BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya pada bulan Maret sampai dengan Juni 2012.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
3.2.1 Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Bahan Isolat Bakteri
Isolat yang digunakan adalah Acinetobacter sp. P2(1) dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga sebagai isolat penghasil penghasil bisurfaktan, dan sebagai isolat penghasil crude enzim lipase dari limbah rumah potong hewan daerah Pegirian, Surabaya yaitu Bacillus sp. LII63B.
2. Sampel Uji
3. Media dan Bahan Kimia
a. Media pertumbuhan bakteri
Media Nutrient Agar (NA) untuk menumbuhkan Acinetobacter sp. P2(1) dan Bacillus sp. LII63B, media Nutrient Broth (NB) untuk starter bakteri dan media produksi enzim lipase, sumber karbon untuk kultur bakteri dalam produksi biosurfaktan menggunakan limbah tetes tebu (molase), Pruthi and Cameotra mineral salts medium (AMS) untuk produksi biosurfaktan.
b. Bahan Kimia
Beberapa bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan media seperti AMS diantaranya yaitu CaCl2, CoCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, FeSO4.7H2O,
HCl, H3BO3, KH2PO4, K2HPO4, KOH, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, NaCl,
Na2CO3, Na2MoO4.2H2O, Na2HPO4, NaH2PO4, NaOH, NH4Cl, (NH4)2SO4,
ZnSO4.7H2O. Serta beberapa bahan kimia yang lazim digunakan dalam
penelitian mikrobiologi yaitu alkohol dan spirtus. c. Bahan Uji untuk Kelarutan oil sludge
Oil sludge, tween 20, akuades, minyak emersi, aluminium foil, cling wrap, agar powder, solar, kapas, kertas koran, kertas saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm, label, dan spiritus.
3.2.2 Alat penelitian
Exchanger, oven, waterbath, botol 250 ml dan 500 ml, vortex, kertas pH, spatula kaca, spatula besi, tabung cuvet, tabung falcon, tabung erlenmeyer, mikropipet (100 μM – 1000 µM), tip mikropipet, gelas ukur, jarum ose loop, corong plastik, gelas beaker, tabung reaksi, pipet volume, finn pipet, rak tabung reaksi, dan bunsen.
3.3 Prosedur Penelitian
Untuk melakukan penelitian kelarutan oil sludge oleh biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan variasi konsentrasi crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B, dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu;
3.3.1 Pembuatan stok bakteri uji
Biakan murni Acinetobacter sp. P2(1) dan isolat bakteri penghasil lipase Bacillus sp. LII63B dari limbah RPH diperbanyak dalam media NA (Nutrien Agar) miring yang telah dibuat dengan cara melarutkan NA (28g/L) dalam akuades, kemudian larutan media di masukkan kedalam tabung reaksi dan di sterilkan dengan autoclave pada suhu 121o tekanan 1 atm selama 20 menit,
kemudian setelah disterilkan, tabung yang berisi media NA dimiringkan ditunggu hingga media benar-benar padat. Media NA miring yang telah padat kemudian ditanami bakteri dan ditanamkan dengan menggunakan metode streak dan dinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang (27o-33oC). Koloni yang tumbuh
3.3.2 Pembuatan media AMS
Air mineral sintetis (AMS) yang digunakan merupakan komposisi dari Pruthi dan Cameotra (1997). Media ini dibuat dengan cara melarutkan (NH4)2 SO4
(3 g), MgSO4. 7H2O (0,2 g), NaCl (10 g), CaCl2 (0,01 g), MnSO4. H2O (0,001 g),
H3BO3 (0,001 g), ZnSO4. 7H2O (0,001 g), CuSO4. 5H2O (0,001 g), CoCl2. 6H2O
(0,005 g), dan Na2MoO4. 2H2O (0,001 g) ke dalam 900 mL akuades. Larutan
tersebut dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik dan pH larutan dinetralkan dengan penambahan KOH 10% atau HCl 5%. Kemudian disterilkan dan ditambah stok KH2PO4 (1 g) dan K2HPO4 (1 g) dalam 50 mL akuades beserta
stok FeSO4.7H2O (1 g) dalam 50 mL akuades setelah disterilkan secara terpisah.
3.3.3 Pembuatan kultur bakteri dalam media Nutirent Broth
Biakan bakteri Acinetobacter sp. P2(1) dan isolat Bacillus sp. LII63B di ambil dua ose kemudian ditanamkan ke dalam 50 mL media NB (Nutrient Broth) steril yang telah dibuat dengan melarutkan (13g/L) dalam akuades, kemudian di tuangkan ke dalam botol berukuran 250 mL dan disterilkan. Kultur bakteri dalam NB di inkubasi pada shaker incubator selama 24 jam pada suhu 27o-33oC,
selanjutnya kultur ditanam ke dalam media kultur masing-masing bakteri.
3.3.4 Produksi biosurfaktan
Botol kultur ukuran 500 mL diisi dengan 86,4 mL campuran air mineral sintetis dan 4% substrat molase (v/v), pH larutan harus 7. Media disterilkan dengan autoclave. Kemudian ditambahkan 4,8 mL stok KH2PO4 dan K2HPO4,
4,8 mL stok FeSO4. 7H2O dan 4% starter bakteri Acinetobacter sp. P2(1) yang
mL adalah 100 mL. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada suhu 28oC, 120 rpm selama 3 hari.
3.3.5 Uji produksi biosurfaktan
Kultur bakteri Acinetobacter sp. P2(1) yang telah diinkubasi selama 3 hari disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm, suhu 4oC, selama 15 menit untuk
memisahkan sel dari supernatan. Supernatan yang diperoleh diuji kemampuannya dalam memproduksi biosurfaktan dengan mengukur tegangan permukaan dan aktivitas emulsifikasi supernatan kultur.
a. Pengukuran tegangan permukaan supernatan kultur
Sebanyak 10 mL supernatan dari kultur bakteri Acinetobacter sp. P2(1) dimasukkan ke dalam cawan petri yang bersih dan bebas lemak. Pengukuran tegangan permukaan supernatan kultur dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy.
Mula-mula cawan petri ditempatkan pada meja sampel yang datar, cincin digantungkan pada pengait yang terdapat pada alat tersebut dan skala diatur pada angka 0. Kemudian, cawan petri berisi sampel dinaikkan perlahan-lahan dengan cara memutar alat pengatur di bagian bawah alat hingga cincin dapat tercelup tepat pada permukaan cairan sampel. Setelah itu, alat pengatur yang ada di sisi lain digerakkan hingga cincin terlepas dari sampel.
sebagai kontrol, dinyatakan dalam dyne/cm dan dilaporkan sebagai hasil rata-rata dari 3 ulangan, dengan menggunakan rumus:
r = ro x o = tegangan permukaan akuades yang terbaca pada alat
Penurunan nilai tegangan permukaan (>10 dyne/cm) menunjukkan bahwa bakteri tersebut berpotensi menghasilkan biosurfaktan (Francy et al. 1991).
b. Pengukuran aktivitas emulsifikasi
Aktivitas emulsifikasi diukur dengan menggunakan metode Suryatmana et al. (2006). Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 mL supernatan ditambah dengan 1 mL minyak uji. Minyak uji yang digunakan adalah solar. Kemudian campuran dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit, dan diamati aktivitas emulsifikasinya setelah 1 jam dan 24 jam.
Aktivitas emulsifikasi diamati dengan mengukur tinggi emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali 100% (Pruthi dan Cameotra, 1997).
% Emulsifikasi = X100%
3.3.6 Ekstraksi biosurfaktan dan penghitungan nilai CMC
digunakan untuk proses ekstraksi adalah ± 50 mL dimasukkan ke dalam gelas Beaker 100 mL dan direndam dengan penangas es kemudian diputar dengan menggunakan magnetic stirrer. Menurut penelitian sebelumnya oleh Fitria (2011), penambahan ammonium sulfat untuk mencapai kadar 60% jenuh dalam proses ekstraksi adalah 7,8 gram ammonium sulfat dalam 20 mL supernatan. Amonium sulfat dimasukkan secara perlahan agar terlarut dengan sempurna, kemudian setelah semua ammonium sulfat larut, proses homogenisasi tetap dilakukan selama 15 menit. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit untuk memisahkan produk dari supernatan. Selanjutnya pelet diliofilisasi dengan menggunakan freeze dryer hingga menjadi serbuk biosurfaktan yang digunakan untuk uji kelarutan oil sludge.
Kemudian dilakukan penghitungan nilai CMC untuk produk kasar biosurfaktan yang telah dihasilkan. Pembuatan 10 mL larutan induk dengan 0,2 g produk biosurfaktan, kemudian diukur nilai tegangan permukaannya dengan tensiometer Du Nouy.
Pengukuran dihentikan saat titik kritis tercapai, yaitu nilai tegangan permukaan larutan biosurfaktan tetap stabil. Titik kritis tersebut merupakan nilai CMC larutan biosurfaktan dan dinyatakan sebagai dyne/cm dengan satuan dari CMC dinyatakan dalam g/L.
3.3.7 Penentuan nilai aktivitas enzim lipase Bacillus sp. LII63B
(p-NPP). Kultur dengan umur 16 jam disentrifugasi pada 9.000 rpm dengan suhu 4º C selama 15 menit, sehingga terpisah antara supernatan dan suspensi sel. Supernatan yang diperoleh mengandung enzim lipase ekstraseluler.
Disiapkan tabung Eppendorf yang diisi 700 µl larutan p-NPP 0,503 mM dalam buffer fosfat pH 7.0. Kemudian ditambahkan 300 µl supernatan yang mengandung enzim lipase ekstraseluler. Campuran diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37º C selama 30 menit. Tabung Eppendorf diangkat dari waterbath lalu ditambahkan 100 µl larutan Na2CO3 0,2 M. p-nitrofenol yang terbentuk ditandai
dengan warna kuning, kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada λ = 410 nm. Absorbansi yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk menetapkan nilai aktivitas enzim lipase berdasarkan pada kurva standart p-nitofenol (U/mL).
3.3.8 Produksi crude enzim lipase
Media produksi crude enzim lipase yang digunakan adalah media Nutrient Broth (13 g/L) yang ditambahkan dengan substrat minyak goreng sebanyak 2% (v/v). Sebanyak 100 mL media dimasukkan ke dalam masing-masing botol kultur ukuran 500 mL dan disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit.
Sebanyak 5% (v/v) kultur Bacillus sp. LII63B dalam Nutrient Broth dengan nilai absorbansi 0,5 pada λ650 nm diinokulasikan ke dalam masing-masing botol
disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm dalam suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut digunakan sebagai crude enzim (ekstrak kasar enzim). Crude enzim lipase tersebut dilakukan pengukuran nilai tegangan permukaannya (dyne/cm) dan aktivitas emulsifikasinya (%).
3.3.9 Persiapan oil sludge
Oil sludge yang cair dipipet 0.20 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan larutan uji hingga volume dalam tabung reaksi mencapai 8 mL. Jadi dalam satu tabung reaksi uji mengandung oil sludge sebanyak 2,5% (v/v). Volume oil sludge dalam tabung reaksi sebelum diberi larutan uji ditimbang dengan neraca analitik hingga diperoleh beratnya. Berat oil sludge perlakuan dicatat sebagai Wop.
3.3.10 Uji kelarutan oil sludge
Sembilan perlakuan untuk uji kelarutan divortex pada suhu ruang (27-30oC) selama 15 menit. Oil sludge yang terlarut (dalam fase cair) diambil secara hati-hati menggunakan pipet tetes. Lalu, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Kelarutan oil sludge diketahui dengan cara melakukan filtrasi atau penyaringan fase cair dari masing-masing perlakuan dengan menggunakan kertas saring Whatman.
3.3.11 Filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan
dari masing-masing fase cair hasil sentrifugasi dan tidak disentrifugasi dimasukkan ke dalam kertas saring. Kelarutan oil sludge diukur dari minyak yang terpisah dan terperangkap di kertas saring tersebut.
Kertas saring dikeringkan dengan cara dioven pada suhu 51-55°C selama 5 jam. Kertas saring yang telah kering kembali ditimbang dan dicatat beratnya sebagai Wt. Semua prosedur yang dilakukan ketika filtrasi fase cair dari kontrol dan perlakuan ini dilakukan secara bebas lemak.
Setiap perlakuan yang dilakukan dalam uji kelarutan oil sludge, selalu disertai dengan blangko. Blangko merupakan berat larutan biosurfaktan ataupun crude enzim tanpa penambahan oil sludge yang diperlakukan sama seperti perlakuan lainnya. Berat blangko dari masing-masing perlakuan dicatat sebagai Wb.
3.3.12 Penghitungan nilai persentase kelarutan oil sludge
Nilai persentase kelarutan oil sludge dari masing- masing perlakuan dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Dimana:
Wot = berat oil sludge terlarut (g) Wb = berat blangko perlakuan (g) Wop = berat oil sludge perlakuan (g)
Sedangkan berat oil sludge terlarut dihitung menggunakan rumus berikut:
Wot = berat oil sludge terlarut (g/volume total) Wt = berat kertas saring + oil sludge terlarut (g/mL) Wo = berat kertas saring + alumunium foil (g)
3.4 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris yang menggunakan rancangan penelitian acak lengkap (RAL), dimana akan dilakukan tiga kali pengulangan untuk sembilan perlakuan yang akan dilakukan. Rincian perlakuan adalah sebagai berikut:
1. Akuades (K) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 7,80 mL (97,5% (v/v)) akuades.
2. Tween-20 (S) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 7,80 mL (97,5% (v/v)) surfaktan sintetis tween 20 dengan konsentrasi sama dengan CMC.
3. Biosurfaktan (B) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 7,80 mL (97,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1).
4. Enzim 1 mL (E1) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 1 mL (12,5% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 6,80 mL (85% (v/v)) akuades. 5. Enzim 2 mL (E2) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 2 mL (25% (v/v))
crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 5,80 mL(72,5% (v/v)) akuades. 6. Enzim 3 mL (E3) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 3 mL (37,5% (v/v))
crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 4,80 mL (60% (v/v)) akuades. 7. Kombinasi biosurfaktan dan enzim 1 mL (BE1) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil
(37,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 3,80 mL (47,5% (v/v)) akuades.
8. Kombinasi biosurfaktan dan enzim 2 mL (BE2) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 2 mL (25% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 3 mL (37,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 2,80 mL (35% (v/v)) akuades.
9. Kombinasi biosurfaktan dan enzim 3 mL (BE3) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 3 mL (37,5% (v/v)) crude enzim lipase dari Bacillus sp. LII63B + 3 mL (37,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 1,80 mL (22,5% (v/v)) akuades.
3.5 Variabel Penelitian
Variabel penelitian terdiri dari :
Variabel bebas : perlakuan biosurfaktan (mL (% (v/v))) dan crude enzim lipase (mL (% (v/v))) terhadap oil sludge.
Variabel terikat : persentase kadar oil sludge yang terlarut (%).
Variabel kendali : lama waktu agitasi (menit), suhu (oC), pH (7), berat (g), volume oil sludge (mL (%(v/v))).
3.6 Analisis Data Penelitian
kelarutan oil sludge (%) dianalisis terlebih dahulu dengan melihat data berdistribusi normal atau tidak dengan menggunakan uji One sample Kolmogorov-Smirnov. Kemudian homogenitas varians juga dianalisis dengan uji Levene test. Jika data berdistribusi normal dan varians homogen dilanjutkan dengan uji One-way Analysis of Varians (ANOVA) (derajat signifikasi (α) 5%) pada program SPSS. ANOVA digunakan untuk mengetahui ada-tidaknya pengaruh variasi perlakuan penambahan biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B terhadap kelarutan oil sludge.
3.7 Skema Penelitian
Gambar 3.1 Skema metode pelaksanaan penelitian Uji produksi biosurfaktan
Nilai aktivitas emulsifikasi Nilai tegangan permukaan
Ekstraksi Biosurfaktan
Enzim lipase dari Bacillus sp. LII63B. diproduksi pada media produksi
Persiapan bahan dan peralatan
Pembuatan stok bakteri uji pada media agar miring (NA)
Pembuatan suspensi bakteri dalam media NB dan penentuan OD=0,5 dan λ=650 nm
Produksi biosurfaktan pada media campuran AMS, 4% molase, serta 4% suspensi bakteri Acinetobacter sp. P2(1) (OD=0,5), inkubasi selama 3 hari dalam shaker inkubator pada suhu 28oC, 120 rpm
