BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Unggas merupakan salah satu sumber produksi ternak yang memiliki peran penting di dunia karena termasuk sumber protein hewani. Meski demikian, terdapat ancaman seperti adanya penyakit yang dapat menurunkan produksi unggas. Penyakit merupakan faktor penting yang mempengaruhi produksi unggas, terutama penyakit yang bersifat infeksius. Penyakit infeksius pada unggas yang diakibatkan oleh infeksi virus dapat menyebar secara luas dalam waktu singkat.
Salah satu penyakit infeksius pada unggas yang paling umum dan merugikan karena mempengaruhi produksi unggas adalah penyakit Newcastle disease (ND).
Penyakit ND disebabkan oleh virus dari genus Avulavirus, umumnya dikenal sebagai virus ND yang disingkat dengan (APMV-1) (Afonso et al., 2016).
Penyakit ND dapat menyerang saluran pernafasan serta pencernaan, virus yang bersifat patogen pada unggas ini pertama kali ditemukan di Pulau Jawa pada tahun 1926 (Quinn et al., 2011). Menurut Organisasi Kesehatan Hewan Dunia/OIE (2018) penyakit ND menjadi masalah di seluruh dunia yang bersifat merugikan.
Choi et al (2014) melaporkan wabah ND yang telah terjadi di Asia khususnya Vietnam memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan isolat dari Indonesia, Malaysia dan Kamboja. Penyakit ND di Indonesia sendiri bersifat endemis. Hal tersebut ditunjukkan dengan ditemukan kasus ND sepanjang tahun di berbagai daerah seperti isolasi galur velogenik pada wabah di Bali tahun 2007
yang termasuk ke dalam genotipe VII berdasarkan analisis filogenetiknya (Adi et al., 2010).
Kasus ND di Jawa Barat tahun 2013 menunjukkan karakteristik yang beragam, dua isolat bersifat mesogenik, satu isolat bersifat lentogenik dan satu isolat lainnya bersifat velogenik, sedangkan tahun 2015 ditemukan kasus yang bersifat ganas (mesogenik/velogenik) (Emilia dkk., 2015; Panus dkk., 2015).
Wibowo dkk (2012) melaporkan kasus ND yang terjadi di lapangan termasuk ke dalam virulensi yang bersifat lentogenik, mesogenik dan velogenik.
Hasil penelitian Darniati dkk (2015) melaporkan keragaman antigenik virus ND yang terjadi di Aceh. Daerah lainnya seperti Jawa Tengah dan Jawa Timur juga melaporkan kasus ND (Putri et al., 2017; Kurnianingsih dkk., 2015).
Menurut Xiao et al (2012) pada tahun 2009 dan 2010 wabah ND yang terjadi di Indonesia menyebabkan tingkat kematian sebesar 70-80%.
Kerugian yang disebabkan oleh wabah ND selain dapat menghambat produksi peternakan, juga menimbulkan kerugian lain seperti tindakan depopulasi dan biaya penanggulangan yang sangat besar untuk melakukan tindakan biosekuriti dan sanitasi terhadap lingkungan yang telah tercemar oleh virus.
Menanggulangi kejadian penyakit ini, telah dilakukan program vaksinasi diantaranya menggunakan vaksin aktif maupun inaktif. Namun, virus ND masih sering diisolasi dari unggas yang telah divaksinasi (Liu et al., 2009; Putri et al., 2017). Vaksin aktif diketahui memiliki kemampuan untuk menginduksi respon kekebalan yang efisien secara kuat dengan pemberian single dose, namun ternyata
vaksin ini memiliki kelemahan yaitu tidak mampu mengatasi replikasi virus yang bersifat heterolog (Roohani et al., 2015).
Vaksinasi secara intensif yang didukung dengan perbaikan tatalaksana pemeliharaan ayam merupakan tindakan yang dilakukan sebagai upaya mencegah terjadinya wabah penyakit ND di Indonesia. Program vaksinasi ND yang dilakukan di Indonesia diantaranya menggunakan vaksin aktif dan inaktif.
Vaksinasi menggunakan kombinasi antara vaksin aktif dan inaktif terbukti lebih efektif melindungi ayam dibandingkan pemberian vaksin hanya dengan salah satu jenis vaksin (Wibowo dan Amanu, 2010).
Vaksin aktif-lentogenik misalnya strain LaSota, Hitchner, V6/GA, Ulster, VH, HB1 dan V4) sebagai jenis vaksin yang paling umum digunakan. Vaksin aktif-lentogenik dapat diberikan melalui air minum, spray (aerosol), tetes (mata atau hidung). Vaksin lain yang telah dipasarkan adalah vaksin aktif-mesogenik (Komarov dan Roakin) yang diberikan dengan cara injeksi pada kulit di bawah sayap dan vaksin galur velogenik seperti ITA dan G7 (ASOHI, 2014). Meskipun vaksinasi rutin diberikan pada ayam komersial di Indonesia, tetapi ND menjadi masalah di industri unggas.
Beberapa penelitian menyebutkan vaksinasi dengan genotipe virus yang heterolog dengan virus lapang masih dapat merangsang pembentukan titer antibodi, namun risiko shedding virus ketika unggas terinfeksi masih dapat terjadi (Hu et al., 2011; Miller et al., 2013; Zhu et al., 2016) dan dapat menyebabkan unggas tersebut berfungsi sebagai reservoir (Rehmani et al., 2015).
Perubahan dari virus antara lain adanya perubahan struktur antigenik yang dapat terjadi karena adanya mutasi-mutasi yang berperan mengekspresikan protein virus dapat menyebabkan kegagalan vaksinasi, sehingga menjadi pertimbangan dalam menggunakan vaksin komersial yang sudah ada dan mendorong untuk mempersiapkan vaksin yang lebih baru (Mohamed et al., 2011).
Tindakan vaksinasi yang menggunakan vaksin homolog dapat meningkatkan respon imun yang terbentuk dan mengurangi terjadinya shedding virus dibandingkan dengan vaksin heterolog (Miler et al., 2013). Shedding virus yang memungkinkan terjadinya resirkulasi virus ke lingkungan dapat menyebabkan virus mengalami mutasi dan mengakibatkan perubahan adaptif terhadap respon imun (Perozo et al., 2012).
Spesies unggas baik unggas liar maupun unggas peliharaan dapat terinfeksi virus ND (OIE, 2015). Waterfowl atau unggas air golongan Anseriformes seperti itik, entok dan angsa diketahui dapat menjadi reservoir alami dari virus ND galur avirulent (OIE, 2012). Itik dapat menjadi reservoir alami virus ND karena berpotensi sebagai sumber penyebaran dan penularan virus pada unggas di sekitarnya meskipun tidak menunjukkan gejala klinis (Miller and Koch, 2013).
Virus ND galur avirulent (lentogenik) umumnya menimbulkan gejala klinis yang ringan atau tanpa gejala. Itik dapat terinfeksi dan menyebarkan virus namun tidak menunjukkan tanda-tanda klinis (Cattoli et al., 2011). Berdasarkan hasil penelitian Anis et al (2013) menunjukkan bahwa unggas air memiliki respon IFNβ yang dirpoduksi oleh sel sel imun (monosit, makrofag, NK sel, dan
neutrofil) lebih cepat dibandingkan unggas lainnya sehingga dapat mengurangi replikasi virus di dalam sel yang terinfeksi dan tidak menimbulkan gejala klinis.
Respon tersebut tidak dapat mencegah terjadinya shedding virus ke lingkungan (Rehman et al., 2018). Penyebaran penyakit ND dapat terjadi secara kontak langsung dari itik yang terinfeksi ke unggas sehat lainnya melalui feses yang diekresikan oleh itik yang terinfeksi.
Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan strain virus ND galur lentogenik yang bersifat original atau bukan berasal dari virus vaksin yang dapat digunakan sebagai seed vaksin ND yang diawali dengan isolasi dan identifikasi secara molekuler. Bahri dkk (2005) menyatakan bahwa melakukan penelitian dengan mengembangkan vaksin ND yang memanfaatkan isolat lokal adalah salah satu strategi yang dilakukan untuk pengembangan vaksin ND di Indonesia karena isolat lokal memiliki keunggulan kompetitif dan komparatif dalam mengatasi penyakit ND di Indonesia.
Karakterisasi molekuler adalah suatu metode pendekatan untuk menentukan karakter molekuler yaitu asam nukleat (DNA atau RNA). Terdapat berbagai macam metode untuk menentukan karakter molekuler, antara lain hibridisasi DNA, analisis fragmen DNA, sidik jari DNA dan sekuensing asam nukleat. Sekuensing asam nukleat merupakan teknik penentuan urutan basa nukleotida suatu asam nukleat. Perbandingan sekuen gen dapat digunakan sebagai dasar klasifikasi suatu organisme (Qunit et al., 2015).
Terdapat dua pendekatan karakterisasi molekuler untuk mendapatkan virus yang bersifat original yaitu analisis homologi untuk mengetahui persamaan
(similarity) dan analisis phylogenetic atau hubungan kekerabatan yang dapat menunjukkan kedekatan hubungan suatu virus dengan virus lainnya yang diturunkan dari satu sumber virus yang sama berdasarkan susunan sekuen dari gen pengkode protein suatu virus. Triosanti et al (2018) dalam penelitiannya menjelaskan bahwa karakterisasi molekuler virus ND berdasarkan fragment gen pengkode protein HN yang diisolasi dari peternakan ayam komersial yang berasal dari Jawa Tengah dan Sumatra ditemukan nilai homologi sebesar 91,2-91,7%, serta hasil analisis filogenetik menunjukkan kedekatan isolat tersebut dengan beberapa isolat asal Indonesia lainnya seperti (Banjarmasin (HQ697254), Gianjar (HQ697257), Kudus (HQ697259) dan Sragen (HQ697258)) dan Pakistan.
Genom virus ND mempunyai enam “Open Reading Frames” mengkode enam protein yang berbeda (Munir et al., 2012). Gen-gen tersebut tersusun dengan urutan 3-NP-P-M-F-HN-L-5, nukleoprotein (NP), fospoprotein (P), matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN), large RNA polymerase (L) (Chambers et al., 1986; Paldurai et al., 2014). Selain itu terdapat protein (V) dan (W) yang dihasilkan dalam gen P selama proses transkripsi mRNA dengan penambahan basa guanin (Steward et al., 1993).
Protein fusion (F) adalah glikoprotein permukaan yang memiliki prekursor F0 (66 kDa) yang akan dibelah oleh enzim protease dari sel inang menjadi dua sub unit yaitu N-terminal F2 (12,5 kDa) dan C-terminal F1 (55 kDa) (Nagai et al., 1989; Samal et al., 2012). Pembelahan protein F merupakan prasyarat untuk masuknya virus dan fusi sel virus ke sel host. Fusi pada protein F dipengaruhi oleh heptad repeat (HR) di daerah F1 yaitu HR1 yang berdekatan dengan fusion
peptide dan HR2 yang berdekatan dengan transmembrane (TM), serta HR3 yang terdapat di daerah F2 (Samal et al., 2012).
Urutan asam amino pada motif pembelahan protein F adalah faktor penentu utama patogenisitas virus (Kim et al., 2013). Virus lentogenik mempunyai motif single basic amino acid pada F cleavage site 112G/E-K/R-Q- G/E-R116 dan L (leucine) pada residu 117 dan dapat dibelah oleh enzim protease seperti tripsin yang ditemukan pada saluran pencernaan dan pernafasan (Choi et
al., 2010). Sedangkan virus mesogenik dan velogenik mempunyai motif multiple basic amino acid (arginine atau lysine) pada F cleavage site 112R/K-R-Q/K/R- K/R-R116 dan F (phenylalanine) pada residu 117 dan dapat dibelah secara intraseluler oleh enzim protease seperti furin yang terdapat di berbagai jaringan inang, sehingga mampu mengakibatkan infeksi sistemik yang fatal (OIE, 2012).
Virulensi virus ND tergantung pada asam amino arginin posisi 112 dan 115 serta asam amino phenylalanin pada posis 117 (Hines and Miller, 2012). Oleh sebab itu protein F merupakan molecular pathotyping berdasarkan susunan asam amino pada daerah cleavage site.
Protein matrix (M) memiliki panjang 1095 nukleotida menyandi 364 asam amino. Protein ini berikatan dengan permukaan bagian dalam membran virus yang merupakan protein paling banyak di virion (Samal, 2012). Fungsi dari protein M adalah mengumpulkan semua komponen virus pada membran plasma sel yang terinfeksi sehingga menyebabkan virion budding dan fungsi lain dari protein ini dapat berinteraksi dengan cytoplasmic tails dari glikoprotein (protein HN dan F) serta nukleokapsid yang dapat menginisiasi perakitan dan pembentukan virus
(Samal, 2012). Protein M merupakan protein yang bersifat conserved diantara paramyxovirus lainnya yang dibuktikan dengan sedikitnya substitusi asam amino akibat mutasi yang terjadi pada urutan basanya (Ganar et al., 2014). Seal et al (2000) menggunakan sifat conserved gen pengkode protein M sebagai dasar untuk mengklasifikasikan virus ND yang diisolasi dari lokasi geografis yang berbeda.
Sifat yang conserved dari suatu protein virus juga dapat digunakan untuk mengetahui asal usul virus (Holmes, 2011).
Berdasarkan uraian tersebut peneliti tertarik untuk melakukan penelitian mengenai karakteristik molekuler dengan menentukan homologi dan hubungan kekerabatan atau phylogenetic berdasarkan gen pengkode protein M dan F virus ND dari itik untuk mendapatkan isolat yang bersifat original sebagai kandidat seed vaksin ND yang merupakan tahap awal dari pengembangan vaksin.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:
1. Bagaimana karakteristik virus ND yang diisolasi dari isolat lokal pada itik menggunakan RT-PCR berdasarkan gen pengkode protein M dan F?
2. Bagaimanakah susunan asam amino pada daerah cleavage site gen pengkode protein F virus ND isolat lokal pada itik?
3. Berapa tingkat homologi nukleotida gen pengkode protein M dan F virus ND dari itik isolat lokal dibandingkan dengan virus vaksin yang digunakan di Indonesia dan virus lainnya yang terdapat pada GenBank?
4. Bagaimana kekerabatan genetik antara virus ND pada itik isolat lokal dengan virus ND yang ada pada GenBank berdasarkan gen pengkode protein M dan F dari virus ND.
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menjelaskan karakter molekuler virus ND yang bersifat original berdasarkan gen pengkode protein M dan F yang berasal dari isolat lokal pada itik.
1.3.2 Tujuan Khusus
1. Menentukan karakteristik virus ND menggunakan RT-PCR berdasarkan gen pengkode protein M dan F yang diisolasi dari isolat lokal pada itik.
2. Menjelaskan susunan asam amino pada daerah cleavage site gen pengkode protein F virus ND isolat lokal pada itik.
3. Menentukan tingkat homologi nukleotida gen pengkode protein M dan F virus ND isolat lokal pada itik.
4. Menjelaskan hubungan kekerabatan genetik antara virus ND itik isolat lokal dengan virus ND yang ada pada GenBank berdasarkan gen pengkode protein M dan F dari virus ND.
1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat Teoritis
Hasil dari penelitian ini memberikan informasi ilmiah dalam perkembangan dunia Veterinary Science khususnya informasi genetik virus ND yang bersirkulasi di lapangan, asal virus dan perbandingan dengan strain virus yang telah beredar di berbagai daerah di Indonesia berdasarkan gen pengkode protein M dan F isolat lokal pada itik.
Data hasil sekuensing dapat dijadikan bukti ilmiah sebagai dasar dalam inovasi produksi vaksin sehingga mampu melawan serangan ND secara lebih efektif.
1.4.2 Manfaat Praktis
Diharapkan penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai acuan dalam pertimbangan untuk melakukan tindakan pengendalian dan pencegahan serta pengembangan industrial vaksin dengan pemanfaatan isolat lokal dari itik yang bersifat original sebagai kandidat seed vaksin ND.
