KEMUKUS (Piper cubeba L.) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP SEL VEGETATIF DAN SPORA Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis.

(1)

KEMUKUS (Piper cubeba L.) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP SEL VEGETATIF DAN SPORA Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis

SKRIPSI

diajukan untuk memenuhi sebagian syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program

Studi Biologi Departemen Pendidikan Biologi

oleh:

Hestiarahma Purnamasari

NIM 1101713

PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

KEMUKUS (Piper cubeba L.) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP SEL VEGETATIF DAN SPORA Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu HESTIARAHMA PURNAMASARI

KEMUKUS (Piper cubeba L.) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP SEL VEGETATIF

DAN SPORA Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis

disetujui dan disahkan oleh pembimbing :

Pembimbing I

Hj. Any Fitriani, Dr., M. Si NIP. 196502021991032001

Pembimbing II

R. Kusdianti, Dra., M. Si NIP. 196402261989032004

Mengetahui

Ketua Departemen Pendidikan Biologi

(3)

KEMUKUS (Piper cubeba L.) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP SEL

VEGETATIF DAN SPORA Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis

Oleh

Hestiarahma Purnamasari

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi sebagian syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains Program Studi Biologi Departemen Pendidikan Biologi Fakultas Pendidikan

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Pendidikan Indonesia

Agustus 2015

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhnya atau sebagian, dengan dicetak ulang,

(4)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Kemukus (Piper cubeba

L.) sebagai Antibakteri Terhadap Sel Vegetatif dan Spora Bacillus cereus dan Bacillus

subtilis” ini beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya saya sendiri. Saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika

ilmu yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini, saya siap menanggung

resiko/sanksi apabila di kemudian hari ditemukan adanya pelanggaran etika keilmuan atau

(5)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

ABSTRAK

Bakteri pembentuk spora seperti Bacillus cereus dan Bacillus subtilis seringkali ditemukan pada makanan dan menyebabkan pembusukan makanan. Saat ini pengawet buatan sudah biasa digunakan untuk mencegah pembusukan makanan tetapi kemudian diketahui bahwa bahan-bahan pengawet tersebut berbahaya bagi tubuh jika digunakan secara berlebihan. Bahan alami seperti rempah dapat menjadi alternatif untuk mencegah pembusukan makanan berdasarkan aktivitas antibakteri yang dimilikinya. Kemukus (Piper cubeba L.) merupakan tanaman asli Indonesia yang dijadikan sebagai bumbu dalam masakan, selain itu kemukus memiliki manfaat lain dalam hal kesehatan, antara lain memiliki aktivitas antioksidan dan antimikroba. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengevaluasi aktivitas antibakteri dari kemukus (Piper cubeba L.) terhadap B. cereus ATCC 33019 dan B. subtilis ATCC 6633. Aktivitas antibakteri diuji dengan metode disk

diffusion, minimum inhibitory concentration (MIC) dan minimum bactericidal concentration (MBC). Lebih lanjut, aktivitas antispora ekstrak

pun diujikan pada spora dari kedua bakteri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua species bakteri Bacillus spp. rentan terhadap ekstrak kemukus. Ekstrak mampu menghambat pertumbuhan B. cereus dan B. subtilis dengan nilai MIC sebesar 625 µg/mL. Nilai MBC ekstrak terhadap B. cereus sebesar 625 µg/mL dan >10000 µg/mL untuk B. subtilis. Aktivitas antispora dari ekstrak kemukus diujikan pada B. cereus dan B. subtilis dengan konsentrasi 0%, 1% dan 2% dengan waktu paparan 0 jam dan 1 jam. Hasil uji antispora ekstrak tidak menunjukkan adanya penurunan jumlah spora, hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak kemukus tidak memiliki aktivitas antispora. Secara keseluruhan ekstrak kemukus menunjukkan potensi antibakteri terhadap sel vegetatif B. cereus dan B. subtilis. Oleh karena itu ekstrak kemukus dapat dikembangkan sebagai agen antibakteri terhadap strain-strain

Bacillus terutama B. cereus dan B. subtilis.

(6)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu iv

ABSTRACT

Spore-forming bacteria like Bacillus cereus and B. subtilis are often present in food and cause food spoilage. Today synthetic preservatives usually used to prevent food spoilage but harmful for the body if overused. Natural ingredients like spices can be an alternative way to prevent food spoilage based on its antibacterial contains. Kemukus (Piper cubeba L.) is a native Indonesian’s plant that used as spice for food, in addition kemukus has other benefits in terms of health, such as antioxidant and antimicrobial activity. The aim of this study is to evaluate the antibacterial activity of kemukus against B. cereus ATCC 33019 and B. subtilis ATCC 6633 strains. Antibacterial activity assessed using disk diffusion method, minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). Furthermore, the antisporicidal of the extract has tested against both spores of B. cereus and B. subtilis. Our result showed that kemukus extract was susceptible to both of Bacillus strains. The extract could inhibit the growth of B. cereus dan B. subtilis with MIC values of 625 µg/mL. MBC value of the extract was 625 µg/mL for B. cereus and >10000 µg/mL for B. subtilis. Antispore activity of kemukus extract has been tested against

B. cereus and B. subtilis spores at concentration of 0%, 1% and 2% with

exposure time of 0 hour and 1 hour. Antisporicidal test showed that extract did not show any reduction in the number of spores, it is indicate that the kemukus extract did not have antisporicidal activity. Overall, extract of kemukus shows potential antibacterial activity against B. cereus and B.

subtilis vegetative cells. Hence, the extract can be developed for

antibacterial agents against Bacillus strain.

(7)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ... i

ABSTRAK ... iii

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR LAMPIRAN ... x

BAB I PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang Penelitian ... 1

B. Rumusan Masalah Penelitian ... 3

C. Pertanyaan Penelitian ... 3

D. Batasan Masalah ... 4

E. Tujuan Penelitian ... 4

F. Manfaat Penelitian ... 5

BAB II Kemukus (Piper cubeba L.) sebagai Antibakteri Terhadap Sel Vegetatif dan Spora Bacillus cereus dan Bacillus subtilis .... 6

A. Kemukus ... 6

1. Deskripsi ... 6

2. Kandungan dan Kegunaan ... 7

3. Farmakologi ... 8

B. Mikroorganisme Patogen ... 10

C. Antibakteri ... 11

D. Uji Antibakteri ... 14

1. Metode Disk Diffusion ... 14

2. MIC ... 15

3. MBC ... 16

(8)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu vi

1. Sterilant ... 16

2. Desinfektan dan sanitizers ... 17

3. Antiseptik dan germisida ... 18

F. Antispora ... 20

G. Spora dan Sporulasi ... 21

H. Bakteri Pembentuk Spora ... 27

1. Bacillus ... 27

2. Bacillus cereus ... 29

3. Bacillus subtilis ... 31

BAB III METODE PENELITIAN ... 34

A. Jenis Penelitian ... 34

B. Desain Penelitian ... 34

C. Populasi dan Sampel ... 34

D. Lokasi dan Waktu Penelitian ... 34

E. Instrumen Penelitian ... 35

1. Alat ... 35

2. Bahan ... 36

F. Metode Kerja ... 37

1. Persiapan Medium Pertumbuhan Bakteri ... 37

a) TSA (Tryptic Soy Agar) ... 37

b) NA (Nutrient Agar) ... 37

c) MHA (Mueller Hinton Agar) ... 37

2. Persiapan Kultur B. cereus dan B. subtilis ... 37

3. Ekstraksi Kemukus ... 37

4. Persiapan Spora ... 38

5. Penghitungan Jumlah Spora ... 38

6. Pewarnaan Endospora ... 38

7. Uji Antibakteri ... 39

a) Metode Disk Diffusion ... 39

b) Penentuan MIC ... 39

(9)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

8. Uji Antispora ... 39

9. Analisis Data ... 40

BAB IV TEMUAN DAN PEMBAHASAN ... 41

A. Aktivitas Antibakteri ... 42

1. Disk Diffusion ... 42

2. MIC dan MBC ... 44

B. Aktivitas Antispora ... 48

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 52

A. Kesimpulan ... 52

B. Saran ... 52

Daftar Pustaka ... 53

(10)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu viii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Uji Fitokimia Awal Ekstrak Metanol Kemukus ... 8

Tabel 2.2. Contoh Agen yang Termasuk Sterilant, Desinfektan dan Sanitizer ... 17

Tabel 2.3. Contoh Agen yang Termasuk Antiseptik ... 18

Tabel 2.4. Beberapa Tumbuhan yang Memiliki Aktivitas Antibakteri .. 19

Tabel 2.5. Perbedaan Sel Vegetatif dan Endospora ... 22

Tabel 3.1. Alat Penelitian ... 35

Tabel 3.2. Bahan Penelitian ... 36

Tabel 3.3. Jumlah glutaraldehid dan spora yang digunakan pada masing-masing perlakuan ... 40

Tabel 3.4. Jumlah ekstrak dan spora yang digunakan pada masing-masing perlakuan ... 40

Tabel 4.1. Hasil Uji Disk Diffusion ... 42

Tabel 4.2. MIC dan MBC Ekstrak Kemukus ... 45

Tabel 4.3. Jumlah Spora B. cereus ... 50

(11)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Buah Kemukus ... 7

Gambar 2.2. Aktivitas Bakteriostatik (a); Bakteriosidal (b); Bakteriolotik (c) ... 12

Gambar 2.3. Contoh Eksospora pada Streptomyces coacervatus ... 21

Gambar 2.4. Contoh Endospora pada B. subtilis ... 22

Gambar 2.5. Struktur Endospora ... 23

Gambar 2.6. Siklus Sporulasi yang Khas pada Bakteri Pembentuk Spora 26

Gambar 2.7. B. cereus Spore Stain ... 29

Gambar 2.8. B. subtilis ... 32

Gambar 4.1. Sel vegetatif B. cereus (merah); Spora B. cereus (hijau).. 41

Gambar 4.2. Spora Bacillus subtilis (hijau) ... 41

Gambar 4.3. Disk diffusion pada B. cereus ... 43

Gambar 4.4. Disk diffusion pada B. subtilis ... 43

Gambar 4.5. Hasil Pengujian MIC Terhadap B. cereus ... 44

Gambar 4.6. Hasil Pengujian MIC Terhadap B. subtilis ... 44

Gambar 4.7. Hasil Pengujian MBC Terhadap B. cereus ... 45

Gambar 4.8. Hasil Pengujian MBC Terhadap B. subtilis ... 46

Gambar 4.9. Koloni Spora B. cereus yang Tumbuh pada Waktu Inkubasi 0 jam ... 48

Gambar 4.10. Koloni Spora B. cereus yang Tumbuh pada Waktu Inkubasi 1 jam ... 49

Gambar 4.11. Koloni Spora B. subtilis yang Tumbuh pada Waktu Inkubasi 0 jam ... 49

(12)

KEMUKUS (Piper cubeba L.) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP SEL VEGETATIF DAN SPORA Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu x

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ekstraksi Kemukus ... 63 Lampiran 2. Data Uji Disk Diffusion ... 63 Lampiran 3. Data Koloni Spora Tumbuh pada Pengujian Antispora Ekstrak

Kemukus ... 63 Lampiran 4. Pengolahan Data Uji Disk Diffusion pada B. cereus ... 64 Lampiran 5. Pengolahan Data Uji Disk Diffusion pada B. subtilis ... 66 Lampiran 6. Uji Perbandingan Rata-rata (Uji T) Hasil Disk Diffusion

B. cereus dan B. subtilis ... 68 Lampiran 7. Pengolahan Data Uji Antispora Ekstrak Kemukus 1% dan 10% Terhadap Spora B. cereus ... 70 Lampiran 8. Pengolahan Data Uji Antispora Ekstrak Kemukus 1% dan 10% Terhadap Spora B. subtilis ... 73 Lampiran 9. Pengolahan Data Uji Antispora Glutaraldehid Terhadap

Spora B. cereus ... 76 Lampiran 10. Pengolahan Data Uji Antispora Glutaraldehid Terhadap

(13)

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Penelitian

Makanan merupakan kebutuhan pokok bagi manusia. Manusia membutuhkan

nutrisi yang bersumber dari makanan agar tubuh tetap sehat dan bugar sehingga

dapat menjalankan aktivitas dengan maksimal. Aktivitas manusia yang tinggi

tentu akan banyak menyita waktu, menuntut untuk melakukan segala sesuatu

seefisien mungkin, tak terkecuali dalam hal makanan. Dengan demikian saat ini

banyak makanan yang diolah dengan cara-cara tertentu agar dapat dimasak dan

dikonsumsi secara instan serta mampu bertahan dalam waktu relatif lebih lama,

seperti makanan dibuat kering atau diberi pengawet.

Teknik pengeringan atau pemberian pengawet pada makanan bertujuan untuk

menjadikan makanan tidak mudah basi. Makanan basi dapat disebabkan oleh

kombinasi dari berbagai macam faktor seperti cahaya, oksigen, panas,

kelembaban dan/atau mikroorganisme (EUFIC, 2015). Mikroorganisme yang

menyebabkan masalah pada makanan dan berperan dalam penyakit yang

ditularkan melalui makanan termasuk ke dalam mikroorganisme patogen.

Mikroorganisme ini tumbuh baik pada suhu ruangan (15-32⁰C) dan sebagian

besar tidak mampu tumbuh pada suhu di lemari pendingin. Berbagai macam

bakteri, ragi dan jamur dapat tumbuh baik pada suhu ruangan serendah-rendahnya

4⁰C. Saat terdapat mikroorganisme pembusuk pada makanan, penampilan serta

aroma dari makanan tersebut biasanya akan menjadi buruk (UNL Food, 2014).

Mikroorganisme yang mengontaminasi makanan akan turut masuk ke dalam

tubuh dan seringkali menimbulkan gejala-gejala seperti mual, muntah, kram perut

dan diare. Lima mikroorganisme patogen yang diketahui sangat erat kaitannya

dengan penyakit yang ditularkan melalui makanan adalah Norovirus, Salmonella,

Clostridium perfringens, Campylobacter spp. dan Staphylococcus aureus (CDC,

2014). Keamanan pangan membutuhkan pemantauan konstan untuk memastikan

(14)

2

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Anggapan bahwa mikroorganisme dalam makanan akan mati setelah makanan

tersebut melalui proses pemasakan tidak selamanya benar, karena masih terdapat

suatu kemungkinan bagi mikroorganisme tersebut untuk bertahan, seperti

membentuk spora pada bakteri. Bakteri pembentuk spora seringkali berada dalam

makanan, karena lebih tahan terhadap pemberian perlakuan antimikroba secara

fisik dan kimiawi (Rukayadi et al., 2009). Menurut Malakar (Rukayadi et al.,

2009) beberapa bakteri pembentuk spora seperti Bacillus dan Clostridium

berasosiasi dengan pembusukan makanan dan penularan penyakit yang

melibatkan makanan. Dua species dalam Genus Bacillus yaitu Bacillus cereus dan

Bacillus subtilis banyak mengontaminasi makanan. B. cereus terlibat dalam

penyakit yang disebarkan melalui makanan karena sporanya mampu bertahan

dalam prosedur pemasakan, selain itu bakteri ini menghasilkan racun selama

sporulasi yang merupakan penyebab dari keracunan makanan (Drobniewski,

1993; Rahimifard et al., 2007 dalam Dabiri & Karbasizade, 2014). Keterlibatan B.

subtilis dalam penyakit yang disebarkan melalui makanan ialah bakteri ini

memproduksi amilosin–suatu racun tahan panas, sehingga meskipun telah melalui

proses pemasakan racun ini akan tetap berada dalam makanan dan menjadi salah

satu penyebab timbulnya penyakit (Apetroaie-Constantin et al., 2008).

Terkait pengawetan makanan, seringkali produsen menambahkan bahan kimia

sintetis agar makanan tidak cepat basi. Namun belakangan diketahui bahwa

bahan-bahan tersebut bersifat racun bagi tubuh jika dikonsumsi berlebihan dalam

jangka waktu panjang. Untuk itu alangkah lebih baik jika pengawet berbahan

dasar alami sehingga tidak menimbulkan efek samping bagi tubuh, aman, namun

tidak mengubah rasa makanan. Penggunaan bahan-bahan alami yang digunakan

sebagai pengawet didasarkan pada kandungan senyawa yang memiliki aktivitas

antibakteri atau antioksidan. Senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas

antibakteri atau antioksidan tersebut antara lain, minyak atsiri, asam organik,

enzim dan fitoaleksin (Meyer et al., 2002).

Tanaman rempah merupakan kelompok tanaman yang penggunaannya cukup

tinggi dalam bidang pangan, khususnya Indonesia. Rempah ini digunakan sebagai

bumbu pada makanan. Makanan khas Indonesia tidak dapat dipisahkan dengan

(15)

makanan. Rempah-rempah dapat dijadikan suatu alternatif dalam upaya

pengawetan makanan terkait sifat-sifat antimikroba yang dikandungnya. Kemukus

(Piper cubeba L.) merupakan tanaman asli Indonesia yang dijadikan sebagai

bumbu dalam masakan. Buah dan minyak atsiri dari tanaman ini banyak

digunakan. Dalam hal makanan, kemukus berperan sebagai perasa khususnya

pada kari, selain itu kemukus memiliki manfaat lain dalam hal kesehatan, antara

lain memiliki aktivitas antioksidan dan antimikroba (Lim, 2012). Kemukus yang

digunakan sebagai bumbu rempah dalam masakan diketahui memiliki aktivitas

antimikroba. Aktivitas antimikroba tersebut perlu diujikan terhadap bakteri

penyebab basi makanan, antara lain B. cereus dan B. subtilis sebagai studi awal

untuk pengembangan potensi penggunaan kemukus sebagai pengawet makanan

alami. Berdasarkan hal tersebut telah dilakukan penelitian untuk menguji aktivitas

antibakteri kemukus terhadap sel vegetatif dan spora dari B. cereus dan B.

subtilis.

B. Rumusan Masalah Penelitian

Berdasarkan latar belakang masalah di atas maka rumusan masalah pada

penelitian yang akan dilakukan adalah Bagaimana aktivitas antibakteri kemukus

terhadap sel vegetatif dan spora dari B. cereus dan B. subtilis?

C. Pertanyaan Penelitian

1. Apakah kemukus memiliki aktivitas antibakteri terhadap sel vegetatif

dari B. cereus dan B. subtilis?

2. Berapa besar zona hambat dari ekstrak kemukus terhadap B. cereus dan B.

subtilis pada konsentrasi yang berbeda?

3. Berapa konsentrasi minimum ekstrak kemukus yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri B. cereus dan B. subtilis?

4. Berapa konsentrasi minimum ekstrak kemukus yang dapat membunuh bakteri

B. cereus dan B. subtilis?

5. Apakah kemukus memiliki aktivitas antibakteri terhadap spora dari B. cereus

(16)

4

Hestiarahma Purnamasari, 2015

6. Berapakah konsentrasi optimum ekstrak kemukus yang dapat mereduksi

jumlah spora bakteri B. cereus dan B. subtilis?

7. Berapakah waktu inkubasi optimum ekstrak kemukus yang dapat mereduksi

jumlah spora bakteri B. cereus dan B. subtilis?

D. Batasan Masalah

1. Bagian tanaman kemukus yang digunakan yaitu buahnya.

2. Kemukus yang diujikan merupakan ekstrak kasar dengan pelarut metanol.

3. Bakteri yang dijadikan bakteri uji yaitu B. cereus ATCC 33019 dan B. subtilis

ATCC 6633.

4. Parameter yang diukur pada penelitian ini adalah :

a) Diameter zona hambat ekstrak kemukus terhadap B. cereus dan B. subtilis.

b) Nilai MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dari ekstrak kemukus

terhadap B. cereus dan B. subtilis.

c) Nilai MBC (Minimum Bactericidal Concentration) dari ekstrak kemukus

terhadap B. cereus dan B. subtilis.

d) Jumlah spora bakteri B. cereus dan B. subtilis sebelum dan sesudah pemberian

perlakuan konsentrasi dan waktu inkubasi.

E. Tujuan Penelitian

1. Mengevaluasi aktivitas antibakteri ekstrak kemukus terhadap sel vegetatif dari

B. cereus dan B. subtilis.

2. Menentukan konsentrasi minimum ekstrak kemukus yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri B. cereus dan B. subtilis.

3. Menentukan konsentrasi minimum ekstrak kemukus yang dapat membunuh

bakteri B. cereus dan B. subtilis.

4. Mengevaluasi aktivitas antibakteri terhadap spora dari B. cereus dan B.

subtilis.

5. Menentukan konsentrasi optimum ekstrak kemukus yang dapat mereduksi

jumlah spora bakteri B. cereus dan B. subtilis.

6. Menentukan waktu inkubasi optimum ekstrak kemukus yang dapat mereduksi

(17)

F. Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi mengenai aktivitas antibakteri pada ekstrak kemukus

terhadap bakteri penyebab keracunan makanan, diantaranya B. cereus dan B.

subtilis.

2. Memberikan sumbangan ilmu pengetahuan dalam bidang mikrobiologi dan

kesehatan serta pangan.

3. Menambah potensi penggunaan kemukus di bidang kesehatan, yaitu sebagai

pengawet makanan alami.

4. Adanya solusi alternatif mengenai penggunaan pengawet pada makanan yang

lebih aman.

5. Membuka peluang diproduksinya pengawet berbahan alami, salah satunya

dari kemukus.

6. Sumber informasi baru di bidang penelitian dan memberikan dorongan atau

(18)

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 34

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan termasuk ke dalam jenis penelitan

eksperimental dengan memberikan perlakuan konsentrasi dan waktu inkubasi

yang berbeda-beda.

B. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL)

karena penelitian dilakukan di laboratorium dan kondisi yang homogen. Pada

pengujian aktifitas antispora digunakan konsentrasi ekstrak kemukus sebesar 0%,

1% dan 2% terhadap spora B. cereus dan B. subtilis. Pada pengujian disk-diffusion

digunakan konsentrasi 1% dan 10%, dengan chlorhexidine merupakan kontrol

positif serta DMSO 10% merupakan kontrol negatif. Digunakan pula konsentrasi

yang berbeda pada saat MIC dan MBC dengan konsentrasi pengujian berdasarkan

teknik pengenceran, yaitu 10000 µg/mL, 5000 µg/mL, 2500 µg/mL, 1250 µg/mL,

625 µg/mL, 312,5 µg/mL, 156,25 µg/mL, 78,1 µg/mL, 39 µg/mL dan 19,5

µg/mL. Setiap konsentrasi pengujian terdapat pengulangan, termasuk diantaranya

kontrol positif dan kontrol negatif. Pada pengujian MIC dan MBC terdapat

kontrol positif yang hanya terdiri dari medium sebanyak 200 µL dan kontrol

negatif yang hanya terdiri dari inokulum sebanyak 200 µL.

C. Populasi dan Sampel

Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman kemukus,

sedangkan sampel dari penelitian ini adalah bagian buah dari tanaman kemukus.

D. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dimulai dari tanggal 01 April 2015 sampai dengan tanggal 28 April

2015 yang dilaksanakan di Institute of Biosains (IBS), Universiti Putra Malaysia

(19)

E. Instrumen Penelitian 1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut:

Tabel 3.1. Alat Penelitian

No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah

1 Botol laboratorium Fisherbrand 500 mL Schott Duran 500 mL

2 buah 2 buah

2 Timbangan Sartorius 1 buah

3 Autoclave Tomy SX500 1 buah

4 Spatula - 2 buah

5 Cawan petri disposable Brandon 100 buah

6 Laminar ESCO EQU/04-EBC-2A 1 buah

7 Lup - 5 buah

8 Bunsen Fireboy 1 buah

9 Kaca objek - 4 buah

10 Marker Snowman 1 buah

11 Cotton bud - 1 bungkus

12 Pinset - 1 buah

13 Pipet mikro Eppendorf 4 buah

14 Tips Biru, kuning, putih Secukupnya

15 Tabung mikro 1,5 mL

2 mL Secukupnya

16 Vortex Stuart 1 buah

17 Scale zone HiAntibiotic Scale zone 1 buah

18 Kamera digital Canon IXUS 1 buah

19 Universal bottle - 2 buah

20 Microtitter Cellstar 2 buah

21 Tabung sentrifugal - 8 buah

22 Inkubator Memmert IN55 1 buah

23 Destilator Arium 611DI 1 buah

24 Lemari pendingin Berjaya 1 buah

25 Rotary vacuum evaporator Buchi Rotavapor R-3 1 buah

26 Penangas air - 1 buah

27 Alat sentrifugasi Sigma 1-14 1 buah

28 Labu erlenmeyer - 1 buah

29 Corong kaca - 1 buah

30 Labu ekstraksi Pyrex 1 buah

31 Oven - 1 buah

32 Gelas kimia Pyrex 1 buah

33 Incubator+shaker Wisecube 1 buah

34 Penjepit kaca objek - 1 buah

(20)

36

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut:

Tabel 3.2. Bahan Penelitian

No. Nama Bahan Spesifikasi Jumlah

1 Tryptic Soy Broth

Difco, Becton, Dickinson and Company, Spark,

MD, USA

15 g

2 Agar Merck, Darmstadt,

Germany 16,8

3 Alumunium foil My Chef Secukupnya

4 Sarung tangan Vandaier 2 pasang

5 Parafilm “M” Secukupnya

6 Akuades - 3 L

7 Nutrient Broth

MD, USA

4 g

8 Mueller Hinton Broth

MD, USA

4,2 g

9 Stok B. cereus ATCC 33019 1 cawan petri 10 Stok B. subtilis ATCC 6633 1 cawan petri

11 Kemukus kering - 100 g

12 Metanol 100%

QREC, QREC (Asia) SDN BHD, Selangor, Malaysia

500 mL

13 Natrium klorida

R&M Chemicals, R&M Marketing,

Essex, U. K.

7,6 g

14 Kertas cakram Whatman No. 1;

d=6 mm Secukupnya

15 Chlorhexidine - 1 mL

16 DMSO - 300 mL

17 Kertas saring Whatman No. 1 Whatman No. 5

1 lembar 1 lembar

18 Malachite green - Secukupnya

19 Safranin - Secukupnya

20 Alkohol 70% Secukupnya

21 Minyak imersi - Secukupnya

22 Kertas hisap - Secukupnya

(21)

F. Metode Kerja

1. Persiapan Medium Pertumbuhan Bakteri a) TSA (Tryptic Soy Agar)

Medium TSA dibuat dengan mencampurkan 15 g TSB (Tryptic Soy Broth), 7

g agar dan 500 mL akuades dalam botol laboratorium. Larutan medium kemudian

dihomogenkan dan disterilisasi menggunakan autoclave selama 90 menit

kemudian dituang ke dalam cawan petri (plating). Medium disimpan dalam lemari

pendingin dengan suhu 6⁰C.

b) NA (Nutrient Agar)

Medium NA dibuat dengan mencampurkan 4 g NB (Nutrient Broth), 7 g agar

dan 500 mL akuades ke dalam botol laboratorium. Larutan medium kemudian

dihomogenkan dan disterilisasi menggunakan autoclave selama 90 menit

kemudian dituang ke dalam cawan petri (plating). Medium disimpan dalam lemari

pendingin dengan suhu 6⁰C.

c) MHA (Mueller Hinton Agar)

Medium dibuat sebanyak 200 mL dengan mencampurkan 4,2 g MHB, 2,8 g

agar dan 200 mL akuades ke dalam botol laboratorium. Larutan medium

kemudian dihomogenkan dan disterilisasi menggunakan autoclave selama 90

menit kemudian dituang ke dalam cawan petri (plating). Medium disimpan dalam

lemari pendingin dengan suhu 6⁰C.

2. Persiapan Kultur B. cereus dan B. subtilis

Stok B. cereus ATCC 33019 dan B. subtilis ATCC 6633 didapatkan dari

Laboratory of Natural Products, Institute of Bioscience (IBS), Universiti Putra

Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malaysia. Satu lup bakteri diambil dari stok

kemudian dipindahkan ke medium TSA. Kultur diinkubasi pada suhu 36⁰C

selama 24 jam untuk keperluan sel vegetatif, sedangkan untuk keperluan spora

inkubasi dilakukan selama 7 hari.

3. Ekstraksi Kemukus

Ekstraksi tanaman dilakukan berdasarkan Rukayadi et al. (2008) dengan

modifikasi. Buah kemukus kering dicacah kecil menggunakan blender kemudian

(22)

38

metanol 100% sebanyak 400 mL. Botol selanjutnya dilapisi dengan alumunium

foil lalu disimpan dalam suhu ruangan selama 5 hari. Ekstrak kemukus kemudian

disaring menggunakan kertas saring dan dipadatkan dengan rotary vacuum

evaporator pada suhu 50⁰C. Selanjutnya ekstrak dilarutkan dengan DMSO 100%

untuk mendapatkan larutan stok dengan konsentrasi 100 mg/mL (10 %).

4. Persiapan Spora

Spora B. cereus dan B. subtilis disiapkan berdasarkan metode yang dijelaskan

sebelumnya oleh Rukayadi et al. (2009) dengan modifikasi. Satu cawan petri

kultur bakteri B. cereus dan B. subtilis masing-masing dilarutkan dengan 10 mL

0,95% NaCl steril dalam tabung sentrifugal. Spora dipanen melalui sentrifugasi

(4500 rpm selama 5 menit) dan tiga kali pencucian menggunakan larutan 0,95%

NaCl steril. Setelah itu suspensi bakteri diinkubasi dalam penangas air dengan

suhu 60⁰C selama 90 menit, dengan melakukan tahapan ini sel-sel vegetatif

bakteri diasumsikan telah mati sehingga hanya spora yang masih bertahan.

Suspensi spora kemudian disimpan dalam freezer sampai akan digunakan.

5. Penghitungan Jumlah Spora

Jumlah spora pada stok yang akan digunakan untuk pengujian dihitung

terlebih dahulu. Stok spora B. cereus dan B. subtilis dibuat serial pengenceran

mulai dari 10-1 sampai 10-9. Pengenceran 10-3 sampai 10-6 kemudian disebar pada

medium NA. Medium diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37⁰C. Setelah 24 jam

koloni yang tumbuh dihitung dan menghasilkan nilai spora awal dari B. cereus

sebanyak 2,14×108 CFU/mL sedangkan untuk B. subtilis sebanyak 1,77×108

CFU/mL.

6. Pewarnaan Endospora

Untuk memastikan bahwa sampel spora dalam tabung benar-benar spora yang

akan diuji, maka dilakukan verifikasi dengan pewarnaan spora. Stok spora B.

cereus dan B. subtilis dibuat sediaan mikroskopis. Sediaan mikroskopis kemudian

ditutup dengan kertas hisap lalu ditetesi malachite green dan dipanaskan diatas

api, jika kertas hisap sudah mengering malachite green kembali ditambahkan, hal

ini dilakukan selama 5 menit. Kertas hisap dibuang lalu sediaan mikroskopis

dicuci dengan dialiri akuades. Safranin diteteskan di atas sediaan kemudian

(23)

menggunakan kertas hisap. Hasil pewarnaan dilihat dibawah mikroskop dengan

bantuan minyak imersi.

7. Uji Antibakteri

a) Metode Disk Diffusion

Metode diadaptasi dari Zainin et al. (2013). Inokulum B. cereus dan B. subtilis

diambil menggunakan cotton bud kemudian disebarkan secara merata. Kertas

cakram (d=6 mm) diletakkan di atas medium yang telah disebar bakteri

sebelumnya. Pada tiap kertas cakram diteteskan masing-masing 10 µL ekstrak

kemukus 1%, 10%, chlorhexidine (CHX) sebagai kontrol positif dan DMSO 10%

sebagai kontrol negatif. Kertas cakram ditunggu kering kemudian cawan petri

ditutup dan diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam, kemudian luas zona

hambat diukur.

b) Penentuan MIC

Metode diadaptasi dari Zainin et al. (2013). Koloni B. cereus dan B. subtilis

diambil menggunakan lup kemudian dilarutkan dalam 1 mL medium MHB dalam

tabung mikro. Larutan kemudian dihomogenkan menggunakan vorteks. Sepuluh

µL larutan bakteri kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 10

mL medium MHB. Larutan bakteri ini akan digunakan pada pengujian MIC

dengan metode two fold dilutions.

c) Penentuan MBC

Metode diadaptasi dari Zainin et al. (2013). Pengujian MBC dilakukan dengan

mensub-kultur suspensi (sebanyak 10 µL) dari sumur mikrotiter pengujian MIC.

Cawan petri kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37⁰C.

8. Uji Antispora

Pengujian antispora dilakukan berdasarkan metode yang telah dipaparkan oleh

Kida et al. (2004) dan Rukayadi et al. (2009) dengan modifikasi. Sebagai kontrol

positif digunakan glutaraldehid 10%. Konsentrasi glutaraldehid dan ekstrak

(24)

40

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Pengujian dilakukan dengan mencampurkan suspensi spora dengan ekstrak

kemukus atau glutaraldehid (Tabel 3.3 dan Tabel 3.4), larutan ini selanjutnya

disebut larutan uji.

Tabel 3.3. Jumlah glutaraldehid dan spora yang digunakan pada masing-masing perlakuan.

Konsentrasi (%) Glutaraldehid (µL) Spora (µL)

0.00 - 1000

1.00 100 900

2.00 200 800

Tabel 3.4. Jumlah ekstrak dan spora yang digunakan pada masing-masing perlakuan.

Konsentrasi (%) Ekstrak (µL) Spora (µL)

0.00 - 1000

1.00 100 900

2.00 200 800

Larutan uji diinkubasi dalam incubator shaker 37⁰C. Pada rentang waktu 0

dan 1 jam 10 µL larutan uji diambil dan diencerkan hingga pengenceran 10-2.

Setiap serial konsentrasi ekstrak kemukus dan glutaraldehid kemudian disebarkan

pada medium NA dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Jumlah koloni

yang tumbuh dihitung dan dibandingkan dengan jumlah spora awal. Jika terdapat

penurunan jumlah spora maka mengindikasikan adanya aktivitas antispora.

9. Analisis Data

Data hasil pengujian diolah secara statistik dengan pengujian normalitas,

homogenitas, Oneway Anova, Kruskal Wallis dan uji T menggunakan software

(25)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Ekstrak buah kemukus memiliki potensi aktivitas antibakteri terhadap sel

vegetatif, hal ini dapat diketahui secara kualitatif dari hasil uji disk diffusion.

Ekstrak kemukus 1% terhadap B. cereus dan B. subtilis menunjukkan luas zona

hambat sebesar 6,83 mm dan 8,30 mm, secara berurutan. Ekstrak kemukus 10%

menunjukkan luas zona hambat sebesar 10,00 mm pada B. cereus, sedangkan

pada B. subtilis sebesar 10,30 mm. Selanjutnya secara kuantitatif, konsentrasi

minimum ekstrak kemukus yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri B.

cereus dan B. subtilis bernilai sama, yaitu 625 µg/mL. Lebih lanjut, konsentrasi

minimum ekstrak kemukus yang dapat membunuh bakteri B. cereus bernilai 625

µg/mL dan B. subtilis bernilai >10000 µg/mL. Sesuai dengan hasil uji kualitatif,

hasil uji kuantitatif pun menunjukkan bahwa kemukus memiliki potensi aktivitas

antibakteri.

Aktivitas antibakteri yang ditunjukkan kemukus masih belum mampu untuk

mencegah perkembangan atau perkecambahan dari spora kedua bakteri. Jumlah

spora tidak mengalami penurunan setelah diberi perlakuan berbagai konsentrasi

ekstrak kemukus dan waktu inkubasi. Secara keseluruhan hasil penelitian ini

mengindikasikan adanya potensi aktivitas antibakteri dari ekstrak buah kemukus

terhadap sel vegetatif kedua species Bacillus yang diujikan. Oleh karena itu

ekstrak kemukus dapat dikembangkan sebagai agen antibakteri terhadap

species-species Bacillus terutama B. cereus dan B. subtilis.

B. Saran

Untuk mengetahui lebih lanjut mengenai aktivitas antispora dari ekstrak

kemukus perlu dilakukan peningkatan konsentrasi ekstrak serta peningkatan lama

(26)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 53

DAFTAR PUSTAKA

Alliance for the Prudent Use of Antibiotics (APUA). (2014). Antibiotic Agent.

[Online]. Diakses dari:

http://www.tufts.edu/med/apua/about_issue/agents.shtml

Alexander, M. (1977). Introduction to Soil Microbiology. New York: John Wiley and Sons, Inc.

Apetroaie-Constantin, C., Mikkola, R., Andersson, M. A., Teplova, V., Suominen, I., Johansson, T., Salkinoja-Salonen, M. (2008). Bacillus subtilis and B. mojavensis strains connected to food poisoning produce the heat stable toxin amylosin. Journal of Applied Microbiology. 106. 1976–1985.

Arora, D. S. & Bhardwaj, S.K. (1997). Antibacterial activity of some medicinal plants. Geo Bios. 24. 127-131.

American Society for Microbiology (ASM). (2005). Manual of Antimicrobial

Susceptibility Testing. [Online]. Diakses dari:

http://www.asm.org/ccLibraryFiles/FILENAME/000000002484/Man ual%20of%20Antimicrobial%20Susceptibility%20Testing.pdf

Bastos, J. K., Carvalho, J. C. T., de Souza, G. H. B., Pedrazzi, A. H. P., Sarti, S. J. (2001). Anti-inflammatory activity of cubebin, a lignan from the leaves of Zanthoxyllum naranjillo Griseb. Journal of Ethnopharmacology. 75. 279- 282.

Borsato, M.L.C., Grael, C. F. F., Souza, G. E. P., Lopes, N. P. (2000). Analgesic activity of the lignans from Lychnophora ericoides. Phytochemistry. 55. 809-813.

Bottone, E. J. (2010). Bacillus cereus, a Volatile Human Pathogen. Clinical Microbiology Review. 23 (2). 382-398.

(27)

Centers for Disease Control and Prevention (CDC). (2014). Foodborne Illness,

Foodborne Disease, (sometimes called “Food Poisoning”). [Online].

Diakses dari: http://www.cdc.gov/foodsafety/facts.html

Chitnis, R., Abichandani, M., Nigam, P., Nahar, L., Sarker, S. D. (2007). Antioxidant and antibacterial activity of the extracts of Piper cubeba (Piperaceae). Ars Pharmaceutica. 48 (4). 343-350.

Choi, E. M. & Hwang, J. K. (2005). Effect of some medicinal plants on plasma antioxidant system and lipid levels in rats. Phytotherapy Research. (19). 382-386.

Claus, D. & Berkeley, R.C.W. (1986). Genus Bacillus, In : Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, vol 2 (SNEATH, P.H.A., ed.), Williams and Wilkins, Baltimore : 1105 - 1139.

Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). (1999). M26A: Methods for Determining Bactericidal Activity of Antibacterial Agent; Approved

Guideline. [Online]. Diakses dari:

shop.clsi.org/site/Sample_pdf/M26A_sample.pdf

Cowan, M. M. (1999). Plant Product As Antimicrobial Agent. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS. 12 (4). 564–582.

Cronquist, A. (1988). The Evolution and Classification of Flowering Plants. New York: The New York Botanical Garden.

Dabiri, A. & Karbasizade¸V. (2014). Evaluation of the Sporicidal Activity of Ethanol Extract of Arctium lappa Root against Bacillus cereus. Zahedan Journal of Research in Medical Science. 16 (10). 47-49.

Denton, G. W. (2001). Disinfection, Sterilization and Preservation. Philadelphia: Lippincott Wiliams & Wilkins. [Online]. Diakses dari: https://books.google.co.id/books?id=3fkPJ17_TYC&printsec=frontcover# v=onepage&q&f=false

(28)

55

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Trypanocidal activity of (-)-cubebin derivatives against free amastigote forms of Trypanosoma cruzi. Bioorganic and Medical Chemistry Letters. 15. 303-307.

Driks, A. (1999). Bacillus subtilis Spore Coat. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (1). 1-20.

Drobniewski, F.A. (1993). Bacillus cereus and related species. Clinical Microbiology Reviews. 6 (4). 324-338.

Edberg, S.C. (1991). US EPA human health assessment: Bacillus subtilis. Unpublished, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

Eisai Indonesia, P.T. (1995). Medicinal Herb Index in Indonesia, second ed. Jakarta.

Elfahmi, Ruslan, K. , Batterman, S., Bos, R., Kayser, O. Woerdenbag, H. J., Quax, W. J. (2007). Lignan Profile of Piper cubeba, An Indonesian Medicinal Plant. Biochemical Systematics and Ecology. 35. 397-402.

European Food Information Council (EUFIC). (2015). What causes food

spoilage?. [Online]. Diakses dari:

http://www.eufic.org/page/en/page/faq/faqid/food-spoilage/

Fankhauser, D. B. (2011). Bacillus subtilis. [Online]. Diakses dari: http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Microbiology/Prepared_Slides B_subtilis_spores_2000_P7260024.JPG

Food and Drug Administration (FDA). (2014). BBB - Bacillus cereus and other

Bacillus spp. [Online]. Diakses dari:

http://www.fda.gov/food/foodborneillnesscontaminants/causesofillnessbad bugbook/ucm070492.htm

Fitz-James & Young, P. C. E. (1969). Morphology of Sporulation. G. W. Gould and A. Hurst (ed.) The bacterial spore. Academic Press. New York. 39–72.

(29)

Granum, P. E. (2008). The Thin Line between Microbiological Quality and Safety:

Bacillus spp. [Online]. Diakses dari:

http://www.foodprotection.org/files/2008_european_speaker_presentation S5.pdf

Hatmanti, A. (2000). “Pengenalan Bacillus Spp.”. Oseana. 25, (1), 31-41.

Hudzicki, J. (2013). Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol.

[Online]. Diakses dari:

http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3189 kirby-bauer-disk-diffusion-susceptibility-test-protocol

Hussey, M. A. & Zayaitz, A. (2013). Endospore Stain Protocol. [Online]. Diakses dari: http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory test/3112-endospore-stain-protocol

International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). (1996). Microorganisms in Foods 5: Characteristics of Microbial Pathogens. Kluwer Academic/Plenum Publisher. [Online]. Diakses dari: http://books.google.co.id/books?id=lxycHnaPfCYC&pg=PA20&dq=bacil us+cereus&hl=id&sa=X&ei=3VoIVMycHcu0uASIuYCQBw&ved=0CB Q6AEwAA#v=onepage&q=bacillus%20cereus&f=false.

Janssen, A. M., Chin, N. L. J., Scheffer, J. J. C., Svendsen, A. B. (1986). Screening for antimicrobial activity of some essential oils by the agar overlay technique. Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition. 8. 289-292.

Jasmine, R., Selvakumar. B. N. & Daisy, P. (2011). Investigating The Mechanism of Action of Terpenoids and The Effect of Interfering Substances On An Indian Medicinal Plant Extract Demonstrating Antibacterial Activity. IJPSR . 2 (2). 19-24.

Karthikeyan, J. & Rani, P. (2003). Enzymatic and Non-enzymatic Antioxidant in Selected Piper Species. Indian Journal of Experimental Biology. 41. 135-140.

(30)

57

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Khadre, M. A. & Yousef, A. E. (2001). Sporicidal action of ozone and hydrogen peroxide: a comparative study. International Journal of Food Microbiology. 71. 131–138.

Kida, N. Mochizuki, Y. & Taguchi, F. (2004). An effective iodide formulation for killing Bacillus and Geobacillus spores over a wide temperature range. Journal of Applied Microbiology. 97. 402–409.

Kramer, J. M. & Richard, J. G. (1989). Foodborne Bacterial Pathogens. USA: Marcel Dekker, Inc.

Lau, K. Y & Rukayadi, Y. (2014). Screening of tropical medicinal plants for sporicidal activity. International Food Research Journal. 22 (1). 421-425.

Leuschner, R. (2003). Bacillus. [Online]. Diakses dari: http://www.extranet.elsevier.com/homepage_about/mrwd/fosa/BACILLU S%20Occurrence.pdf

Lim, T. K. (2012). Edible Medicinal And Non-Medicinal Plants: Volume 4, Fruits. Springer Science & Business Media. [Online]. Diakses dari: https://books.google.co.id/books?id=c4KuB3iGmbwC&pg=PA321&dq=pi

per+cubeba&hl=id&sa=X&ei=VTYiVZWHD86iugSm-4HYAg&ved=0CBsQ6AEwAA#v=onepage&q=piper%20cubeba&f=false

Madigan. M. T., Martinko, J. M., Stahl, D. A, Clark, D. P. (2010). Brock Biology of Microorganism. 13th edition. San Francisco: Benjamin Cummings.

Malakar, P.K Barker, G. C., & Peck, M. W. (2004). Modeling the prevalence of Bacillus cereus spores during the production of a cooked chilled vegetable product. Journal of Food Protection. 67. 939-946.

McDonnell, G. & Russell, A. D. (1999). Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS. 12 (1). 147-179.

(31)

Mikkola, R. (2006). Food and Indoor Air Isolated Bacillus Non-Protein Toxins: Stuctures, Physico-Chemical Properties and Mechanisms of Effects on Eukariotic Cells. (Disertasi). Helsinki, Finland.

Muliawan, S. Y. (2007). Bakteri Anaerob yang Erat Kaitannya dengan Problem di

Klinik. [Online]. Diakses dari:

https://books.google.co.id/books?id=HdpLPGyFZx8C&pg=PA9&lpg=PA 9&dq=endotoksin+dan+eksotoksin&source=bl&ots=CDSB5KSBC_&sig=

XaYx8ExfCvxHHjDM5naZX1qcpqg&hl=en&sa=X&ei=PO-YVZOsCoKUuQTGjIJo&ved=0CE0Q6AEwBjgK#v=onepage&q=endoto ksin%20dan%20eksotoksin&f=false

Murthy, J. M. & Rani, P. U. (2009). Biological activity of certain botanical extracts as larvicides against the yellow fever mosquito, Aedes aegypti L. Journal of Biopesticides, 2 (1). 72-76.

Nahak, G. & Sahu R. K. (2011). Phytochemical Evaluation and Antioxidant activity of Piper cubeba and Piper nigrum. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 01 (08). 153-157.

Norris, J. R. Berkeley, R. C. W., Logan, N. A., O'donnell, A. G. (1981). The Genera Bacillus and Sporalactobacillus. In : The Prokaryotes, Vol 2 (Starr, M.P., Stolp, A., Truper, A.G., Balows, A., And Schlegel, H.G., Eds). New York: Springer -Verlag, 1711 - 1742.

OIE-World Organisation of Animal Health. (2012). Laboratory methodologies for bacterial antimicrobial susceptibility testing. [Online]. Diakses dari: http://www.oie.int/fileadmin/Home/fr/Our_scientific_expertise/docs/pdf/ GUIDE_2.1_ANTIMICROBIAL.pdf

Pachpute, A. P. & Deshmukh, T. A. (2013). Antioxidant And Hepatoprotective Activity Of An Ethanol Extract Of Piper cubeba Fruits. International Jiurnal of Research and Development in Pharmacy & Life Science. 2 (2). 321-329.

(32)

59

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Parvez, Md., Gayasuddin, Md., Basheer, Md. & Janakiraman, K. (2010). Screening of Piper cubeba (Linn) Fruits for Anti-ulcer Activity. International Journal of PharmTech Research. 2 (2). 1128-1132.

Pelczar, M. J. & Chan, E. C. S. (2008). Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. (2007). Konservasi Dan Potensi

Pengembangan Kemukus. [Online]. Diakses dari:

http://perkebunan.litbang.pertanian.go.id/?p=941

Purwoko, T. (2007). Fisiologi Mikroba. Jakarta: PT Bumi Aksara

Rahimifard, N., Fatholahzadeh, B., Pirali Hamedani, M., Noory, Z., , Saadati, S. H., Zavar, M., Pirouz, B., Asghari, S. H., Khezripour, M. , Saberi, S. (2007). Bacillus cereus contamination in infant formula: A study in food and drug control laboratory. Tehran University Medical Journal. 65 (8). 64-68.

Rheinheimer. (1980). Aquatic Microbiology. A. Willey Inter Science Publication Chichester: 225 pp.

Rollins, D.M. & Joseph, S.W. (2000). Basic Mechanisms of Antibiotic Action and

Resistance. [Online]. Diakses dari:

http://www.life.umd.edu/classroom/bsci424/Chemotherapy/AntibioticMe hanisms.htm.

Rukayadi, Y., Shim, J. S. & Hwang, J. K. (2008). Screening of Thai medicinal plants for anticandidal activity. Journal Compilation Mycoses. 51 (4). 308-312.

Rukayadi, Y., Lee, K., Han, S., Kim, S., Hwang, J. K. (2009). Antibacterial and Sporicidal Activity of Macelignan Isolated from Nutmeg (Myristica fragrans Houtt.) against Bacillus cereus. Food Science and Biotechnology. 18 (5). 1301-1304.

(33)

Russell, A. D. (1982). The destruction of bacterial spores. [Online]. Diakses dari: https://books.google.co.id/books?hl=en&lr=&id=pRO6QPKuZpcC&oi=fn d&pg=PA451&dq=The+destruction+of+bacterial+spores&ots=Ahjb0jHtO

E&sig=HF0Fd-6dSFF494CXQ9ePnURyTY8&redir_esc=y#v=onepage&q=The%20destru ction%20of%20bacterial%20spores&f=false

Salle, A. J. (1984). Fundamental of Principle of Bacteriology. New Delhi: McGraw Hill Publishing Company 812 pp.

Satroamidjojo. (2001). Obat Asli Indonesia. Jakarta: Dian Rakyat.

Schlegel, H. G & Zaborosch, C. (1993). General Biology. [Online]. Diakses dari: https://books.google.co.id/books?id=DrHQtIbiunkC&printsec=frontcover &dq=basic+microbiology&hl=en&sa=X&ei=M0tcVfy0FJS1uQSmw4Lw BQ&ved=0CCsQ6AEwAw#v=onepage&q=basic%20microbiology&f=fal se

Setlow, B. & Setlow, P. (1996). Role of DNA Repair in Bacillus subtilis Spore Resistance. Journal of Bacteriology. 178 (12). 3486-3495.

Shibazaki A., Omoto, Y., Kudo, T., Yaguchi, T., Saito, A., Ando, A., Mikami, Y., Gonoi, T. (2011). Streptomyces coacervatus sp. nov., isolated from the intestinal tract of Armadillidium vulgare. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 61. 1073–1077.

Silva, M. L. A., Coímbra, H. S., Pereira, A. C., Almeida, V. A., Lima, T. C., Costa, E. S., Vinhólis, A. H. C., Royo, V. A., Silva, R., Filho, A. A. S., Cunha, W. R., Furtado, N. A. J. C., Martins, C. H. G., Carvalho, T. C., Bastos, J. K. (2007). Evaluation of Piper cubeba extract, (-)-cubebin and its semi-synthetic derivatives against oral pathogens. Phytotheraphy Research. 21 (5), 420–422.

Singh, G. S. & Pandeya, S. N. (2011). Natural products in discovery of potential and safer antibacterial agents. Research signpost. 37 (2). 63-101.

(34)

61

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Slepecky, R. A. & Hemphill, H. E. (2006). “The Genus Bacillus Nonmedical”. Prokariot. 4. 530-562.

Stansfield, W. D, Cano, R. J & Colome. J. S. (2006). Biologi Molekuler dan Sel. Jakarta: Erlangga

Tamadher, M. K. Al-Tememy. (2013). Antibacterial Activity Of Piper cubeba Linn. Fruit Extracts Against Selected Bacterial Pathogens In Basrah City. Basrah Journal of Veterinary Research. 12 (1). 142-151.

Tennen, R., Setlow, B., Davis, K.L., Loshon, C.A., Setlow, P. (2000). Mechanisms of killing of spores of Bacillus subtilis by iodine, glutaraldehyde and nitrous acid. Journal of Applied Microbiology. 89. 330-338.

The Global Biodiversity Information Facility: GBIF Backbone Taxonomy. (2013). Firmicutes. [Online]. Diakses dari: http://www.gbif.org/dataset/d7dddbf4-2cf0-4f39-9b2a-bb099caae36c

Tjitrosoepomo, G. (2009). Morfologi Tumbuhan. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Todar, K. (2008). Bacillus cereus Food Poisoning. Online Textbook of

Bacteriology. [Online]. Diakses dari:

http://textbookofbacteriology.net/B.cereus.html

Todar, K. (2008). Bacillus cereus spore stain. Online Textbook of

Bacteriology. [Online]. Diakses dari:

http://textbookofbacteriology.net/B.cereus.html

UNL Food. (2014). How Food Spoils. [Online]. Diakses dari: https://food.unl.edu/safety/spoilage

(35)

U. S. Enviromental Protection Agency. (1997). Bacillus subtilis Final Risk

Assesment. [Online]. Diakses dari:

http://www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra009.htm

Valgas, C., de Souza, S. M., Smânia, E. F. A., Smânia Jr., A. (2007). Screening Methods to Determine Antibacterial Activity Of Natural Products. Brazilian Journal of Microbiology. 38. 369-380.

Vanden Berghe, D. A.& Vlietinck, A. J. (1991). Screening methods for antibacterial and antiviral agents from higher plants. In: Dey, P.M., Harbone, J.D. (eds), Methods in Plant Biochemistry, Academic Press, London. 47-69.

Vinter, V. & Slepecky, R. A. (1965). Direct transition of outgrowing bacterial spores to new sporangia without intermediate cell division. Journal of. Bacteriology. 90. 803–807.

Weiss, E. A. (2002). Spice Crops. New York: Cabi Publishing.

(36)

63

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu Lampiran 1. Ekstraksi Kemukus

Berat kemukus kering : 100 g

Pelarut : Metanol 100%

Rendemen ekstraksi : 7,61%

Bentuk ekstrak : Cairan kental

Warna ekstrak : Coklat gelap

Lampiran 2. Data Uji Disk Diffusion

No. Bakteri Diameter zona hambat (mm)

Kemukus 1% Kemukus 10% CHX DMSO

1 B. cereus

ATCC 33019 7 7 6,5 10 10 10 11 11 9,5 0 0 0

2 B. subtilis

ATCC 6633 8 8 9 10 11 13 11 11 12 0 0 0

Lampiran 3. Data Koloni Spora Tumbuh pada Pengujian Antispora Ekstrak Kemukus

Bacillus cereus

Waktu Inkubasi

Konsentrasi Ekstrak Kemukus

0% 1% 2%

10-1 10-1 10-2 10-2 10-1 10-1 10-2 10-2 10-1 10-1 10-2 10-2

0 jam 126 139 0 0 142 152 0 0 149 186 0 0

1 jam 116 70 0 31 87 154 0 0 90 113 0 0

Bacillus subtilis

Waktu Inkubasi

Konsentrasi Ekstrak Kemukus

0% 1% 2%

(37)

Lampiran 4. Pengolahan Data Uji Disk Diffusion pada B. cereus

1. Uji Normalitas

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Unstandardized

Residual

N 12

Normal Parametersa Mean .0000000

Std. Deviation 1.70293864

Most Extreme Differences Absolute .294

Positive .228

Negative -.294

Kolmogorov-Smirnov Z 1.020

Asymp. Sig. (2-tailed) .249

a. Test distribution is Normal.

2. Uji Homogenitas

Test of Homogeneity of Variances zona.hambat

Levene Statistic df1 df2 Sig.

12.800 3 8 .002

Nilai α yang digunakan dalam pengujian adalah 0,05 dengan hipotesis: H0 = Data tidak homogen

H1 = Data homogen

H0 diterima jika nilai signifikansi < 0,05 (P < 0,05)

H0 ditolak jika P > 0,05, jadi H1 diterima

Nilai signifikansi pada pengujian adalah 0,002 yang berarti P < 0,05 maka

(38)

65

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 3. Uji Kruskal Wallis

Uji homogenitas menunjukkan bahwa data tidak homogen, maka untuk uji

perbedaan dilakukan uji Kruskal Wallis.

Ranks larutan.u

ji N Mean Rank

zona.hambat dmso 3 2.00

k1% 3 5.00

k10% 3 9.00

chx 3 10.00

Total 12

Test Statisticsa,b zona.hambat

Chi-Square 9.804

df 3

Asymp. Sig. .020

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: larutan.uji

Nilai α yang digunakan dalam pengujian adalah 0,05 dengan hipotesis: H0 = Data tidak berbeda signifikan

H1 = Data berbeda signifikan

H0 diterima jika nilai signifikansi > 0,05 (P > 0,05)

H0 ditolak jika P < 0,05, jadi H1 diterima

(39)

Lampiran 5. Pengolahan Data Uji Disk Diffusion pada B. subtilis

1. Uji Normalitas

Unstandardized

Residual

N 12

Std. Deviation 2.31398908

Positive .246

Negative -.160

Kolmogorov-Smirnov Z .851

2. Uji Homogenitas

Test of Homogeneity of Variances zona.hambat

4.533 3 8 .039

H1 = Data homogen

(40)

67

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 3. Uji Kruskal Wallis

Uji homogenitas menunjukkan bahwa data tidak homogen, maka untuk uji

perbedaan dilakukan uji Kruskal Wallis.

Ranks larutan.u

ji N Mean Rank

zona.hambat dmso 3 2.00

k1% 3 5.00

k10% 3 9.33

chx 3 9.67

Total 12

Test Statisticsa,b zona.hambat

Chi-Square 9.663

df 3

Asymp. Sig. .022

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: larutan.uji

(41)

Lampiran 6. Uji Perbandingan Rata-rata (Uji T) Hasil Disk Diffusion B. cereus dan B. subtilis

1. Uji Normalitas

Tests of Normality

bakteri

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

zona.hambat bc .253 9 .100 .829 9 .044

bs .205 9 .200* .933 9 .510

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Nilai α yang digunakan dalam pengujian adalah 0,05 dengan hipotesis: H0 = Data tidak terdistribusi normal

H1 = Data terdistribusi normal

Nilai signifikansi pada pengujian adalah 0,100 dan 0,200 yang berarti P > 0,05

maka data terdistribusi normal.

2. Uji Homogenitas

Test of Homogeneity of Variance

zona.hambat Based on Mean .082 1 16 .778

Based on Median .000 1 16 1.000

Based on Median and with

adjusted df .000 1 15.611 1.000

(42)

69

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu Nilai α yang digunakan dalam pengujian adalah 0,05 dengan hipotesis: H0 = Data tidak homogen

H1 = Data homogen

Nilai signifikansi pada pengujian adalah 0,778 yang berarti P > 0,05 maka

data homogen.

3. Uji T

(43)

Lampiran 7. Pengolahan Data Uji Antispora Ekstrak Kemukus 1% dan 10% Terhadap Spora B. cereus

1. Uji Normalitas

Unstandardized

Residual

N 24

Std. Deviation 3.36811812E4

Positive .225

Negative -.131

2. Uji Homogenitas

A. Perbandingan Jumlah Spora Terhadap Konsentrasi Ekstrak

Test of Homogeneity of Variances spore_amount

.347 2 21 .711

H1 = Data homogen

(44)

71

Hestiarahma Purnamasari, 2015

data homogen.

B. Perbandingan Jumlah Spora Terhadap Waktu Inkubasi

.362 1 22 .554

H1 = Data homogen

data homogen.

3. Uji Oneway ANOVA

ANOVA spore_amount

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 8.962E8 2 4.481E8 .364 .699

Within Groups 2.586E10 21 1.231E9

Total 2.676E10 23

(45)

data tidak berbeda signifikan.

B. Perbandingan Jumlah Spora Terhadap Waktu Inkubasi

ANOVA spore_amount

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 843750.000 1 843750.000 .001 .979

Within Groups 2.676E10 22 1.216E9

Total 2.676E10 23

(46)

73

Hestiarahma Purnamasari, 2015

Lampiran 8. Pengolahan Data Uji Antispora Ekstrak Kemukus 1% dan 10% Terhadap Spora B. subtilis

1. Uji Normalitas

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Unstandardized

Residual

N 24

Std. Deviation 1.59480258E5

Positive .210

Negative -.121

2. Uji Homogenitas

.830 2 21 .450

H1 = Data homogen

H0 diterima jika nilai sig