BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FST Universitas Airlangga pada bulan Maret sampai dengan bulan Juli 2012.
3.2 Rancangan Penelitian
Rincian perlakuannya adalah sebagai berikut:
Keterangan: (-) tidak ditambahkan
(+) ditambahkan media, kecepatan agitasi (rpm), volume biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) (3 mL) dan lama waktu agitasi (menit).
3.4 Bahan dan Alat Penelitian
3.4.1 Isolat bakteri penelitian
sebagai sumber penghasil enzim lipase dan Acinetobacter sp. P2(1) yang diisolasi oleh Ni’matuzahroh dkk. (2009) untuk memproduksi biosurfaktan adalah dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.
3.4.2 Bahan penelitian
a. Media pertumbuhan bakteri penghasil biosurfaktan dan crude enzyme Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), air mineral sintetis (AMS) komposisi dari Pruthi and Cameotra (1997), akuades, minyak goreng dan molase 4%.
b. Bahan kimia
(NH4)2 SO4, MgSO4. 7H2O, NaCl, CaCl2, MnSO4. H2O, H3BO3, ZnSO4. 7H2O, CuSO4. 5H2O, CoCl2. 6H2O, dan Na2MoO4. 2H2O, NaOH 10%, HCl 5%, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4.7H2O, alkohol, dan Tween-20. c. Bahan uji kelarutan oil sludge
Oil sludge, aluminium foil, cling wrap, kapas, kertas koran, kertas saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm, label, dan spiritus.
3.4.3 Alat penelitian
besi, spatula kaca, spektrofotometer (spectronic 20 Bausch-Lomb), tabung reaksi, tensiometer Du-Nouy, tip mikropipet, vortex dan waterbath.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Pembuatan media untuk bakteri
Sebanyak 2,8 gram NA dilarutkan ke dalam 100 mL akuades dan dipanaskan pada hot plate hingga mendidih. Kemudian media dituang ke dalam 20 tabung reaksi dimana masing-masing tabung diisi 5 mL NA sebagai stock NA miring. Tabung reaksi yang berisi NA selanjutnya disumbat dengan kapas dan ditutup dengan aluminium foil. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121º C, 1 atm, selama 20 menit. Tabung reaksi berisi NA yang telah disterilisasi selanjutnya dimiringkan dan didiamkan sampai media memadat (Renjana, 2011).
3.5.2 Pembuatan media air mineral sintesis
3.5.3 Pembuatan stok bakteri
Biakan murni Micrococcus sp. L II 61 dan Acinetobacter sp. P2(1) diperbanyak dalam media Nutrient Agar (NA) miring yang telah disiapkan untuk stok. Bakteri ditanam dengan metode gores (streak). Biakan bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang (27-30oC). Koloni yang tumbuh baik digunakan sebagai stok bakteri selama penelitian.
Gambar 9. Teknik peremajaan mikroba dengan metode streak (gores) pada tabung agar miring (Tortora et al., 2010)
3.5.4 Perbanyakan bakteri dalam Nutrient Broth
3.5.5 Produksi biosurfaktan
Botol kultur ukuran 500 mL diisi dengan 86,4 mL campuran Air Mineral Sintetis (AMS) dan 4% substrat molase (v/v), pH 7. Media disterilkan dengan autoclave. Kemudian ditambahkan 4,8 mL stok KH2PO4 dan K2HPO4, 4,8 mL stok FeSO4. 7H2O dan 4% starter bakteri Acinetobacter sp. P2(1) (4 mL) yang memiliki nilai OD= 0,5 pada λ= 650 nm sehingga total volume larutan adalah 60 mL. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 3 hari (Suciastuti, 2011).
3.5.6 Karakterisasi biosurfaktan
Kultur bakteri yang telah diinkubasi selama 3 hari ditanam dengan metode streak (gores) pada cawan Petri berisi media Nutrient Agar untuk mengetahui ada-tidaknya kontaminasi dari mikroba lain. Lalu, sel bakteri dipisahkan dari medium yang mengandung biosurfaktan dengan sentrifugasi (9000 rpm, 4oC, 15 menit). Supernatan hasil sentrifugasi dipisahkan dari peletnya dan dikarakterisasi dengan mengukur tegangan permukaan serta aktivitas emulsifikasi supernatan kultur menggunakan solar.
pengatur dibagian bawah alat hingga cincin dapat tercelup tepat pada permukaan cairan sampel. Setelah itu, alat pengatur yang ada disisi lain digerakkan hingga cincin terlepas dari sampel.
Nilai tegangan permukaan yang didapat adalah nilai skala pada saat cincin terlepas dari sampel (Ni’matuzahroh dkk., 2009). Nilai tegangan permukaan sampel dihitung menggunakan rumus. Akuades dan molase digunakan sebagai kontrol, dinyatakan dalam dyne/cm dan dilaporkan sebagai hasil rata-rata dari 3 ulangan, dengan menggunakan rumus:
r = ro x
Dimana:
r = tegangan permukaan sampel
ro = tegangan permukaan akuades pada to C
= tegangan permukaan sampel yang terbaca pada alat o = tegangan permukaan akuades yang terbaca pada alat
Penurunan nilai tegangan permukaan (>10 dyne/cm) menunjukkan bahwa bakteri tersebut berpotensi menghasilkan biosurfaktan.
Gambar 10. Tensiometer du-Nouy (Muna, 2011)
3.5.7 Produksi crude enzyme lipase
Media produksi crude enzyme lipase yang digunakan adalah media Nutrient Broth (13 g/L) yang ditambahkan dengan substrat minyak goreng sebanyak 2% (v/v). Sebanyak 100 mL media dimasukkan ke dalam masing-masing botol kultur ukuran 500 mL dan disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit (Suciastuti, 2011).
Sebanyak 5% (v/v) kultur Micrococcus sp. L II 61 dalam Nutrient Broth dengan nilai absorbansi 0,5 pada λ650 nm diinokulasikan ke dalam masing-masing botol kultur berukuran 500 mL yang telah berisi media produksi dengan volume 100 mL. Inkubasi dilakukan dalam shaker pada suhu ruang dengan agitasi 120 rpm selama 16 jam. Supernatan crude enzyme diperoleh dengan cara kultur disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm dalam suhu 4°C selama 15 menit.
(mN/m) serta aktivitas emulsifikasi (%) pada solar setelah 1 dan 24 jam (Pruthi and Cameotra, 1997).
3.5.8 Pengukuran aktivitas lipolitik crude enzyme lipase
Pengukuran tegangan permukaan (TP) (mN/m) crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy. Sedangkan, nilai aktivitas emulsi setelah 1 jam dan 24 jam pada solar diamati dengan mengukur tinggi fase emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali 100% (Pruthi and Cameotra, 1997).
3.5.9 Persiapan oil sludge dalam tabung reaksi untuk perlakuan
Oil sludge dipipet sebanyak 0,20 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang ditambahkan 7,80 mL larutan uji sehingga konsentrasi oil sludge dalam larutan uji sebesar 2,5% (v/v). Berat oil sludge ditimbang menggunakan timbangan analitik dan dicatat sebagai Wop.
3.5.10 Perlakuan
Penelitian ini termasuk ke dalam penelitian eksperimental yang terdiri atas 1 kontrol dan 8 perlakuan dengan rincian sebagai berikut :
Perlakuan 1 (A), yaitu 0,20 mL oil sludge + 7,80 mL akuades.
Kontrol (T), yaitu 0,20 mL oil sludge + 7,80 mL surfaktan sintetis Tween-20 pada konsentrasi sama dengan CMC.
Perlakuan 2 (B), yaitu 0,20 mL oil sludge + 7,80 mL biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1)
Perlakuan 4 (Eb), yaitu 0,20 mL oil sludge + 2 mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 + 5,80 mL akuades.
Perlakuan 5 (Ec), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 + 4,80 mL akuades.
Perlakuan 6 (BEa), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 1 mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 + 3,80 mL akuades.
Perlakuan 7 (BEb), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 2 mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 + 2,80 mL akuades.
Perlakuan 8 (BEc), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 3 mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 + 1,80 mL akuades.
3.5.11 Uji kelarutan oil sludge
Seluruh kelompok kontrol dan perlakuan yang masing-masing terdiri atas 3 ulangan, divortex pada suhu ruang (27—30oC) selama 15 menit. Oil sludge yang terlarut (dalam fase cair) lalu, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C sebanyak 5 mL. Kemudian supernatan didiamkan selama 15 menit sebelum difiltrasi. Pada perlakuan tanpa sentrifugasi, setelah divortex perlakuan didiamkan selama 15 menit kemudian difiltrasi. Kelarutan oil sludge diketahui dengan cara melakukan filtrasi atau penyaringan fase cair dari masing-masing perlakuan.
3.5.12 Filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan
Kertas saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm dan disiapkan untuk filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan. Kertas saring yang digunakan untuk filtrasi dibungkus dengan aluminium foil. Aluminium foil dan kertas saring dioven dengan suhu 50—55oC selama satu hari kemudian ditimbang dengan neraca analitik dan dicatat beratnya sebagai Wo. Sebanyak 1 mL sampel fase cair dari hasil sentrifugasi dituang ke dalam aluminium foil dengan kertas saring di dalamnya. Kelarutan oil sludge diukur dari oil sludge yang terpisah dan terperangkap dikertas saring tersebut.
Semua prosedur yang dilakukan ketika filtrasi fase cair dari kontrol dan perlakuan ini dilakukan secara bebas lemak.
Setiap perlakuan yang dilakukan dalam uji kelarutan oil sludge, selalu disertai dengan blanko. Blanko merupakan berat larutan Tween-20, supernatan biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan crude enzyme Micrococcus sp. L II 61 tanpa penambahan oil sludge yang diperlakukan sama seperti perlakuan lainnya. Berat kering blanko dari masing-masing perlakuan dicatat sebagai Wb.
3.5.13 Penghitungan nilai persentase kelarutan oil sludge
Nilai persentase kelarutan oil sludge dari masing- masing perlakuan dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Dimana:
Wot = berat oil sludge terlarut (g) Wb = berat blanko perlakuan (g) Wop = berat oil sludge perlakuan (g)
Sedangkan berat oil sludge terlarut dihitung menggunakan rumus berikut:
Dimana:
3.6 Analisis Data Penelitian
Data yang didapat dalam penelitian ini adalah karakteristik dari biosurfaktan dalam supernatan kultur Acinetobacter sp. P2(1), larutan produk kasar biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1), larutan surfaktan sintetis Tween-20 pada konsentrasi sama dengan CMC serta crude enzyme (ekstrak kasar) lipase Micrococcus sp. L II 61, yaitu nilai tegangan permukaan (TP) (mN/m) serta aktivitas emulsifikasi (AE) (%) terhadap solar setelah 1 jam dan 24 jam. Aktivitas enzimatik crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61. Serta data kelarutan oil sludge (%) oleh biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) konsentrasi sama dengan CMC dan atau crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61.
