KARAKTERISASI AMILASE DARI ISOLAT BAKTERI YANG BERASAL DARI BALI DAN LOMBOK
Elidar Naiola
Balitbang Mikrobiologi, Puslitbang Biologi LIPI Jl. Raya Juanda 18, Bogor
ABSTRACT
CHARACTERIZATION OF AMYLASE FROM BACTERIAL ISOLATES FROM BALI AND LOMBOK. ELIDAR NAIOLA. Twenty-one bacterial isolates were isolated from various sample of fermented foods from Bali and Lombok, and their ability to produce amylase has been done. It was found 13 number of bacteria shown the amylolytic activity which shown the clear zone areal after pouring with iodium solution, twelve out of the thirteen isolates were belonged to the genus of Bacillus spp. The isolate (ISO B3.2) to be the most active compared to another and it was identified as Bacillus cereus, the activity of this enzyme obtain was 54,19 x 102 U/ml (one unit activity is define as micromol of glucose produce per ml per minute). The maximum temperature for enzyme reaction was 40 – 50 oC, optimal pH was pH 5.0 – 7.0 and enzyme was relatively stable in those condition. The bacteria produced high amylase when it was grown in media containing rice glutinosa flour or rice flour (as carbon source), the amylase activity in media containing rice glutinous and rice flour were 337.50 x 102 U/ml and 301.1 x 102 U/mL, respectively. From kinetic characterization study, it was found that enzyme showed Km and Vmax value of 0,0036 and 89.36 micromol/ml/minute respectively at condition (pH 7.0; temp. 40oC; incubation time 10 minute)
Key words: Amylase, Bacillus spp., characterization, activity
ABSTRAK
KARAKTERISASI AMILASE DARI ISOLAT BAKTERI YANG BERASAL DARI BALI DAN LOMBOK. ELIDAR NAIOLA. Telah diisolasi sebanyak dua puluh satu isolat bakteri dari beberapa contoh makanan/ minuman fermentasi tradisional serta sumber lainnya dari daerah Bali dan Lombok, untuk diuji kemampuan amilolitiknya secara kualitatif, semi kuantitatif dan kuantitatif. Hasil pengujian menunjukkan sebanyak tiga belas isolat yang mempunyai kemampuan amilolitik. Sebagian besar adalah termasuk kelompok Bacillus spp.
Aktivitas amilase tertinggi (54,19 x 102 U/ml) dihasilkan oleh isolat B3.2 yang diidentifikasi sebagai Bacillus cereus. Suhu optimal untuk reaksi enzimatis amilase kasar dari B. cereus adalah 40 - 50oC, sedangkan untuk pH optimal antara pH 5,0 – 7,0 dan relatif stabil pada kisaran pH tersebut. Sebagai media produksi amilase, tepung ketan dan tepung beras merupakan sumber C yang baik. Aktivitas amilase pada media ketan adalah 377,50 x 102 U/ml dan pada tepung beras adalah 301 x 102 U/ml. Penghitungan secara kinetika reaksi dengan menggunakan beberapa variasi konsentrasi pati sebagai substrat diketahui bahwa Km
dan Vm filtrat biakan B. cereus mengandung amilase adalah 0,0036% dan 89,36 x 102 U/ml/menit pada kondisi pH 7,0; suhu 40oC; inkubasi 10 menit.
Kata kunci: Amilase, Bacillus spp., karakterisasi, aktivitas
PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini penggunaan enzim di Indonesia semakin meningkat, terutama untuk penerapan dalam berbagai bidang bioindustri. Enzim amilase adalah salah satu kelompok enzim yang dapat dihasilkan oleh mikroorganisme yang telah banyak dimanfaatkan dalam berbagai bidang industri, pangan maupun non pangan. Hingga saat ini kebutuhan akan enzim amilase belum dapat terpenuhi sehingga masih harus diimpor dari luar negeri.
Amilase antara lain -amilase, β- amilase, amiloglukosidase dan iso-amilase adalah kelompok enzim yang dapat memecah pati menjadi gula-gula sederhana (glukosa) yang banyak digunakan dalam berbagai industri seperti indusri tekstil, deterjen dan gula cair non tebu. Dalam industri pangan, -amilase berperan dalam mempercepat proses hidrolisis pati dan menurunkan viskositas pati (Nigam dan Singh, 1995).
α-amilase yang disebut juga dextrinizing enzyme atau starch liquifing, adalah enzim yang menghasil-kan dekstrin sebagai produk utama. Enzim α-amilase menghidrolisa ikatan glukosidik molekul pati dibagian tengah pada ikatan α-1-4 glikosidik sehingga lebih dikenal sebagai
“endo-amilase”. α-amilase menghidrolisa pati melalui dua tahapan, tahap pertama mendegradasi pati menjadi maltosa dan maltoriosa yang pada tahap berikutnya dihidrolisis menjadi glukosa dan maltosa.
Hidrolisis amilopektin oleh α-amilase dapat menghasilkan glukosa, maltosa dan beberapa dekstrin yang terdiri dari beberapa glukosa. Enzim β-amilase
bekerja pada bagian samping dari ikatan amilo-(1,4)-maltosidase yang menghasil- kan maltosa, sehingga dikenal sebagai
“exo-amilase”. Enzim amiloglukosidase atau amilo-(1,4, 1-6)-glukosidase dapat memecah ikatan 1,4-glikosidik secara berturut-turut dari ujung rantai nonreduksi sehingga menghasilkan glukosa.
Enzim amilase dapat diisolasi dari mikroba antara lain kapang, bakteri dan khamir. Enzim yang diisolasi dari mikroba memiliki beberapa keunggulan antara lain produksinya tidak terbatas, dapat diproduksi hingga skala tertentu, lebih ekonomis dan produktivitasnya dapat ditingkatkan.
Beberapa isolat bakteri penghasil amilase yang sudah dikembangkan secara komersial adalah dari genus Bacillus spp.
antara lain B. substilis, B. mycoides. B.
stearothermophillus, B cereus, dan B polymixa, sedangkan dari kelompok kapang adalah Aspergillus spp., dan Rhizopus spp. yang merupakan mikroorganisme penghasil amiloglu- kosidase, amilase dan transglukosidase (Fogarty dan Kelly, 1980; Frazier dan Westhoff, 1981).
Sebagai medium produksi amilase dapat digunakan berbagai macam sumber karbohidrat seperti tepung jagung, kentang, singkong, sagu, ubi jalar, dedak gandum, dedak beras serta sumber karbohidrat lainnya. Nasi juga merupakan bahan yang banyak digunakan sebagai media pertumbuhan bagi mikroorganisme penghasil enzim amilase seperti Aspergillus niger maupun Rhizopus sp.
(Kinoshita et al., 1982).
Dalam penelitian ini telah diisolasi bakteri penghasil amilase yang berasal dari
beberapa contoh baik contoh pangan maupun non pangan, Beberapa sifat dari isolat terseleksi juga dipelajari untuk memperoleh biakan bakteri penghasil amilase yang dapat digunakan untuk beberapa keperluan industri .
BAHAN DAN CARA KERJA
Biakan bakteri
Biakan bakteri yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari beberapa contoh, antara lain produk pangan/
minuman fermentasi (bahan baku brem, tuak lontar, anggur merah, terasi), susu kuda liar serta dari beberapa contoh lainnya yang berasal dari daerah Bali dan Lombok.
Media
Media untuk memelihara isolat bakteri digunakan nutrien agar dengan komposisi ; 3 gr beef extract, 5 gr pepton, 20 gr bacto agar dan dipersiapkan dalam satu liter akuades. Untuk isolasi dan media produksi enzim amilase digunakan media YPSs cair dan padat dengan komposisi:
0,2% ekstrak khamir, 0,5% pepton, 0,3%
KH2PO4, 0,05% MgSO4. 7H2O, 0,01%
CaCl2.2H2O, 20 gr agar dan 2% pati terlarut sebagai sumber karbon (Mangunwardoyo et al., 1982).
Isolasi dan seleksi isolat penghasil amilase
Isolasi dilakukan setelah tampak adanya pertumbuhan masing-masing contoh yang diinokulasikan dan diinkubasikan selama dua hari pada suhu kamar dalam medium selektif (YPSs cair yang mengandung 2% pati terlarut).
Bakteri yang tumbuh diisolasi dengan menginokulasikan beberapa tetes dari medium cair tersebut pada permukaan media YPSs padat. Setiap isolat murni dipelihara dalam media nutrien agar miring. Seleksi terhadap kemampuan isolat dalam menghasilkan amilase dilakukan
secara kualitatif, semi-kuantitatif dan kuantitatif.
Pengujian aktivitas amilase secara kualitatif dan semi kuantitatif dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat-isolat bakteri pada permukaan media agar YPSs.
Satu ose biakan bakteri yang berumur tiga hari ditumbuhkan pada permukaan media agar YPSs, kemudian inkubasikan selama dua hari pada suhu kamar. Adanya aktivitas amilase terlihat dengan munculnya zona bening disekitar koloni setelah dituang dengan larutan iodine.
Hasil bagi antara diameter zona bening dan diameter koloni dinyatakan sebagai aktivitas enzim secara nisbi.
Pegujian aktivitas amilase
Setengah ml larutan enzim ditambahkan kedalam 0,5 ml substrat ( 2% pati terlarut dalam 0.05 M larutan bufer fosfat, pH 7), kemudian di- inkubasikan pada suhu 40oC selama 10 menit. Produk yang terbentuk berupa gula reduksi (glukosa) diukur dengan metoda Bernfeld. (1955) menggunakan asam 3,5 dinitrosalisilat (DNS) dan konsentrasinya dikonversikan dengan standar glukosa.
Satu unit aktivitas amilase adalah banyaknya enzim yang dapat menghasilkan 1μg glukosa per menit per ml larutan enzim pada kondisi pengujian yang dilakukan.
Penentuan kondisi optimum aktivitas amilolitik
Menurut Gangrong et al. (1990) enzim amilase dapat diproduksi dari Bacillus cereus (isolat no. B3.2) dengan menggunakan media cair YPSs cair yang mengandung 2% pati terlarut. Starter dibuat dengan menambahkan akuades steril kedalam biakan berumur 5–7 hari, sehingga diperoleh suspensi yang mengandung spora dengan kepekatan optik 0,5 pada panjang gelombang 540 nm.
Sebanyak 2,5 % suspensi diinokulasikan kedalam media produksi dan selanjutnya
diinkubasikan pada suhu kamar. Setelah dua hari inkubasi, enzim amilase diekstraksi dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama lima menit, dan larutan enzim yang diperoleh diuji aktivitas amilolitiknya.
Untuk melihat pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase (amilolitik), pengujian dilakukan dalam larutan buffer pada (pH 4 – 10). Larutan buffer yang digunakan adalah 0,05 M buffer asetat (pH 4 – 6), 0,05 M buffer fosfat (pH 6 – 8) dan 0,05 M buffer Atkins dan Pantin (pH 9 – 10).
Stabilitas enzim amilase terhadap pH ditentukan dengan cara mengin- kubasikan larutan enzim selama satu jam dalam larutan buffer pada pH yang bervariasi ( 4 – 10), yaitu sebanyak 0,25 ml larutan enzim ditambahkan kedalam 0,25 bufer (0,01 M, pH 4 – 10), diinkubasikan pada suhu 4oC selama satu jam, selanjutnya ditambahkan 0,5 ml substrat (2% pati terlarut dalam 0,05 M buffer fosfat, pH 7). Aktivitas enzim amilase tersisa diuji sesuai dengan standar pengujian dan nilainya dinyatakan dalam persen terhadap aktivitas enzim tanpa perlakuan.
Pengaruh suhu terhadap enzim amilase diuji dengan cara mengukur aktifitasnya pada berbagai macam suhu yang berkisar antara 35 - 70oC. Stabilitas enzim amilase terhadap suhu diukur dengan cara menginkubasikan larutan enzim selama 10 menit pada variasi suhu (35 – 70oC). Segera setelah inkubasi larutan enzim didinginkan dengan cepat dan aktivitas enzim amilase yang tersisa diukur dengan cara yang sama dan nilainya dinyatakan dalam persen terhadap aktivitas enzim tanpa perlakuan.
Penentuan konstanta kinetika reaksi Aktivitas enzim dilakukan pada kondisi optimumnya (pH 7,0, suhu 40oC dan waktu inkubasi 10 menit) dengan variasi konsentrasi substrat (pati terlarut)
mulai dari 0,2%–2,0%. Nilai dari aktivitas enzim yang didapat diplotkan ke dalam kurva Michaelis-Menten. Uji kurva hubungan antara 1/(s) dan 1/(v), dilakukan untuk menghitung tetapan Michaeles- Menten (Km) enzim.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil isolasi dan seleksi
Sebanyak 21 isolat bakteri telah diisolasi dengan cara menginokulasikan masing-masing contoh kedalam medium selektif (YPSs cair yang mengandung 2% pati terlarut). Setelah diinkubasikan selama dua hari pada suhu kamar, bakteri yang tumbuh diisolasi dengan cara menumbuhkan beberapa tetes media mengandung sample tersebut pada permukaan media YPSs padat. Setiap isolat murni dipelihara dalam media miring nutrient agar.
Hasil pengujian secara kualitatif menunjukkan bahwa sebanyak 18 isolat memiliki aktivitas amilolitik, yang ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni setelah dituangi larutan iod. Selanjutnya isolat-isolat yang menunjukkan positif aktivitas amilolitik secara kualiatatif diukur secara semi- kuantitatif dengan cara membandingkan diameter zona bening disekitar koloni dengan diameter koloni setelah dituangi larutan iod (Tabel 1.).
Hasil penghitungan secara semi- kuantitatif menunjukkan terdapat delapan isolat memiliki diameter zona bening (aktivitas amilase relatif) dengan nilai >2 dan tiga belas isolat degan nilai antara 1 – 2. Isolat-isolat yang mempunyai aktivitas amilase cukup tinggi umumnya berasal.
dari produk makanan/ minuman hasil fermentasi, tiga diantaranya berasal dari brem Bali, dan satu dari brem Lombok, yaitu makanan fermentasi yang dibuat dengan menggunakan beras ketan sebagai bahan dasarnya. Isolat lainnya yang mempunyai aktivitas amilase yang cukup
Tabel 1. Hasil pengujian aktivitas amilase secara kualitatif dan semikuantitatif
Isolat
Uji kualitatif (zona bening)
Uji semi kuantitatif (Diameter zona
bening/koloni)
Asal biakan
B3.1 _ _ Bahan Baku Brem, Bali
B3.2 +++ 2,64 “
B3.3 +++ 2,06 “
B3.4 +++ 2,63 “
B3.5 ++ 2,25 “
SKL ++ 2,15 Susu kuda liar, Lombok
BL ++ 2,10 Brem, Lombok
TL ++ 2,98 Tuak Lontar, Lombok
TL.1 + 1,1 “
AM _ _ Anggur Merah, Bali
AP + 1,71 Air Panas, Bali
AP.1 + 1,25 “
TM.1 + 1,2 Terasi Mono, Bali
TM.2 _ _ “
TK ++ 2,4 Tanah Kapur, Bali
TU.1 +++ 1,5 Terasi Udang, Bali
TU.2 +++ 1,71 “
AL.1 +++ 1,8 Air Laut, Bali
AL.2 ++ 1,7 “
Tl. 2 ++ 1,8 Tuak Lontar, Lombok
TL.3 ++ 1,6 “
Keterangan : +++ Diameter zona bening besar ++ Diameter zona bening sedang
+ Diameter zona bening kecil - Tidak ada zona bening
tinggi masing-masing adalah satu isolat yang diisolasi dari tuak lontar Lombok, susu kuda liar Bali, dan tanah kapur Bali.
Isolat yang secara semikuantitatif memiliki aktivitas amilase cukup tinggi (nilai relatif >2), selanjutnya diuji kemampuan amilasenya secara kuantitatif.
Uji aktivitas secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim amilase filtrat biakan dengan menggunakan media YPSs cair mengandung 2% pati terlarut sebagai bahan penginduksi. Hasil pengujian menunjukkan bahwa B. cereus (isolat B3.2) mempunyai kemampuan amilase tertinggi yaitu sebesar 54,19 x 102 U/ml,
sedangkan isolat lainnya memiliki aktivitas amilase yang berkisar antara 12,60 x 102 U/ml – 33,72 x 102 U/ml, tergantung dari jenis serta sumber isolatnya (Tabel. 2).
Hasil pengamatan terhadap pati yang tersisa dalam media menunjukkan bahwa setelah 24 jam inkubasi, sembilan dari seluruh isolat yang ditumbuhkan dalam media mengandung 2% pati, mampu menggunakan semua pati terlarut yang tersedia dalam medium, ditandai dengan hasil reaksi yang negatif terhadap larutan iod. Dari hasil tersebut dapat diperkirakan bahwa salah satu jenis enzim amilase yang dimiliki oleh isolat tersebut
adalah amiloglukosidase yang dapat menghasilkan glukosa sebagai produk akhirnya. Akan tetapi tiga isolat lainnya tidak menggunakan semua pati yang tersedia dalam medium secara optimal.
Hasil identifikasi menunjukkan bahwa hampir semua isolat yang diuji termasuk kedalam genus Bacillus (Tabel 3).
Penentuan kondisi optimum ekstrak kasar amilase dari isolat B. cereus B3.2
Untuk mempelajari beberapa karakter amilase kasar, maka isolat B.
cereus B3.2 dengan aktivitas amilase tertinggi dipilih untuk pengujian berikutnya. Pada penentuan optimasi aktivitas enzim amilase kasar dilakukan uji menggunakan variasi suhu (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 dan 70 oC) dan hasilnya dapat dilihat pada Gambar..1.
Aktivitas amilase tertinggi adalah pada suhu 55oC yaitu sebesar 85,87 x 102 U/ml. Aktivitas enzim mulai menurun
ketika suhu dinaikkan hingga mencapai 70oC. Tampaknya bahwa suhu optimum untuk berlansungnya reaksi enzimatis adalah pada suhu 40 - 50oC, sebagai indikasinyya bahwa enzim relatif stabil setelah diinkubasikan selama 10 menit pada kisaran suhu tersebut. Enzim amilase sedikit kehilangan aktivitasnya pada suhu 60oC. dan hampir kehilangan semua aktivitasnya pada suhu 70oC. Menurut laporan Nikolov dan Reilly (1993) enzim α-amilase dari B. substilis mencapai aktivitas optimum pada suhu 50 oC.
Pengaruh pH terhadap aktivits amilase kasar B. cereus diuji dengan mereaksikan larutan enzim pada berbagai pH selama 10 menit, hasilnya dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa apabila reaksi enzimatis amilase dilakukan dalam 0,05 M fosfat bufer, maka aktivitas amilase tertinggi adalah pada pH 7.0 yaitu sebesar 53,53 x 102 U/ml dan aktivitas optimum berada pada kisaran pH 5,0 – 7,0, yaitu pa-
Tabel 2. Hasil uji aktivitas amilase isolat-isolat bakteri secara kuantitatif Isolat Aktivitas amilase
(x 102 U/ml)
Uji kualitatif pati yang tersisa dalam medium
B3.2 54,19 -
B3.3 27,12 -
B3.5 25,80 -
SKL 26,46 +
BL2 27,12 -
TL.2 12,60 +
AP 24,48 +/-
TM 19,86 -
TK 24,48 -
TU.2 33,72 -
AL.2 20,52 -
TL.1 21,84 +-
TL.3 31,74 -
Keterangan : - Tidak ada pati yang tersisa + Pati yang tersisa sedikit +- Pati yang tersisa sangat sedikit
Tabel 3. Hasil identifikasi isolat-isolat bakteri
No Kode sampel Genus/ Species
1 TM Bacillus cereus
2 AL Bacillus pumilus
3 B3.2 Bacillus cereus
4 B3.3 Bacillus polymixa
5 B3.5 Bacillus stearothermophillus
6 TU Bacillus sp.
7 TK Bacillus substilis
8 AP Bacillus cereus
9 BL Bacillus substilis
10 SKL Bacillus cereus
11 TL.1 Staphylococcus
12 TL.2 Bacillus cereus
13 TL.3 Bacillus cereus
Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan
………… stabilitas amilase
0 20 40 60 80 100 120
35 40 45 50 55 60 65 70
Suhu (oC) Akt. amilase (x102 U/mL)
0 20 40 60 80 100 120
Stabilitas enzim (%)
Akt. relatif enzim Akt. enzim
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas amilase
da suasana yang sedikit asam sampai netral, hasil ini hampir sama dengan aktivitas α-amilase B. substilis yang mencapai aktivitas optimum pada pH 7 (Nikolov dan Reilly, 1993). Enzim amilase kelihatannya relatif stabil terhadap perubahan pH pada kisaran tersebut.
Pemilihan sumber karbon yang tepat sangat diperlukan untuk mendapatkan hasil yang maksimal, karena selain sebagai sumber karbon amilum juga merupakan induktor untuk sekresi amilase.
Pengaruh berbagai jenis tepung komersial pada produksi amilase dari B. cereus menunjukkan bahwa dari 5 jenis tepung yang digunakan tepung beras ketan dan tepung beras merupakan sumber karbon yang sangat baik untuk media produksi amilase.(Tabel..4). Aktivitas amilase yang dihasilkan dalam media mengandung tepung beras ketan dan tepung beras
masing-masing adalah sebesar 377,50 x 102 U/ml dan 301,55 x 102 U/ml, yang dihasilkan setelah 44 jam inkubasi. Pati yang tersedia dalam media (baik tepung beras ketan maupun tepung beras) telah habis terhidrolisa menjadi gula pereduksi yang ditunjukkan dengan reaksi negatif terhadap larutan iod. Dalam media mengandung tepung maizena aktivitas amilase yang dihasilkan sebesar 85,89 x 102 U/ml yang juga dihasilkan setelah 44 jam inkubasi. Aktivitas amilase paling rendah diperoleh apabila bakteri ditumbuhkan pada media yang mengandung pati terlarut sebagai sumber karbon.
Aktivitas amilase yang berbeda- beda pada masing-masing substrat, kemungkinan disebabkan oleh perbedaan komposisi masing-masing tepung. Pati (tepung) mengandung dua polimer gluko- 0
20 40 60 80 100 120
5 5.5 6 7 8 9 10
pH Akt. amilase (x102 U/mL)
0 10 20 30 40 50 60
Stabilitas enzim (%)
Aktivitas relatif amilaase Aktivitas amilase
Tabel 4. Pengaruh sumber karbon pada produksi amilase Bacillus cereus No. Sumber
karbon
Aktivitas amilase
X 102 U/ml Sisa pati
18 jam 44 jam 18 jam 44 jam
1 Pati terlarut 18,50 48,77 +- -
2 Maizena 36,36 85,89 ++ ++
3 Tapioka 58,81 186,86 +- -
4 Beras ketan 79,27 377,50 + -
5 Beras 107,65 301,55 ++ -
sa yaitu amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan polimer rantai lurus dari unit- unit D-glukosa atau disebut juga soluble starch yang saling berikatan melalui ikatan -1,4, sedang amilopektin merupakan polimer dengan rantai bercabang yang terdiri dari residu glukosa pada bagian luar yang dapat diuraikan oleh α-amilase dan struktur limit dektrin pada bagian tengah yang tertinggal setelah α- amilase melepaskan semua residu glukosa.
Amilosa bersifat sedikit larut dalam air dan amilopektin larut dalam air. Aktivitas enzim untuk menghidrolisa pati dipengaruhi oleh tipe dan keadaan granula.
Menurut Priest (1984) sekitar 75% – 85%
bagian pati (tergantung dari jenisnya) tersusun oleh amilopektin, pati beras terdiri dari 89% amilosa dan 11%
amilopektin. Besarnya aktivitas amilase sebanding dengan laju hidrolisis pati, dan terjadi lebih cepat pada rantai lurus. Laju hidrolisis amilosa oleh amilase lebih cepat dari pada laju hidrolisis amilopektin.
Aktivitas amilase yang dihasilkan dalam media mengandung tepung beras ataupun tepung ketan menginduksi pembentukan enzim amilase.
Konsentrasi gula reduksi hasil hidrolisis senyawa polimer media berpengaruh terhadap aktivitas amilase, apabila gula pereduksi untuk keperluan metabolisme sel sudah tercukupi, akan terjadi penghambatan produksi enzim, Rendahnya aktivitas amilase yang
dihasilkan dalam media mengandung pati terlarut diduga sebagai akibat dari tingginya kandungan gula pereduksi pada awal proses fermentasi.
Hasil pengamatan terhadap aktivitas amilase kasar serta sumber karbon yang digunakan diduga bahwa B.
cereus mempunyai kemampuan menghasilkan lebih dari satu macam amilase salah satu diantaranya α-amilase.
Menurut Alam et al. (1989), mikroorga- nisme dapat menghasilkan lebih dari satu macam amilase pada saat yang bersamaan.
Karakter enzim amilase kasar dapat dilihat dari nilai konstanta kinetika reaksi.
Pengukuran aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi substrat dibuat grafiknya dan besarnya aktivitas secara kinetika diketahui dari harga Vm dan Km (Gambar 3).
Dari data pada Gambar 3 diketahui bahwa pada kondisi pengujian (pH 7,0; suhu 40oC; inkubasi 10 menit) nilai Vmax yang diperoleh adalah 89,36 U/ml/menit, dan Km 0,0036, atau dapat dikatakan bahwa pada saat kecepatan mencapai setengah kecepatan maksimum, konsentrasi substrat akan menunjukkan 0,0036. Untuk melihat karakter enzim yang lebih lengkap perlu dilakukan pemurnian, karena karakter suatu enzim sangat ditentukan oleh tingkat kemurniannya.
Gambar 3. Kurva antara kecepatan reaksi amilase kasar pada kondisi optimum dan variasi konsentrasi substrat
KESIMPULAN
Telah diisolasi tiga belas isolat bakteri penghasil amilase dari beberapa contoh mengandung mikroba yang berasal dari daerah Bali dan Lombok. Dalam medium mengandung pati terlarut, isolat Bacillus cereus B3.2 merupakan isolat penghasil amilase tertinggi dengan aktivitas sebesar 54,19 x 102 U/ml/menit yang dihasilkan setelah 44 jam inkubasi.
Isolat tersebut memiliki karakter biokimia α-amilase, aktivitas amilase yang dihasilkan relatif stabil pada kisaran suhu 40- 50oC dan pH 5,0 – 7,0. Tepung beras dan tepung ketan merupakan sumber C (bahan penginduksi) yang baik untuk digunakan sebagai media produksi amilase, aktivitas amilase dalam media ketan adalah 377,50 x 102 U/ml dan pada tepung beras adalah 301 x 102 U/ml.
Berdasarkan penghitungan. kinetika reaksi diketahui bahwa filtrat biakan B. cereus mengandung amilase dengan Km dan Vm masing-masing 0,0036% dan 89,36 x 102
U/ml/menit (kondisi pH 7,0; suhu 40oC;
inkubasi 10 menit).
DAFTAR PUSTAKA
Alam, R., Y. Teramoto, and S. Hayashida.
1989. Characteristic of raw starch digestible saccharifying α-amylase from Bacillus substilis 3018.
Annual report of ICBiotech, Osaka University, Osaka, Japan
Bernfeld, O. 1955. Amylases. In: S. P.
Colowick and N.O. Kaplan (Ed.), Methods in Enzymology 1.
Academic Press, New York. p.
149.
Fogarty, W..M. and T. Kelly. 1980.
Amylases, amyloglucosidases and related gluconases in economy microbiology. In: A.H. Rose (Ed.), Microbial enzymes and bioconversions vol. 5. Academic Press, London
y = 0.00004x + 0.01119 R2 = 0.93032
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
0 100 200 300 400 500 600
1/S
1/V
Frazier, W.C. and D.C. Westhoff. 1981.
Food Microbiology. Tata Mc GrawHill Pub. Co. New Delhi.
Gangrong, X., S. Lee, M. Takagi, M.
Morikawa, and T. Inagaki. 1990.
Cloning in Bacillus substilis of thermostable and alkalophilic amylase from a thermophilic Bacillus sp. Annual report of IC.
Biotech, Osaka University, Osaka.
Japan.
Kinoshita, S., V. Sangpituk, D. Rodpaya, N. Nilubol, and H. Taguchi. 1982.
Hydrolysis of Starch by Immobilized Cells and by Enzymes of Aspergillus oryzae and Rhizopus sp. IC Biotech. Vol 5.
Mangunwardoyo, W., M. Takano, and I.
Shibasaki. 1982. Preservation and
Utilization of a concentrated seed culture for bacterial amylase production. Annual reports of ICME, vol.5, Osaka Universioty, Osaka, Japan.
Nigam P. and D. Singh. 1995. Enzyme and microbial system invold in starch processing. Enzyme Microb Technol 17: 770-778.
Nikolov Z. and P.J. Reilly. 1993.
Enzymatic depolymerization of starch. In: Dordick, J.S. (ed.), Biocatalysists for industry. New York; Plenum. . p. 37-62
Priest, F.G. 1984. Extracellular Enzymes.
Van Nostrand Reinhold Co.Ltd.
London.
