Potensi Aktivitas Antibakteri Ekstrak Temukunci (Boesenbergia rotunda) Terhadap Sel Vegetatif Serta Spora Bacillus cereus dan Bacillus subtilis.

(1)

POTENSI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK TEMUKUNCI (Boesenbergia rotunda L.) TERHADAP SEL VEGETATIF SERTA SPORA

Bacillus cereus DAN Bacillus subtilis

SKRIPSI

diajukan untuk memenuhi sebagian dari syarat memperoleh gelar Sarjana

Sains Program Studi Biologi, Departemen Pendidikan Biologi.

Oleh: Puji Nurhayat

NIM 1102946

PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

Potensi Aktivitas Antibakteri Ekstrak Temukunci

(Boesenbergia rotunda) Terhadap Sel Vegetatif Serta Spora Bacillus cereus dan Bacillus subtilis

Oleh

Puji Nurhayat

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Pendidikan Indonesia

Agustus 2015

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

(3)

LEMBAR PENGESAHAN

POTENSI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK TEMUKUNCI (Boesenbergia rotunda L.) TERHADAP SEL VEGETATIF SERTA SPORA

Oleh :

Puji Nurhayat

1102946

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH:

Pembimbing I

Hj. Any Fitriani, Dr., M.Si

NIP. 196502021991032001

Pembimbing II

Peristiwati, Dr., M. Kes

NIP. 196403201991032001

Mengetahui,

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi

Bambang Supriatno, Dr., M. Si

(4)

(5)

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Potensi Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Temukunci (Boesenbergia rotunda L.) Terhadap Sel Vegetatif Serta Spora Bacillus cereus dan Bacillus subtilis” ini beserta seluruh isinya benar-benar karya saya sendiri. Saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika ilmu yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini, saya siap menanggung resiko/sanksi apabila di kemudian hari ditemukan adanya pelanggaran etika keilmuan atau ada klaim dari pihak lain terhadap keaslian karya saya ini.

Bandung, Juli 2015

(6)

POTENSI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK TEMUKUNCI (Boesenbergia rotunda L.) TERHADAP SEL VEGETATIF SERTA SPORA

ABSTRAK

Bacillus cereus dan B. subtilis merupakan bakteri penghasil spora penyebab keracunan makanan yang terdapat dimana-mana dan sporanya secara berkala mengontaminasi berbagai macam makanan. Boesenbergia rotunda L. atau temukunci telah diketahui sebagai obat-obatan dan bahan masakan di Asia Tenggara. Tujuan dari penelitian ini untuk menentukan aktivitas antibakteri dari temukunci terhadap sel vegetatif serta spora dari B. cereus dan B. subtilis. Pada penelitian ini, baik MIC maupun MBC dari ekstrak metanolik B. rotunda telah diuji terhadap strain B. cereus ATCC33019 dan B. subtilis ATCC6633 menggunakan metode standar dari Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Selanjutnya, antisporisidal dari ekstrak telah diuji baik terhadap B. cereus maupun B. subtilis. Hasil menunjukkan bahwa ekstrak B. rotunda berpengaruh terhadap sel vegetatif strain B. cereus dan B. subtilis. Ekstrak dapat menghambat pertumbuhan B. cereus dan B. subtilis dengan nilai MIC 0.3125 mg/ml. Nilai MBC ekstrak adalah 0.625 mg/ml terhadap kedua genus Bacillus. Aktivitas antispora dari ekstrak B. rotunda telah diuji terhadap spora B. cereus dan B. subtilis pada konsentrasi 0%, 1%, dan 2% dengan waktu inkubasi 0 jam dan 1 jam. Ekstrak memiliki aktivitas antispora yang cepat dan kuat, yaitu dengan menurunkan jumlah spora dalam CFU/ml dari 5.57 menjadi 5.20 pada spora B. cereus. Sedangkan penurunan terhadap jumlah spora B. subtilis, yaitu dari 5.04 menjadi 2.27. Secara keseluruhan, ekstrak metanolik B. rotunda memperlihatkan potensi aktivitas antibakteri dan antispora terhadap sel vegetatif serta spora B. cereus dan B. subtilis. Oleh karena itu, ekstrak B. rotunda dapat dikembangkan untuk agen antibakteri terhadap strain Bacillus.

(7)

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF TEMUKUNCI (Boesenbergia rotunda L.) AGAINST VEGETATIVE CELLS AND SPORES OF Bacillus cereus AND

Bacillus subtilis

ABSTRACT

Bacillus cereus and B. subtilis are spore-forming bacterial foodborne pathogen, which is existed everywhere in nature and the spores frequently contaminate a variety of foods. Boesenbergia rotunda L. or temukunci has known as medicinal and culinary herb in Southeast Asia. The aim of this study was to determine antibacterial activity of temukunci against B. cereus and B. subtilis vegetatives cells and spores. In this study, antibacterial activity, in term of MIC and MBC of methanolic extract of B. rotunda have been tested against B. cereus ATCC33019 and B. subtilis ATCC6633 strains using standard method of Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Furthermore, the sntisporicidal of the extract has tested against both spores of B. cereus and B. subtilis. The results show that B. rotunda extract was susceptible to vegetative cells of B. cereus and B. subtilis strains. The extract could inhibit the growth of B. cereus and B. subtilis with MIC value of 0.3125 mg/ml. MBC value of the extract was 0.625 mg/ml against both Bacillus. Antispore activity of B. rotunda extract has been tested against B. cereus and B. subtilis spores at concentrations of 0%, 1% and 2% with exposure time of 0 hour and 1 hour. The extract exhibit fast and strong antisporicidal activity, it’s reduced the number of spores in CFU/ml from 5.57 to 5.20 of B. cereus. Meanwhile, against B. subtilis was 5.04 to 2.27. Overall, methanolic extract of B. rotunda shows potential antimicrobial and antisporicidal activity against B. cereus and B. subtilis vegetative cells and spores. Hence, the B. rotunda extract can be developed for antibacterial agents against Bacillus strain.

Keywords: Antibacteria, antispore, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Boesenbergia

(8)

Puji Nurhayat, 2015

DAFTAR ISI

Lembar Pengesahan ... i

Pernyataan ... ii

Kata Pengantar ... iii

Daftar Isi ... v

Daftar Gambar ... vii

Daftar Tabel ... viii

Daftar Lampiran ... ix

Abstrak ... x

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang ... 1

B. Rumusan Masalah ... 3

C. Pertanyaan Penelitian ... 3

D. Batasan Masalah ... 3

E. Tujuan ... 4

F. Hipotesis ... 4

G. Manfaat ... 4

BAB II. SPORA, ANTISPORA, ANTIBAKTERI, Bacillus, DAN Boesenbergia rotunda (TEMUKUNCI) ... 6

A. Spora dan Antispora ... 6

B. Antibakteri ... 9

C. Bacillus ... 13

1. Bacillus cereus ... 16

2. Bacillus subtilis ... 18

D. Boesenbergia rotunda (Temukunci) ... 19

BAB III. METODE PENELITIAN ... 24

A. Jenis Penelitian ... 24

B. Desain Penelitian ... 24

(9)

Puji Nurhayat, 2015

D. Lokasi dan Waktu Penelitian ... 24

E. Alat dan Bahan ... 25

F. Cara Kerja ... 26

1. Strain Bakteri dan Sampel Tanaman ... 26

2. Preparasi Medium dan Sterilisasi ... 26

3. Preparasi Ekstrak ... 27

4. Preparasi Spora ... 27

5. Tes Antibakteri ... 28

a. Disc-diffusion test ... 28

b. MIC dan MBC ... 28

6. Menentukan Aktivitas Antispora ... 30

BAB IV. TEMUAN DAN PEMBAHASAN ... 32

A. Uji Antibakteri Terhadap Bacillus cereus dan Bacillus subtilis ... 32

B. Uji Aktivitas Antispora Terhadap Bacillus cereus dan Bacillus subtilis ... 37

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 47

A. Kesimpulan ... 47

B. Saran ... 48

Daftar Pustaka ... 49

(10)

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Siklus hidup Bacillus spp ... 14

Gambar 2.2. Kunci sederhana untuk identifikasi Bacillus ... 16

Gambar 2.3. Bacillus cereus ... 17

Gambar 2.4. Bacillus subtilis ... 19

Gambar 2.5. Boesenbergia rotunda ... 20

Gambar 3.1. Bagan alir penelitian ... 31

Gambar 4.1. Zona hambat ekstrak B. rotunda terhadap Bacillus ... 34

Gambar 4.2. Hasil MIC ekstrak B. rotunda terhadap Bacillus ... 35

Gambar 4.3. Hasil MBC ekstrak B. rotunda terhadap Bacillus ... 36

Gambar 4.4. Hasil pewarnaan spora pada Bacillus ... 38

Gambar 4.5. Hasil reduksi CFU/ml spora B. cereus oleh glutharaldehyde ... 39

Gambar 4.6. Hasil reduksi CFU/ml spora B. subtilis oleh glutharaldehyde ... 40

Gambar 4.7. Hasil uji antispora glutharaldehyde terhadap B. cereus ... 40

Gambar 4.8. Hasil uji antispora glutharaldehyde terhadap B. subtilis ... 40

Gambar 4.9. Hasil reduksi CFU/ml spora B. cereus oleh ekstrak B. rotunda ... 42

Gambar 4.10. Koloni spora B. cereus pada uji antispora ekstrak B. rotunda... 42

Gambar 4.11. Hasil reduksi CFU/ml spora B. subtilis oleh ekstrak B. rotunda ... 44

(11)

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1. Alat-alat penelitian ... 25

Tabel 3.2. Bahan-bahan penelitian ... 26

Tabel 3.3. Disc-diffusion ... 28

Tabel 3.4. Data MIC dan MBC ... 29

Tabel 3.5. Jumlah koloni spora B. cereus atau B. subtilis ... 30

Tabel 4.1. Hasil uji disc-diffusion dari ekstrak B. rotunda dan kontrol ... 32

Tabel 4.2. Hasil MIC dan MBC dari ekstrak B. rotunda ... 35

Tabel 4.3. Hasil uji ANOVA dari data jumlah spora B. cereus ... 42

(12)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Data Ekstraksi B. rotunda ... 57

Lampiran 2. Data Disc-diffusion ... 57

Lampiran 3. Pengolahan Data Uji Disc-diffusion Pada B. cereus ... 58

Lampiran 4. Pengolahan Data Uji Disc-diffusion Pada B. subtilis ... 59

Lampiran 5. Data Uji T Hasil Disc-diffusion B. cereus dan B. subtilis... 61

Lampiran 6. Data Jumlah Koloni Spora dari Uji Antispora Ekstrak B. rotunda . 61 Lampiran 7. Pengolahan Data Uji Antispora Ekstrak Terhadap B. cereus ... 62

Lampiran 8. Pengolahan Data Uji Antispora Ekstrak Terhadap B. subtilis ... 65

Lampiran 9. Data Uji Antispora Glutharaldehyde Terhadap B. cereus ... 68

(13)

1

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Spora bakteri memiliki tipe sel yang berbeda, secara spesifik dibentuk pada kondisi yang tidak menguntungkan. Strukturnya unik dan sangat berbeda dengan struktur sel vegetatif yang normal (de Vries, 2006). Apabila dibandingkan dengan sel vegetatif, spora lebih resisten terhadap pemanasan (100.000 lebih resisten), UV dan radiasi ionisasi (100 kali lipat lebih resisten), dan tahan terhadap proses pengeringan atau pengawetan, antibiotik, desinfektan, serta bahan kimia lainnya. Setelah diketahui spora memiliki sifat resisten, maka keberadaan spora sangat penting untuk diperhatikan dalam proses pembuatan makanan serta sterilisasi dimana keberadaan spora tersebut erat kaitannya dengan genus Bacillus (Slepecky and Hemphill, 2006). Genus ini menghasilkan endospora yang tahan terhadap panas pada kondisi lingkungan yang merugikan (Fernández-No et al., 2013).

(14)

2

Pada industri beras, senyawa sintetis yang digunakan dalam melawan aktivitas bakteri endospora yaitu glutaraldehyde. Namun, diperlukan konsentrasi tinggi untuk membasmi spora apabila diterapkan pada makanan (Russell, 1990). Di Indonesia, glutaraldehyde dikenal dalam pasaran dengan istilah “boraks”. Boraks diketahui sangat berbahaya bagi kesehatan konsumen dan sangat tidak dianjurkan terdapat pada makanan. Selain itu, masyarakat juga telah lebih sadar akan potensi risiko kesehatan terkait dengan konsumsi komponen sintetik (Kechichian et al., 2010). Oleh karena itu, dewasa ini berkembang minat baru dalam bidang penelitian yang lebih mengarah pada pemanfaatan bahan alami dalam beberapa bidang, termasuk diantaranya bidang kesehatan (obat-obatan) dan pangan sebagai contoh pengembangan potensi tanaman yang dapat digunakan sebagai pengawet alami dalam industri makanan.

Tanaman obat, termasuk herba, secara luas digunakan pada industri makanan sebagai bumbu dan penyedap, yang diantaranya sangat bermanfaat sebagai bahan antibakteri maupun antimikroba (Cho et al., 2008). Banyak kandungan derivat antimikroba memiliki spektrum yang luas dalam aktivitas melawan bakteri penyebab keracunan makanan dan hal itu memastikan bahwa tanaman obat dapat digunakan sebagai bahan pengawet alami makanan (Cho et al., 2008; Smith-Palmers et al., 1998). Tanaman obat sangat bermanfaat dalam menyembuhkan berbagai macam penyakit. Hal ini menjadi suatu perhatian dalam bidang kesehatan dan menjadikan tanaman obat sebagai bahan alternatif obat yang terkenal di masyarakat.

(15)

3

Puji Nurhayat, 2015

rotunda berpotensi sebagai antibakteri yang dapat melawan spesies penyebab keracunan makanan, seperti Escherichia coli.

Uraian di atas memberikan gambaran bahwa proses pengnonaktifan spora sangat penting untuk diteliti, terkait kehidupan manusia sangat erat hubungannya dengan makanan. Dengan makanan yang tidak sehat bahkan terkontaminasi akan memudahkan manusia untuk sakit yang sangat mungkin berujung pada kematian. Sehingga proses pengnonaktifan spora B. subtilis dan B. cereus sendiri merupakan hal yang sangat penting untuk ditelaah dan dilakukan, terutama untuk memaksimalkan tingkat keamanan dan kualitas dalam pembuatan makanan.

B. Rumusan Masalah

Bagaimana aktivitas antibakteri ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap sel vegetatif serta spora B. cereus dan B. subtilis ?

C. Pertanyaan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka terdapat beberapa pertanyaan penelitian sebagai berikut.

1. Berapa besar zona hambat yang dihasilkan ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap B. cereus dan B. subtilis pada konsentrasi yang berbeda ?

2. Berapa nilai Minimun inhibitory concentration (MIC) dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap B. cereus dan B. subtilis ?

3. Berapa nilai Minimum bactericidal concentration (MBC) dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap B. cereus dan B. subtilis ?

4. Berapa konsentrasi antispora yang optimum dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap spora B. cereus dan B. subtilis ?

5. Berapa waktu inkubasi antispora yang optimum dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap spora B. cereus dan B. subtilis ?

D. Batasan Masalah

Penelitian ini memiliki beberapa batasan masalah sebagai berikut.

(16)

4

2. Pada disc-diffusion pengujian konsetrasi yang digunakan hanya dibatasi 1% dan 10% dengan pelarut dimethylsulfoxide (DMSO) 100%. Sedangkan untuk konsentrasi pengenceran pada uji MIC dan MBC dibatasi dengan konsentrasi pengenceran sebesar sebesar 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml, 0.0781 mg/ml, 0.0390 mg/ml, dan 0.0195 mg/ml.

3. Bakteri yang diuji adalah B. subtilis ATCC6633 dan B. cereus ATCC33019. 4. Pengujian untuk antispora dibatasi pada konsentrasi 0%, 1%, dan 2% dengan

waktu inkubasi 0 jam dan 1 jam.

E. Tujuan

Adapun tujuan dari penelitian ini sebagai berikut.

1. Untuk menentukan besar zona hambat yang dihasilkan dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap B. cereus dan B. subtilis.

2. Untuk menentukan nilai Minimun inhibitory concentration (MIC) dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap B. cereus dan B. subtilis.

3. Untuk menentukan nilai Minimum bactericidal concentration (MBC) dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap B. cereus dan B. subtilis.

4. Untuk menentukan konsentrasi antispora yang optimum dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap spora B. cereus dan B. subtilis.

5. Untuk menentukan waktu inkubasi antispora yang optimum dari ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap spora B. cereus dan B. subtilis.

F. Hipotesis

Hipotesis pada penelitian ini bahwa terdapat pengaruh pemberian ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap aktivitas antibakteri pada spora B. cereus dan B. subtilis.

G. Manfaat

Penelitian ini memiliki beberapa manfaat sebagai berikut.

(17)

5

2. Memberikan informasi mengenai aktivitas antibakteri pada ekstrak B. rotunda (temukunci) terhadap bakteri penyebab keracunan makanan.

3. Memberikan informasi dan rujukan terkait bahan pengawet alami yang lebih sehat serta tidak berisiko terhadap manusia.

4. Memberikan informasi rujukan terkait bahan obat-obatan alami bagi beberapa penyakit.

(18)

24

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan termasuk ke dalam jenis penelitan eksperimental dengan memberikan perlakuan konsentrasi dan waktu inkubasi yang berbeda-beda (Fathoni, 2006).

B. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) karena penelitian dilakukan di laboratorium dan kondisi yang homogen. Pada pengujian aktivitas antispora digunakan konsentrasi ekstrak B. rotunda sebesar 0%, 1%, dan 2% terhadap spora B. cereus dan B. subtilis. Sedangkan pada pengujian disc-diffusion digunakan konsentrasi 1%, dan 10%, dengan chlorhexidine 1% merupakan kontrol positif serta DMSO 10% merupakan kontrol negatif. Pada uji MIC dan MBC konsentrasi pengujian yang digunakan berdasarkan teknik pengenceran dalam mg/ml adalah 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.0781, 0.0390, dan 0.0195, dengan kontrol positif berupa medium sebanyak 200 µl dan kontrol negatif berupa inokulum sebanyak 200 µl. Setiap konsentrasi uji dan kontrol terdapat pengulangan sebanyak minimal 2 kali pengulangan (Zainin et al., 2013).

C. Populasi dan Sampel

Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman B. rotunda atau temukunci, sedangkan sampel dari penelitian ini adalah rimpang dari tanaman B. rotunda.

D. Lokasi dan Waktu Penelitian

(19)

25

E. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut. Tabel 3.1. Alat-alat penelitian

No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah

1 Botol Duran 500 ml 3 buah

2 Timbangan Sartorius BSA224S-CW 1 buah

3 Autoclave Tomy SX-500 1 buah

4 Spatula 2 buah

5 Cawan Petri Disposable 51 buah

6 Laminar ESCO Smart Programme

SC2-4A1 dan ESCO Class II EQU/04-EBC-2A

2 buah

7 Parafilm Merk M 1 box

8 Ose/Loop Disposable dan non-disposable 3 buah

9 Cotton bud 4 buah

10 Destilator Sartorius stedim biotech arium 611DI

1 buah

11 Erlenmeyer Bomex 2 buah

12 Tips Ukuran 10-100 µL dan 100-1000

µL Eppendorf

@ 3 box

13 Tabung Mikro Eppendorf 1.5 ml 60 buah

14 Bunsen Elektrik Fireboy ECO 1 buah

15 Inkubator Memmert GmbH + Co.KG IN55 1 buah

16 Lemari pendingin Merk berjaya 1 buah

17 Sarung tangan Vandaier, Malaysia 1 box

18 Penggaris TENTH 1 buah

19 HiAntibiotic Zone Scale HiMedia, Mumbai 400 086, India 1 buah 20 Mikropipet Uk. 10-100µL eppendorf,

PhysioCare, Germani

1 buah

21 Fortex Mixer BioGote 1 buah

22 Botol universal 2 buah

23 Mikrotiter Cellstar No. 650 185 Greiner bio-one

2 buah 24 Mikropipet Uk. 100-1000µL eppendorf,

PhysioCare, Germani

1 buah

25 Gelas ukur Ukuran 2 liter 1 buah

26 Kamera Cannon dan Nikon 1 buah

27 Alat tulis Log book, pensil, pulpen, dan penghapus

1 set

28 Oven Memmert IN55, Germany 1

29 Centrifuge Sartorius, 1-14, UPM 1

30 Evaporator Buchi, R-3. 1

(20)

26

Tabel 3.2. Bahan-bahan penelitian

No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah

1 Tryptic Soy Broth (TSB) BD, Dickinson and Company, MD 21152 USA

15 g

2 Agar Merk KgaA, Darmstadt,

Germany

21 g

3 Akuadest (dH2O) 1700 ml

4 Alumunium foil My Chef, Malaysia. 1 gulung 5 Cakram 6 mm Dibuat dari kertas Whatman

cat no.1001 125

1 toples 6 Inokulum Bacillus cereus Strain ATCC33019, IBS 1 plate 7 Inokulum Bacillus

subtilis

Strain ATCC6633, IBS 1 plate

8 DMSO 100% 2 ml

9 Ekstrak Temukunci 1% Dari IBS UPM 20 μl

10 Ekstrak Temukunci 10% Dari IBS UPM 20 μl

13 Chlorhexidine 20 μl

14 Mueller Hinton Broth (MHB)

Beckton Dickinson, Spark, MD 21152 USA

14 g 15 NaCl 0,95% R & M Chemicals, Essex, USA

PHOU27814

4,75 g

16 Alkohol 70% 100 ml

17 Nutrien Broth (NB) Merck KgaA, 1-05443-0500 Germany.

4 g 18 Metanol 100% QreC, Grad AR, Malaysia 400 ml

19 Kertas saring Whatman no.1 1 box

F. Cara Kerja

1. Strain Bakteri dan Sampel Tanaman

Sampel tanaman yang digunakan berupa serbuk B. rotunda yang telah kering. Pada penelitian ini digunakan pula strain bakteri Bacillus cereus ATCC33019 dan B. subtilis ATCC6633 yang diperoleh dari IBS (Institute of Biosains), UPM, Serdang, Malaysia. Strain bakteri ditumbuhkan pada Tryptic Soy Agar (TSA) dengan suhu 37ºC selama 24 jam.

2. Preparasi Medium dan Sterilisasi

(21)

27

Hinton Broth (MHB), dan Nutrient Agar (NA). Takaran dalam membuat TSA terdiri dari 30 g Tryptic Soy Broth (TSB) merk Becton, USA dan 14 g agar Merck KgaA, Germany dalam 1 L akuades. Sedangkan, untuk pembuatan MHB terdiri dari MHB instan merk Becton Dickinson, USA sebanyak 21 g untuk 1 L akuades dengan pH akhir 7.3 ± 0.1. Terakhir, untuk membuat NA terdiri dari 8 g Nutrient Broth (NB) Merck KgaA, Germany, 14 g agar Merck KgaA, dan akuades 1 L.

3. Preparasi Ekstrak

Serbuk tanaman B. rotunda kering (100 g) dimaserasi pada 400 ml metanol 100% (v / v) selama 3 hari pada suhu ruangan. Pada proses ekstraksi B. rotunda digunakan metanol karena biasanya metanol memiliki aktivitas antibakteri yang lebih baik dibandingkan dengan pelarut lain seperti heksana dan air (Erlina et al., 2012). Hasil maserasi disaring menggunakan kertas saring Whatman no. 1 dan kemudian diekstraksi dengan menggunakan rotary vacuum evaporator (Buchi, Rotavor R-3) pada suhu 50°C, rendemen ekstrak methanol (Rukayadi et al., 2008). Ekstrak dilarutkan dalam dimethylsulfoxide (DMSO) 100% yang kemudian digunakan sebagai larutan stok. Konsentrasi akhir dari ekstrak yang digunakan adalah 10 mg/ml atau 1% dan 100 mg/ml atau 10%. Pada penelitian ini DMSO 100% tidak dapat membunuh bakteri yang diuji. Oleh karena itu, DMSO dapat digunakan sebagai kontrol negatif dalam pengujian.

4. Preparasi Spora

(22)

28

dilakukan proses penghitungan spora untuk memperoleh 30 – 300 spora per cawan. Di samping itu, dilakukan pula proses pewarnaan endospora. Spora pada hasil pewarnaan akan menunjukkan warna hijau, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah (Kida et al., 2004; dan Rukayadi et al., 2009 dengan modifikasi).

5. Tes Antibakteri a. Disc-diffusion test

Ektrak B. rotunda digunakan dalam disc-diffusion bertujuan untuk uji aktifitas antibakteri terhadap B. cereus and B. subtilis. Kedua bakteri tersebut dikultur selama 24 jam. Kemudian kultur ditumbuhkan dan disebarkan pada TSA menggunakan cotton bud steril. Kertas cakram steril (6 mm) ditetesi ekstrak B. rotunda sebanyak 10 μl pada masing-masing konsentrasi pengujian dan kontrol. DMSO 10% digunakan sebagai kontrol negatif dan chlorhexidine (CHX) 1% digunakan sebagai kontrol positif. Pada pengujian digunakan konsentrasi ekstrak sebesar 1% dan 10%. Cawan petri yang telah berisi cakram uji serta kontrol diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kemudian, setelah itu diobservasi dan dihitung hasil zona hambat yang terbentuk pada area cakram. Data diisi pada Tabel 3.3. Data hasil yang didapat dirata-ratakan dan diuji statistik menggunakan SPSS versi 16 yaitu menggunakan uji normalitas, uji homogenitas, uji One-way ANOVA untuk mengetahui nilai signifikansi antar konsentrasi dengan kontrol dan uji T untuk mengetahui perbandingan antara kedua bakteri uji.

Tabel 3.3. Disc-diffusion No. Konsentrasi Ekstrak /

Kontrol

Zona Hambat (mm)

B. cereus B. subtilis

1 B. rotunda 1% 2 B. rotunda 10% 3 DMSO 10% (-)

4 Chlorhexidine (CHX) 1% (+)

b. MIC dan MBC

(23)

29

Institute (CLSI) M7-A6 (2003). Pengujian dilakukan pada 24 sumur pada mikrotiter dengan menggunakan metode broth microdilution (mikro pengenceran broth) dengan inokulum yang dikisarkan 106 CFU/ml. Setiap dua kali pengenceran dari larutan stok ekstrak B. rotunda dicampur dengan organisme yang diuji dalam medium Mueller Hinton Broth (MHB). Sumur no. 1 merupakan kontrol positif (hanya terdiri dari medium sebanyak 200 µl) dan sumur no. 2 merupakan kontrol negatif (hanya terdiri dari inokulum sebanyak 200 µl). Sedangkan sumur no. 12 pada mikrotiter berisi konsentrasi tertinggi dari ekstrak yang diuji, dan secara berurutan sampai sumur no. 3 berisi konsentrasi terendah dari ekstrak yang diuji. Setiap pengujian dan kontrol dilakukan duplikasi. Mikrotiter yang berisi pengujian dan kontrol kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil MIC menunjukkan bahwa konsentrasi terendah dari agen antibakteri menghasilkan penghambatan yang sempurna pada pertumbuhan secara visual. Ekstrak diencerkan dengan menggunakan DMSO 100% dan konsentrasi DMSO menurun secara berkala dimulai dari dua kali pengenceran pada sumur mikrotiter (Zainin et al., 2013).

Minimum bactericidal concentration (MBC) atau konsentrasi bakterisidal minimum menggambarkan konsentrasi terendah dari agen antibakteri dimana tidak ada pertumbuhan bakteri pada medium Mueller Hinton Agar (MHA). Pengujian MBC diambil dari subkultur pada suspensi yang diujikan saat MIC sebanyak masing-masing 10 μl setiap sumur kemudian diteteskan pada cawan yang telah berisi MHA. Semua sumur yang terdiri dari kontrol positif (nomor 1) dan kontrol negatif (nomor 2) serta masing-masing konsentrasi pengenceran dipipet pada medium agar. Kemudian semua cawan petri diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam atau sampai bakteri pada kontrol positif tumbuh pada medium. Pengujian MBC dilakukan pada semua strain bakteri yang diuji, yaitu B. cereus dan B. subtilis (Zainin et al., 2013). Data hasil MIC dan MBC diisi pada Tabel 3.4.

Tabel 3.4. Data MIC dan MBC.

No. Nama Bakteri MIC (mg/ml) MBC (mg/ml) 1 B. cereus ATCC33019

(24)

30

6. Menentukan Aktivitas Antispora

Pengujian aktivitas antispora dilakukan berdasarkan Kida et al. (2004) dan Rukayadi et al. (2009) dengan modifikasi. Pasta atau konsentrat ekstrak B. rotunda diencerkan dengan menggunakan DMSO 100% sampai diperoleh ekstrak B. rotunda 10%. Glutaraldehyde 10% digunakan sebagai kontrol positif pada pengujian aktifitas antispora atau aktifitas sporisidal. Suspensi spora yang telah disiapkan kemudian diencerkan dengan perbandingan 1:100 pada NaCl 0.95%, sehingga rendemen tersebut sekarang telah berisi 106 spora/ml. Konsentrasi pengujian dari ekstrak B. rotunda yang disiapkan adalah 0.00%, 1.00%, and 2.00% yang diujikan bersama dengan suspensi spora yang telah diencerkan. Untuk kontrol positif, yaitu glutaraldehyde, disiapkan juga konsentrasi 0.00%, 1.00%, dan 2.00%. Setiap 1 ml dari larutan uji diinkubasi pada incubator shaker 37ºC dengan waktu inkubasi yang berbeda. Waktu inkubasi dalam penelitian ini digunakan 0 jam dan 1 jam, kemudian 100 µl larutan dipindahkan pada tabung tabung mikro yang telah berisi 900 µl NaCl 0,95% dan diencerkan dari 10-1 sampai 10-2. Untuk setiap serial konsentrasi dari ekstrak B. rotunda dan glutaraldehyde, diambil masing-masing 25 µl dari pengenceran 10-1 dan 10-2 yang kemudian disebarkan pada medium cawan berisi Nutrient Agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh dan nilai rata-rata CFU/ml dihitung. Data diisi pada Tabel 3.5.

Tabel 3.5. Jumlah koloni spora Bacillus cereus atau Bacillus subtilis Konsentrasi

B. rotunda (%)

Jumlah koloni B. cereus atau B. subtilis (CFU/ml)

0 jam 1 jam

10-1 10-2 10-1 10-2

P1 P2 P1 P2 P1 P2 P1 P2

(25)

31

Ekstraksi B. rotunda pelarut metanol 100% konsentrasi 1% dan 10% pengencer DMSO 100%

Presparasi spora B.

cereus dan B. subtilis

pelarut 0.95% NaCl, 60ºC, 4500 rpm Pewarnaan endospora

dengan malahit hijau dan safranin

Pengujian Aktivitas Antibakteri

Aktivitas Antibakteri Terhadap Sel Vegetatif Aktivitas Antibakteri Terhadap Spora Disc-diffusion

konsentrasi uji 1% dan 10%, kontrol positif

CHX 1%, kontrol negatif DMSO 10%

Uji MIC konsentrasi ekstrak B. rotunda yang digunakan1% (10

mg/ml) dengan pengenceran ½ kalinya (dalam mg/ml): 5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.0781,

0.0390, dan 0.0195.

Uji MIC konsentrasi ekstrak B. rotunda yang digunakan1% (10 mg/ml) dengan pengenceran ½ kalinya (dalam mg/ml): 5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.0781,

0.0390, dan 0.0195.

Terhadap B. cereus dan B. subtilis konsentrasi uji 0%, 1%, dan 2%. Waktu

inkubasi 0 jam dan 1 jam.

Terhadap

Glutharaldehide

konsentrasi uji 0%, 1%, dan

2%. Waktu inkubasi 0 jam

dan 1 jam.

Menghitung Jumlah Koloni Spora (CFU/ml) 1 2 3 4 5

Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian