradasinya seperti pelepasan inti logam klorofil akibat adanya asam dan selanjutnya terbentuk feofitin (Gross, 1991; Jeffrey dkk., 1997; Gaur dkk., 2006). Namun, pengaruh asam lemah serta asam kuat terhadap klorofil selama iradiasi belum banyak diteliti. Informasi mengenai karakteristik fotokimia secara in vitro dari klorofil a perlu diketahui sebelum diaplikasikan untuk tujuan pengobatan.
Berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh asam lemah dan asam kuat terhadap fotostabilitas klorofil a dalam pelarut aseton maupun metanol yang dilihat dari sifat pola spektranya.
2. Metode
2.1 Ekstraksi pigmen
Daun yang telah dihaluskan, diekstraksi menggunakan campuran aseton:metanol (7:3, v/v) hingga seluruh pigmen terekstraksi (Britton dkk., 1995). Ekstrak yang diperoleh dipartisi dengan dietil eter sebanyak 3 kali kemudian ke dalam fase organik ditambah natrium sulfat anhidrat sampai air dapat terikat maksimal. Ekstrak pigmen yang telah terbebas dari air kemudian dikeringkan menggunakan penguap putar (Heidolph Laborota 4010).
2.2 Isolasi klorofil a
Ekstrak klorofil kering dilarutkan dalam sedikit pelarut, kemudian dipisahkan menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Silika Gel 60 dan fase gerak heksan:eter:aseton (60:30:20, v/v/v). Pita berwarna hijau biru (klorofil a) ditampung kemudian dikeringkan. Klorofil a hasil isolasi diidentifikasi dengan pembanding klorofil a marker yang diperoleh dari laboratorium klorofil Ludwig-Maximillian, Munich, Jerman dan dikaji kemurniannya dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan spektroskopi UV-Vis.
2.3 Pengaruh asam kuat dan lemah terhadap foto-stabilitas klorofil a
Sejumlah isolat klorofil a dilarutkan ke dalam metanol atau aseton hingga mempunyai absorbansi pada pita Qy ~ 1.0. Asam klorida 3 M atau asam asetat 3 M ditambahkan ke dalam larutan klorofil dengan variasi volume 0, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, dan 1250 µL hingga volume total larutan 3 mL. Larutan pigmen diaduk dalam kuvet terbuka sambil diiradiasi dengan lampu pijar (Intralux 6100) menggunakan filter merah RG 630 (Schott, λ ≥ 630 nm) dengan intensitas 200 lux pada suhu ruang. Lama penyinaran dari masing-masing perlakuan adalah 0 sampai 30 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan setiap 2,5 menit.
Efek penambahan asam serta fotodegradasi dari klorofil a dideteksi dengan spektrofotometer berkas rangkap Varian Cary 50 pada λ 350–1100 nm. Analisis pola spektra dilakukan sebelum dan sesudah iradiasi pada setiap perlakuan.
3. Hasil dan Diskusi
3.1 Efek iradiasi terhadap spektra UV-Vis klorofil a Pengaruh iradiasi sinar merah (λ ≥ 630 nm) dengan intensitas 200 lux terhadap larutan klorofil a menyebabkan penurunan absorbansi pita Qy. Gambar 2 menunjukkan proses hipokromik (penurunan absorbansi) klorofil a dalam pelarut aseton yang efeknya berjalan lebih lambat dibandingkan dalam pelarut metanol. Selama penyinaran 30 menit, absorbansi pita Qy klorofil a dalam pelarut aseton dan metanol mengalami peluruhan masing-masing sebesar 56,4 dan 78,8 %.
Gambar 2. Spektra UV-Vis fotodegradasi klorofil a
selama 30 menit. Pengukuran spektra dilakukan setiap 2,5 menit dalam pelarut aseton (a) dan metanol (b). Untuk semua grafik, tanda (.) pada satuan absorbansi menggantikan tanda (,) (desimal).
Secara kualitatif, intensitas Qy mengalami penurunan secara cepat pada awal penyinaran hingga menit ke-20, kemudian absorbansi mengalami penurunan yang cenderung melambat hingga menit ke-30. Ketika klorofil a mengalami proses hipokromik, diikuti peningkatan serapan di daerah sekitar 460 hingga 570 nm dan di daerah > 700 nm. Serapan di daerah > 700 nm terlihat jelas selama iradiasi klorofil a dalam aseton. Hasil analisis spektroskopi UV-Vis
menunjukkan klorofil a dalam aseton mengalami peningkatan serapan hingga 0,067 a.u. pada λ 808 nm. Namun, serapan serupa tidak tampak jelas pada klorofil a yang diiradiasi dalam metanol.
Reaksi fotokimia pada larutan klorofil a selama iradiasi menyebabkan pemudaran warna dari klorofil a. Zvezdanovic dan Markovic (2008) menyatakan pemucatan warna klorofil a merupakan salah satu indikasi terbentuknya spesies triplet klorofil. Baugher dan kawan-kawan (1979) serta Shepanski dan Anderson (1981) juga meneliti tentang pembentukan singlet dan triplet klorofil terhadap efek fotolisis yang diamati melalui spektroskopi absorbsi. Tahapan eksitasi triplet mempunyai serapan yang lebih luas dengan serapan maksimal pada λ 460 nm, serapan tambahan pada λ 540 nm. Serapan eksitasi di daerah sekitar λ 400–500 nm merupakan tahapan eksitasi terendah dari spesies singlet. Baugher dan kawan-kawan (1979) menemukan serapan lemah di daerah λ 800–830 nm berasal dari singlet dan radikal klorofil.
3.2 Pengaruh pelarut selama fotodekomposisi klorofil a Gambar 3 menunjukkan perbandingan laju fotodegradasi klorofil dalam aseton dan metanol. Interaksi molekul pelarut dengan klorofil di dalam larutan menghasilkan ikatan koordinasi (Nishizawa dan Koyama 1991; Nishizawa dkk., 1994; Koyama dkk., 1995) yang mempengaruhi perbedaan waktu tinggal tahapan eksitasi klorofil (Kanzaki dkk., 1990; Nishizawa dan Koyama, 1991). Nishizawa dan kawan-kawan (1994) serta Marsh dan Connoly (1984) menemukan tahapan singlet pada penta kordinasi mempunyai waktu tinggal lebih lama dibandingkan dengan koordinasi heksa selama penyinaran. Namun, waktu tinggal tahapan triplet pada koordinasi penta lebih cepat daripada koordinasi heksa. Stabilitas tahapan triplet yang tinggi menyebabkan kerusakan klorofil semakin besar. Selain itu, lamanya tahapan triplet juga menyebabkan transformasi spesies radikal kation selama proses fotooksidasi berlangsung (Brereton dan Sanders, 1983; Zvezdanovic dan Markovic, 2008).
Gambar 3. Laju fotodegradasi klorofil a dalam aseton
(–∆–) dan dalam metanol (–O–).
Absorbansi (a.u) Waktu (menit) Panjang gelombang (nm) Absorba nsi (a .u ) (a) Panjang gelombang (nm) Absorbansi (a.u) (b)
Produk fotooksidasi yang dihasilkan selama iradiasi klorofil a diduga mempunyai aktivitas penghambatan terhadap fotoreaksi larutan klorofil a. Kenyataan ini dapat dilihat pada Gambar 2 dan Gambar 3 yang menunjukkan penurunan absorbansi yang semakin lambat setelah iradiasi 20 menit. Scheer (2006) menyatakan radikal kation dapat menekan tahapan eksitasi klorofil sebagai bentuk proteksi terhadap kerusakan. Penekanan tahapan eksitasi oleh radikal kation juga dijelaskan oleh Limantara dan kawan-kawan, (1998) di mana produksi singlet oksigen radikal pada mutan bakteri fotosintetik yang tidak mempunyai karotenoid dapat diredam dengan kehadiran radikal kation bakterioklorofil a. Stabilitas klorofil a dalam pelarut aseton terhadap penyinaran diduga berkaitan dengan terbentuknya radikal kation. Hasil penelitian Borg dan kawan-kawan (1970) dan Limantara dan kawan-kawan (2006) menunjukkan radikal kation mempunyai serapan lemah di daerah merah pada λ ≥ 800 nm. Merujuk pada penelitian tersebut, maka serapan yang muncul pada daerah λ 808–815 nm ketika larutan klorofil a dalam aseton disinari dengan cahaya merah adalah populasi radikal klorofil (Gambar 2a). Kondisi ini bertolak belakang dengan adanya produksi radikal kation dalam larutan metanol yang relatif rendah. Borg dan kawan-kawan (1970) serta Brereton dan Sanders (1983) mengungkapkan radikal kation klorofil cenderung tidak stabil di dalam metanol, kemudian membentuk klorofil alomer.
3.3 Pembentukan feofitin selama fotoreaksi
Penambahan asam asetat 3 M sebanyak 50 µL ke dalam larutan klorofil a, mulai mempengaruhi kecepatan fotodegradasi klorofil pada iradiasi 30 menit. Dinamika laju degradasi klorofil tinggi ketika volume asam asetat yang ditambahkan kurang dari 750 µL. Tetapi, penurunan absorbansi pada larutan klorofil dalam aseton mulai stabil pada penambahan asam sebanyak 750 µL. Fotostabilitas klorofil a dalam metanol mempunyai karakteristik degradasi yang berlainan dengan klorofil a dalam aseton. Dalam metanol, penurunan absorbansi pita Qy klorofil mulai terhambat dengan penambahan asam asetat sebanyak 250 µL. Stabilitas maksimal klorofil a dalam metanol terjadi pada pengasaman larutan klorofil sebanyak 750 µL dengan persentase hipokromik pita Qy mencapai 17,3%. Kestabilan ini disebabkan proses pembentukan feofitin selama proses iradiasi pada larutan klorofil yang dititrasi dengan larutan asam asetat.
Fotofeofitinisasi klorofil a dalam aseton terbentuk pada larutan klorofil a yang ditambah 750 µL asam asetat setelah proses iluminasi selama 5 menit. Proses ini juga tampak pada penambahan 250 µL asam asetat pada larutan klorofil a dalam metanol setelah iradiasi selama 10 menit. Berubahnya klorofil menjadi
feofitin ditandai dengan munculnya serapan di daerah sekitar λ 506 dan 530 nm (Gambar 4). Cahaya berperan dalam mempercepat proses reaksi feofitinisasi ini. Iradiasi terhadap asam asetat menghasilkan ion hidrogen melalui reaksi disosiasi, kemudian melepaskan logam Mg dari molekul klorofil. Selain itu, mekanisme feofitinisasi mungkin juga terjadi antara reaksi reduksi klorofil dengan ion hidrogen yang diikuti proses oksidasi (Banister, 1959) selama iradiasi. Efek pemanasan selama fotofeofitinisasi juga berperan terhadap kecepatan lepasnya inti logam Mg pada struktur klorofil a. Gaur dan kawan-kawan (2006) menyatakan bahwa gugus CH3 pada atom C-7 klorofil
a sangat rentan terhadap pelepasan elektron selama pemanasan. Perubahan strukur klorofil menjadi turunannya akibat induksi cahaya merupakan tahap peredaman terhadap fotoreaksi (Kakitani dkk., 2003).
Gambar 4. Pembentukan feofitin selama iradiasi
klorofil a, dalam aseton pada penambahan asam asetat 750 µL (a), klorofil a adlam metanol pada penambahan asam asetat 250 µL (b) dengan pola spektra pada selang penyinaran 5 menit: 0 menit (-), 5 menit (– – –), 10 menit (• • •), 15 menit (― • ―), 20 menit (― • •―), 25 menit (- - -), dan 30 menit (····).
Penambahan asam asetat ke dalam klorofil a (metanol) pada volume tertentu (Tabel 1) menyebabkan kestabilannya terhadap efek penyinaran semakin meningkat karena terbentuknya feofitin. Namun, penambahan asam asetat sebesar 1000 dan 1250 µL pada klorofil a dalam metanol mengakibatkan dekomposisi yang lebih tinggi dibandingkan dengan penambahan asam asetat sebanyak 750 µL. Penurunan fotostabilitas klorofil a dalam metanol ketika diberi
Panjang gelombang (nm) Absorbansi (a.u) (a) (b) Panjang gelombang (nm) Absorbansi (a.u)
larutan asam asetat sebanyak 1000 dan 1250 µL diduga akibat terbentuknya agregat, sehingga jumlah molekul asam yang cenderung tinggi akan mempercepat degradasi agregat klorofil a. Lebih lanjut, Tabel 1 memperlihatkan titrasi asam sebanyak 1000 dan 1250 µL menghasilkan penurunan absorbansi pita Qy masing-masing sebesar 51,1 dan 45,6%.
Tabel 1. Persentase penurunan absorbansi Qy klorofil a
dalam metanol dan aseton pada berbagai penambahan volume asam asetat 3 M setelah iradiasi 30 menit
Volume asam asetat
(µL)
Persentase penurunan Qy klorofil a setelah iradiasi 30 menit
50 78,80 59,3 100 79,7 63,64 250 80,2 54,0 500 83,84 26,7 750 74,4 17,3 100 51,1 34,8* *) menunjukkan terjadi aggregasi klorofil (λmaks≥ 693
nm)
Terdapat tiga substansi yang bereaksi ketika cairan asam ditambahkan ke dalam larutan klorofil a, yaitu asam, air, dan pelarut. Interaksi ketiganya berdampak pada perubahan kelarutan dan struktur molekul klorofil a. Secara tidak langsung, terbentuknya klorofil menjadi feofitin mempengaruhi kestabilan klorofil a terhadap efek iradiasi. Salah satu faktor penentu kestabilan klorofil a terhadap fotodegradasi diduga karena kehadiran ligan bifungsional seperti air. Gross (1991) menerangkan air dapat berfungsi sebagai lapisan pelindung senyawa pigmen dari proses degradasi. Manfaat air sebagai pencegah efek fotokimia tersebut juga dikemukakan oleh Mac Donald dan Dougherty (2001). Mereka menemukan bahwa peningkatan serapan cahaya oleh molekul air (λ > 900 nm) mampu mengurangi dosis iradiasi. Kadar air yang tinggi juga berdampak pada peningkatan efek pemanasan selama proses fotokimia.
Proses tarik-menarik yang terjadi antara pelarut, air, dan molekul pigmen ketika ditambahkan larutan asam, menghasilkan suatu lapisan koloid yang terdiri dari kumpulan pigmen yang disebut agregasi pigmen (Katz dkk., 1991). Agregasi pigmen dalam aseton ditandai dengan pergeseran batokromik sebesar ~3nm dari keadaan sebelum perlakuan. Populasi agregat pigmen dalam pelarut metanol menunjukkan pergeseran panjang gelombang pita serapan yang lebih besar yaitu sekitar 19 nm. Serapan maksimal spesies agregat pigmen ini muncul pada λ 666 dan 695 nm, masing-masing pada pelarut aseton dan metanol. Pembentukan agregat ini merupakan salah satu bentuk
proteksi terhadap kerusakan. Agregat pigmen dilaporkan sebagai peredam yang sangat efektif karena agregat ini bersifat memperpendek waktu tinggal tahapan eksitasi triplet klorofil (Katz dkk., 1978; Scherz dkk., 1991; Zvezdanovic dan Markovic, 2008). 3.4 Fotodeagregasi feofitin a dalam metanol
Proses agregasi paling besar terjadi pada larutan klorofil a dalam metanol. Ketika asam dengan perbandingan 1:2 (v/v) dari larutan pigmen ditambahkan ke dalam larutan klorofil, maka seluruh klorofil a dikonversi menjadi feofitin a. Sifat ketidaklarutan feofitin yang tinggi terhadap sistem campuran metanol dan air menyebabkan agregasi feofitin. Agregat feofitin yang terbentuk ketika penambahan 1000 dan 1250 µL asam asetat mempunyai serapan maksimal pada λ 693 nm, sedangkan agregat feofitin a yang terjadi ketika titrasi 1000 µL asam klorida mempunyai dua serapan di daerah λ 656 dan 697 nm. Serapan optimum agregat feofitin a muncul pada λ 697 nm setelah pengasaman dengan 1250 µL asam klorida (Gambar 5).
Fotoreaksi terhadap agregat feofitin menunjukkan pengaruh yang berbeda pada kedua jenis asam. Agregat yang terbentuk dengan penambahan asam asetat mempunyai stabilitas yang lebih tinggi terhadap iradiasi dibandingkan dengan agregat yang terbentuk dengan penambahan asam klorida (Gambar 5a dan Gambar 5b). Iradiasi agregat feofitin pada lingkungan asam klorida menyebabkan terjadinya pergeseran hipsokromik (Gambar 5c). Pemecahan air serta reaksi asam kuat selama iradiasi mempunyai kemampuan untuk mengganggu agregat dengan cara memutuskan ikatan yang terbentuk pada gugus karbonil C-13 (cincin V), melepaskan interaksi antar fitil serta memecah interaksi sistem–π antar tetrapirol(Oba dkk., 1996; Sasaki dkk., 2003). Reaksi tersebut menyebabkan agregat feofitin kembali menjadi monomer. Peristiwa berubahnya agregat menjadi bentuk monomer dikenal dengan istilah deagregasi (Brody dan Nathanson 1972; Krasnovsky 1972). Pada Gambar 5c, terlihat bahwa fotodeagregasi mulai terjadi pada penyinaran larutan klorofil a yang dititrasi dengan asam klorida 1000 µL selama 2,5 menit. Proses ini terlihat semakin jelas pada Gambar 5d. Ketika populasi agregat (λ= 697 nm) mengalami peluruhan secara cepat, maka serapan di daerah 656 nm (monomer) muncul kembali setelah proses iradiasi berlangsung selama 12,5 menit. Krasnovsky (1972) dan Limantara dan kawan-kawan (2006) menyatakan bahwa karakteristik kerusakan agregat pigmen (deagregasi) ditandai dengan terjadinya proses hipsokromik. Reaksi ini hanya dapat berlangsung jika terdapat oksigen selama penyinaran. Lebih lanjut, Krasnovsky (1972) juga mengungkapkan bahwa fenomena fotodeagregasi ini merupakan proses oksidasi khusus pada feofitin.
Gambar 5. Pola agregasi dan fotodeagregasi feofitin a
pada titrasi asam sebesar 1000 µL asam asetat (a), 1250 µL asam asetat (b), 1000 µL asam klorida (c), 1250 µL asam klorida (d) dalam pelarut metanol. Gambar spektra di atas pita Qy pada Gambar 5(c) menunjukkan proses fotodeagregasi 0 menit (––) dan 2,5 menit (- - -). Pada Gambar 5 (d) fotodeagregasi 0 menit (––), 12,5 menit (– –) dan 30 menit (- - -).
3.5 Produk fotodegradasi
Gambar 2 menampilkan fotoreaksi klorofil dalam pelarut tidak menghasilkan feofitin maupun feoforbid, yang ditandai dengan tidak terdeteksinya serapan di sekitar panjang gelombang 500 nm serta 530 nm yang merupakan ciri khusus terdapatnya kedua senyawa tersebut (Kobayashi dkk., 2006). Produk degradasi klorofil (Gambar 6) diindikasikan dengan munculnya titik isosbestik pada λ 454, 582 dan 686 nm ketika warna larutan pigmen memudar (Merzlyak dkk., 1996; Limantara dkk., 2006). Peningkatan serapan pada λ 454 sampai 582 nm selama fotoreaksi diduga karena adanya serapan dari campuran produk fotodegradasi. Menurut Merzlyak dan kawan-kawan (1996) serta Bonnett dan Martinez (2001), senyawa yang mempunyai serapan di wilayah λ 450 nm sampai 565 nm merupakan ciri khas serapan porfirin, tetrapirol linier, maupun senyawa klorofil cincin terbuka. Krautler (2002) dan Hortensteiner (2006) menjelaskan bahwa senyawa cincin terbuka mempunyai serapan maksimal pada λ 350 sampai 400 nm dalam metanol. Pemecahan cincin klorofil dapat terjadi karena penyerangan terhadap atom C-5, C-10 atau C-20 klorofil oleh spesies radikal oksigen yang terbentuk selama reaksi fotokimia (Derosa dan Crutchley, 2002; Hortensteiner, 2006; Zvezdanovic dan Markovic, 2008).
Iradiasi larutan pigmen pada lingkungan asam menghasilkan lebih banyak produk fotokimia jika dibandingkan dengan tanpa perlakuan asam. Perbandingan selisih spektra antara Gambar 6 dan Gambar 7 menunjukkan sebagian produk degradasi klorofil a (yang mempunyai serapan pada λ 300 sampai 400 nm) akibat iradiasi pada kondisi asam, tidak diproduksi pada iradiasi tanpa penambahan asam. Senyawa monopirol dan dipirol merupakan dua produk degradasi yang banyak dipostulatkan sebagai hasil proses fotooksidasi (Jen dan Mackinney, 1970; Bonnett dan Martinez, 2001). Karakteristik senyawa-senyawa tersebut mempunyai serapan di daerah UV dengan λmaks
240–320 nm (Bonnett dan Martinez, 2001). Selanjutnya, Gambar 7 mengekspresikan bahwa jenis pelarut serta asam juga berperan dalam menghasilkan jenis produk degradasi. Produk degradasi yang dihasilkan selama iradiasi larutan klorofil a dalam asam berurutan sebagai berikut, asidifikasi klorofil a dengan (dalam pelarut): asam klorida (metanol) > asam klorida (aseton) > asam asetat (metanol) > asam asetat (aseton).
Absosba nsi (A. U ) Panjang gelombang (nm) Absosba nsi (A. U ) Panjang gelombang (nm) (a) (b) Absosba nsi (A. U ) Panjang gelombang (nm) Absosba nsi (A. U ) Panjang gelombang (nm) (c) (d)
Gambar 6. Perbedaan absorbansi klorofil a setelah
penyinaran (2,5 sampai 30 menit) dikurangi dengan sebelum penyinaran dalam pelarut aseton (a) dan metanol (b).
Gambar 7. Selisih absorbansi spekrum klorofil a
sebelum dan setelah asidifikasi dan iradiasi 30 menit. Spektrum klorofil a dalam aseton pada penambahan berbagai volume asam asetat (a) dan asam klorida (b); Klorofil a dalam metanol pada penambahan berbagai volume asam asetat (c) dan asam klorida (d). Volume asam: 50 µL (– – –), 100 µL (• • •), 250 µL (― • ―), 500 µL (― • •―), 750 µL (- - -), 1000 µL (····), dan 1250 µL (– · –).
4. Kesimpulan
Pemberian asam asetat dan asam klorida mempercepat proses fotodegradasi klorofil a serta membentuk feofitin dan produk-produk degradasi lainnya. Selain jenis asam, kecepatan fotodekomposisi klorofil a ditentukan oleh adanya ikatan aksial ligan dan sifat kepolaran antara klorofil a dengan pelarut. Hilangnya ikatan aksial ligan pada feofitin selama pengasaman berdampak terhadap fotostabilitasnya. Titrasi asam klorida dengan volume >750 µL tidak hanya menyebabkan klorofil a mengalami feofitinisasi secara cepat, namun juga mampu memecahkan ikatan agregat feofitin dalam pelarut metanol menjadi monomernya.
Ucapan Terima kasih
Aji Wahyu Budiyanto mengucapkan terima kasih kepada Depdiknas atas dukungan Beasiswa Unggulan. Panjang gelombang (nm) Perbe da an Absosba nsi (A.U ) (a) Panjang gelombang (nm) Pe rbe da an Absosba nsi (A.U ) (b) Panjang gelombang (nm) Pe rbe da an Absosba nsi (A.U ) Panjang gelombang (nm) Pe rbe da an Absosba nsi (A.U ) (a) (b) (c) (d) Panjang gelombang (nm) Pe rbed aan Abs os bans i ( A.U ) Panjang gelombang (nm) Pe rbe da an Absosba nsi (A.U )
Daftar Pustaka
Agostiano, A., L. Catucci, P. Cosma, and P. Fini, 2003, Aggregation Processes and Photophysical Properties of Chlorophyll a in Aqueous Solution Modulated by Presence of Cyclodextrins, J. Phys. Chem., 5, 2122-2128. Agostinis, P., E. Buytaert, H. Breyssens, and N.
Hendrick, 2004, Regulatory Pathways in Photodynamic Therapy Induced Apoptosis, Photochem. Photobiol. Sci., 3, 721-729. Banister, T. T., 1959, Photoreduction of Chlorophyll a
in the Presence of Ascorbic Acid in Pyridine Solutions, Plant Physiol., 246-254.
Baugher, J., J. C. Hindman, and J. J. Katz, 1979, Determination of Triplet and Exited Singlet Absorption Spectra of Chlorophyll a with a Tunable Dye Laser, Chem. Phys. Lett., 63:1, 159-162.
Bonnett, R. and G. Martinez, 2001, Photobleaching of Sensitizers Used in Photodynamic Therapy, Tetrahedron, 57, 9313-9547.
Borg, D. C., J. Fajer, R. H. Felton, and D. Dolphin, 1970, The π-Cation Radical of Chlorophyll a, Proc. Nat. Acad. Sci., 67:2, 813-820.
Brandis, A. S., Salomon, Y., and A. Scherz, Bacteriochlorophyll Sensitizers in Photo-dynamic Therapy, in B. Grimm, J. Porra, W. Rudiger, and H. Scheer, (Eds.), 2006, Chlorophylls and Bacteriochlorophylls, Bio-chemistry, Biophysics, Functions and Appli-cations, Advances in Photosynthesis and Respiration, Springer, Dordrecht, 485-494. Breedveld, P., D. Pluim, G. Cipriani, F. Dahlhaus, M.
A. J. van Eijndhoven, C. J. F. de Wolf, A. Kuil, J. H. Beijnen, G. L. Scheffer, G. Jansen, P. Borst, and J. H. M. Schellens, 2007, The Effect of Low pH on Breast Cancer Resistance Protein (ABCG2)-Mediated Transport of Methotrexate, 7-Hydroxymethotrexate, Metho trexate Diglutamate, Folic Acid, Mitoxan-trone, Topotecan, and Resveratrol in in vitro Drug Transport Models, Mol. Pharmacol.,
71:1, 240-249.
Brereton, R. G. and J. K. M. Sanders, 1983, Bacteriochlorophyll a, Influence of Axial Coordination on Reactivity and Stability, Design of an Improved Extraction Procedure. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 431-434. Britton, G., S. Liaaen-jensen, and H. Pfander, 1995,
Carotenoids: Isolation and Analysis, 1 A, Birkhauser Verlag, Boston.
Brody, M. and B. Nathanson, 1972, Direct and Indirect Mechanisms of Deaggregation by Fatty Acids in Chlorophyll-Containing System, Biophys. J., 12, 774-790.
Chen, B. H. and J. H. Huang, 1998, Degradation and Isomerization of Chlorophyll a and β-Carotene as Affected by Various Heating and Illumination Treatments, Food Chem., 62:3, 299-307.
De Paula, J. C., J. H. Robblee, and R. F. Pasternak, 1995, Aggregation of Chlorophyll a Probed by Resonance Light Scattering Spectroscopy, Biophys. J., 68, 335-341.
Derosa, M. C. and R. J. Crutchley, 2002, Photo-sensitized Singlet Oxygen and Its Application, Coord. Chem. Rev., 233, 351-371.
Fiedor, J., L. Fiedor, N. Kammhuber, A. Scherz, and H. Scheer, 2002, Photodynamics of the Bacteriochlorophyll–Carotenoid System. 2. Influence of Central Metal, Solvent and β-Carotene on Photobleaching of Bacterio-chlorophyll Derivatives, J. Photochem. Photobiol., 76:2, 145-152.
Frank, H. A., A. J. Young, G. Britton, and R. J. Cogdell, 1999, The Photochemistry of Carotenoids, Vol. 8, Kluwer Academic Publ., Dordrecht.
Gaur, S., U. S. Shivhare, and J. Ahmed, 2006, Degradation of Chlorophyll during processing of green Vegetables, a Review, Stewart Postharvest Rev., 2:5, 1-8..
Gross, J., 1991, Pigment in Vegetables and Fruits, Chlorophyll and Carotenoids, Van Nostrand Reinhold, New York.
Hortensteiner, S., 2006, Chlorophyll Degradation During Senescence, Ann. Rev. Plant Biol., 57, 55-77.
Jeffrey, S. W., R. F. C. Mantoura, and S. W. Wright, 1997, Phytoplankton Pigments in Oceano-graphy, Guidelines to Modern Method, UNESCO Publ., Paris.
Jen, J. J. and G. MacKinney, 1970, On The Decomposition of Chlorophyll in vitro-II. Intermediates and Breakdown Products, J. Photochem. Photobiol., 11, 303-308.
Kakitani, Y., R. S. Rondonuwu, T. Mizoguchi, , Y. Watanabe, and Y. Koyama, 2003, Energy Dissipation from The Qy State Following Singlet-singlet and Triplet-triplet Annihilation Reaction in The Cylindrical Aggregate and Its Reversible Dissosiation into The Piggy-Back Dimers, J. Phys. Chem. B, 107 , 14545-14555. Kanzaki, M., T. Yuzawa, H. Hiura, and H. Takahashi,
1990, Time-Resolved Resonance Raman Spectra of Chlorophyll a in The Lowest Excited Triplet state, Effect of The State of Coordination, Chem. Phys. Lett., 169:1, 85-88.
Katz, J. J., L. L. Shipman, T. M. Cotton, and T. R. Janson, 1978, Chlorophyll Aggregation
Coordination Interactions in Chlorophyll Monomers, Dimers, and Oligomers, the Porphyrins 5, Physical Chemistry, Part C. Academic Press, New York.
Katz, J. J., M. K. Bowman, T. J. Michalski, and D. L. Worcester, 1991, Chorophyll Aggregation, Chlorophyll/Water Micelles as Models For in vivo Long-Wavelength Chlorohyll, Chloro-phylls, CRC Press, London.
Kobayashi, M., M. Akiyama, H. Kano, and H. Kise, Spectroscopy and Structure Determination, in B. Grimm, J. Porra, W. Rudiger, and H. Scheer, (Eds.), 2006, Chlorophylls and Bacteriochlorophylls, Biochemistry, Biophy-sics, Functions and Applications, Advances in Photosynthesis and Respiration, Springer, Dordrecht, 79-94.
Koyama, Y., L. Limantara, E. Nishizawa, Y. Misono, and K. Itoh, 1995, Presence of Penta- and Hexa-Coordinated State in T1 and Cation-Radical Bacteriochlorophyll a, and Generation of Cation Radical by Photo-Excitation of the Aggregated Forms as Revealed by Transient Raman and Transient Absorption Spectroscopies, (proceeding), 7th International Conference on Time-Resolved Vibrational Spectroscopy, New Mexico.
Krasnovsky, A. A., 1972, The Fragment of the Photosynthetic Electron Transfer Chain in Model Systems, Biophys. J., 12 , 749-763. Krautler, B., 2002, Unravelling Chlorophyll Catabolism
in Higher Plants, Biochem. Soc. Trans., 30,
625-530.
Limantara, L., R. Fujii, J-P. Zhang, T. Kakuno, H. Hara, A. Kawamori, T. Yagura, R. J. Cogdell, and Y. Koyama, 1998, Generation of Triplet and Cation Radical Bacteriochlorophyll a in Carotenoidless LH1 and LH2 Antenna Complexes from Rhodobacter sphaeroides. Biochem., 37, 17469-17486.
Limantara, L., P. Koehler, B. Wilhelm, R. J. Porra, and H. Scheer, 2006, Photostability of Bacteriochlorophyll a and Derivatives, Potential Sensitizer for Photodynamic Therapy, J. Photochem. Photobiol., 82, 770-780.
MacDonald, I. J. and T. J. Dougherty, 2001, Basic Principles of Photodynamic Therapy, J. Porphyr. Pthaloc., 5, 105-129.
Maestrin, A. P. J., A. O. Riberio, A. C. Tedeso, C. R. Neri, F. Vinhado, O. A. Serra, P. R. Martins, Y. Iamamoto, A. M. G. Silva, A. C. Tome, M. Neves, and J. A. S. Cavaleiro, 2004, A Novel Chlorin Derivative of Meso-Tris(Pentaflu-orophenyl)-4-Pyridylporphyrin, Synthesis,
Photophysics and Photochemical Properties, J. Braz. Chem. Soc., 15:6, 923-930.
Marsh, K. L. and J. S. Connoly, 1984, Effects of Solvent on the Rate of Bacteriochlorophyll a Photo-Oxidation, J. Photochem., 25, 183-195. Merzlyak, M. N., S. I. Pogosyan, L. Lekhimena, T. V.
Zhigalova, I. F. Khozina, Z. Cohen, and S. S. Khrushchev, 1996, Spectral Characterization of Photooxidation Products Formed in Chlorophyll Solutions and upon Photodamage to the Cyanobacterium Anabaena variabilis, J. Plant Physiol., 43:2, 186-195.
Nishizawa, E-I. and Y. Koyama, 1991, A Coordination-Marker Raman Line of Bacteriochlorophyll a in The T1 State, Chem. Phys. Lett., 176:3,
390-394.
Nishizawa, E-I., H. Nagae, Y. Koyama, 1994, Transient Absorption Spectroscopy of Bacterioklorofill a, Cation Radical Generated in Solvent Forming Aggregates and T1 Species Generated
in Solvents Forming Penta- and Hexa-coordinated Monomers with and without Hydrogen Bonding, J. Phys. Chem., 98:46, 12086-12090 .
Oba, T., T. Watanabe, M. Mimuro, M. Kobayashi, and S. Yoshida, 1996, Aggregation of Chlorophyll a in Aqueous Methanol, J. Photochem. Photobiol., 63:5, 639-648.
Riberio, J. N., A. R. da Silva, and R. A. Jorge, 2004, Investment of Mitochondria in Apoptosis of Cancer Cells Induced by Photodynamic Therapy, J. Bras. Patol. Med Lab, 40, 383-390.
Sasaki, S., M. Omoda, and H. Tamiaki, 2003, Effects of C-8 Substituents on Spectroscopic and Self-aggregation Properties of Synthetic Bacteriochlorophyll d Analogues, J. Photochem. Photobiol. A, 162, 307-315. Schaber, P. M., J. E. Hunt, R. Fries, and J. J. Katz,
1984, High-Performance Liquid Chroma-tographic Study of the Chlorophyll Allomerization Reaction, J. Chromatogr., 316, 25-41.
Scheer, H., 2006, An Overview of Chlorophylls and Bachteriochlorophylls, Biochemistry, Biophy-sics, Functions and Applications, in B. Grimm, J. Porra, W. Rudiger, and H. Scheer, (Eds.), 2006, Chlorophylls and Bacteri-ochlorophylls, Biochemistry, Biophysics, Functions and Applications, Advances in Photosynthesis and Respiration, Springer, Dordrecht, 485-494.
Scherz, A., V. Rosenbach-Belkin, T. J. Michalski, and D. L. Worcester, Chlorophyll Aggregates in Aqueous Solutions, in Scheer, H. (Ed.), 1991,
Chlorophyll, CRC-Press, Boca Raton, 237-268.
Shepanski, J. F. and R. W. Anderson, 1981, Chlorophyll a Singlet State Absorption Measured in the Picosecond Time Regime, Chem. Phys. Lett., 78:1, 165-173.
Zvezdanovic, J. and D. Markovic, 2008, Bleaching of Chlorophyll by UV Irradiation in vitro, The Effects on Chlorophyll Organization in Acetone and n-Hexane, J. Serb. Chem. Soc.,
