BAB III METODE PENELITIAN

17 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret hingga September 2013. Sampling Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut dilakukan di perairan Santolo dan Sancang, Garut Selatan dan pengukuran parameter lingkungan dilakukan langsung di lokasi. Pengidentifikasian bakteri melalui uji biokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung dan penelitian utama dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

1. Sampling dan pengamatan parameter fisika dan kimiawi lingkungan Alat :

 Gunting untuk memotong dan mengambil sampel rumput laut.

 Plastik dan botol sebagai wadah sampel.

 Alat pengukur pH (pH meter) untuk mengukur derajat keasaman air laut dengan ketelitian 0,1.

 Kertas label untuk memberi tanda pada sampel.

 Kontainer pendingin atau cool box untuk menjaga agar sampel tidak membusuk.

 Termometer skala 0°C-100°C untuk mengukur suhu air laut dengan ketelitian pengukuran 0,1°C.

 Refraktometer untuk mengukur salinitas air dengan ketelitian pengukuran 0,1.

 GPS untuk mengetahui posisi sampling.

 Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan. Bahan :

 Air laut steril

2. Isolasi dan pemurnian bakteri Alat :

 Autoklaf untuk mensterilisasi alat.

 Cawan petri untuk tempat pembiakan bakteri.

 Erlenmeyer volume 250 ml untuk wadah larutan media.

 Plastik tahan panas untuk menjaga agar cairan hasil penguapan tidak masuk ke dalam alat yang disterilisasi.

 Kapas untuk menyumbat erlenmeyer.

 Timbangan analitis dengan ketelitian 0,0001 gram untuk menimbang bahan yang digunakan.

 Jarum ose untuk melakukan pemindahan bakteri.

 Bunsen untuk mensterilkan jarum ose.

 Laminar flow cabinet tempat bekerja proses isolasi bakteri.

 Kertas label untuk menamai cawan petri.

 Hot plate untuk memanaskan larutan media.

 Inkubator untuk menginkubasi bakteri biakan.

 Tabung reaksi volume 5 ml sebagai wadah pengenceran dan menyimpan air laut steril.

 Mikropipet untuk mengambil cairan dari sampel yang dihaluskan dalam jumlah kurang dari 1 ml.

 Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi.

 Gelas ukur volume 100 ml untuk mengukur volume larutan.

 L Glass untuk meratakan hasil pengenceran pada medium.

 Mortar untuk menghaluskan sampel.

 Shaker Incubator untuk menghomogenkan dan menginkubasi bakteri pada kultur cair.

 Vortex untuk menghomogenkan larutan.

 Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir kontaminasi.

Bahan :

 Medium bacto agar

 Medium pepton bacteriologi

 Air laut steril

 Akuades steril

 KNO3

 Alkohol 70%

 Sampel rumput laut Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut

3. Pewarnaan bakteri Alat :

 Objek glass untuk tempat pembuatan preparat.

 Pipet untuk meneteskan pewarna.

 Mikroskop untuk mengamati preparat.

 Bunsen untuk mencegah kontaminasi dan mengeringkan preparat.

 Jarum ose untuk mengambil bakteri.

 Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir kontaminasi.

Bahan :

 Alkohol 70%

 Akuades

 NaCl fisiologis

 Pewarna gentian violet

 Lugol

 Pewarna air fuchsin

4. Pengujian aktivitas agarase a. Secara Kualitatif

Alat :

 Jarum ose untuk memindahkan isolat murni ke cawan petri yang berisi medium.

 Inkubator untuk menginkubasi bakteri.

 Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.

 Mikropipet untuk meneteskan pereaksi.

 Jangka sorong digital untuk mengukur diameter zona bening yang dihasilkan bakteri.

 Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir kontaminasi.

Bahan :

 Medium POR padat (1.5%)

 Pereaksi lugol iodin

b. Secara Kuantitatif Alat :

 Tabung reaksi untuk wadah sampel dan larutan.

 Jarum ose untuk memindahkan atau menginokulasi bakteri.

 Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.

 Shaker incubator untuk tempat menginkubasi bakteri.

 Rak tabung reaksi untuk tempat tabung reaksi.

 Kuvet wadah larutan dalam pengujian aborbansi menggunakan spektrofotometer.

 Mikropipet untuk meneteskan pereaksi.

 Spektrofotometer untuk mengukur aborbansi sampel yang akan diuji.

 Laminar flow cabinet tempat bekerja ketika proses isolasi dilakukan. Bahan :

 Medium POR cair (0.1%)

 Reagen A : natrium karbonat, natrium kalium tartrat, natrium bikarbonat, natrium sulfat anhidrat dan air.

 Reagen C : ammonium molibdat, air, asam sulfat pekat, natrium hidrogen arsenat heptahydrat dan arsenat.

5. Analisis molekuler 16S rRNA a. Persiapan kultur cair

Alat :

 Tabung reaksi wadah kultur cair.

 Jarum ose untuk memindahkan bakteri.

 Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.

 Shaker incubator untuk menginkubasi bakteri.

 Laminar flow cabinet tempat bekerja ketika proses isolasi dilakukan. Bahan :

 Medium POR cair (0.1%)

 Air laut steril

b. Isolasi DNA Alat :

 Mikro pipet untuk mengambil larutan DNA dan larutan kimia.

 Sentrifugasi untuk memisahkan larutan.

 Eppendorf untuk menyimpan ekstrak DNA.

 Vortex untuk menghomogenkan larutan. Bahan :  RNAse  TRIS HCl pH 8.5 [200 µM]  NaCl [250 µM]  EDTA [25 µM]  SDS 1%  Na asetat  Etanol absolut  Etanol 70%  TE

c. Polymerase Chain Reaction (PCR) Alat :

 Thermal cycler untuk melakukan amplifikasi DNA.

 Microtube untuk wadah komponen PCR. Bahan :

 DNA template

 Primer forward F (9F) [10mM]

 Primer reverse R (1541 dan 1492R) [10mM]

 Nuclease free water

 PCR master mix (KAPA2G fast ready mix PCR kit)

d. Elektroforesis gel agarosa Alat :

 Gelas ukur volume 100 ml untuk mengukur volume larutan TBE.

 Timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 gram untuk menimbang agarosa.

 Cetakan gel agarosa untuk mencetak gel agarosa dan membuat sumur-sumur.

 Microwave untuk memanaskan larutan agarosa.

 Alat elektroforesis untuk memisahkan pita DNA dengan bantuan arus listrik.

 Power supply untuk menyalurkan arus listrik.

 Ultraviolet transilluminator untuk melihat hasil akhir elektroforesis. Bahan :

 Gel agarosa

 Larutan pemberat dan pewarna (loading dye)

 Larutan Tris-borat EDTA (TBE) [0.5x]

 Ethidium Bromide (EtBr)

 DNA ladder 1kb (biolabs)

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksploratif untuk mendapatkan data yang diperlukan.

3.4 Prosedur Penelitian

Alur penelitian yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :

Isolasi Bakteri Sampling

kultivasi

subkultur

Pengamatan morfologi (bentuk koloni dan Gram)

Uji Aktivitas Agarase  Kualitatif (indeks agarolitik) pengambilan 6 isolat terbaik

 Kuantitatif (konsentrasi gula pereduksi)

pengambilan 2 isolat terbaik Karakterisasi Bakteri Seleksi  Uji biokimiawi (Bergey’s Manual

of Determinative Bacteriology dan modifikasi media akan kebutuhan pepton dan NaCl) Analisis Molekuler Gen 16S

rRNA

isolasi DNA

analisis molekuler 16S rRNA

sekuensing analisis bioinformatik isolasi isolat murni 2 kali pengulangan 2 kali pengulangan

3.4.1 Pengambilan Sampel

Sampling dilakukan di perairan Santolo dan Sancang, Garut Selatan (Tabel 1) dengan memotong dan mengambil rumput laut Sargassum sp., Gracillaria sp. dan air laut. Sampel diambil ±10 meter dari tepi pantai dan dilakukan saat air surut. Setelah rumput laut dipotong, sampel kemudian dimasukkan dalam plastik steril dan botol steril serta ditempatkan dalam kontainer pendingin dan dibawa ke laboratorium. Sampel disimpan di dalam freezer dengan suhu -23°C.

Dalam perjalanan menuju laboratorium sampel disimpan dalam air laut steril untuk menjaga agar mikroorganismenya tidak mati. Transportasi pengangkutan sampel ke laboratorium dilakukan sebelum 24 jam dari waktu pengambilan sampel dan langsung dilakukan isolasi bakteri dari setiap sampel. Hal ini dilakukan agar bakteri tidak berkembang dan mengeluarkan enzim tertentu yang mungkin dapat membunuh bakteri tersebut.

Tabel 1. Data Lokasi Sampling

Jenis Makroalga Lokasi Waktu Suhu (°C) Salinitas pH

Gracilaria sp. Perairan Santolo 09.00 29 34.5 8.05 S : 7°39’40” E : 107°41’1.6” Sargassum sp. Perairan Sancang 12.00 33 35 7.34 S : 7°39’36” E : 107°40’48” Air Laut Perairan Santolo 09.00 29 34.5 8 S : 7°39’40.1” E : 107°41’1.7”

Pada Tabel 1 terlihat bahwa perbedaan salinitas dan pH antar perairan tidak jauh berbeda. Oleh karena itu perbedaan lokasi pengambilan sampel tidak terlalu berpengaruh terhadap kondisi sampel. Sedangkan suhu yang berbeda antara perairan Santolo dan Sancang dikarenakan oleh waktu pengambilan sampel yang berbeda.

3.4.2 Sterilisasi dan Pembuatan Media Pertumbuhan 1. Sterilisasi

Sebelum melakukan isolasi dan purifikasi bakteri, perlu dilakukan sterilisasi alat terlebih dahulu untuk mencegah kontaminasi dari alat ataupun medium yang digunakan. Dalam mikrobiologi, sterilisasi mutlak dilakukan agar didapatkan objek yang diinginkan tanpa adanya kontaminasi. Sterilisasi dilakukan dengan 2 cara, yaitu sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf dan sterilisasi kering dengan menggunakan oven.

Sterilisasi uap dilakukan dengan cara menyimpan alat dan medium yang telah dibungkus kertas dan plastik tahan panas didalam autoklaf, lalu autoklaf dinyalakan hingga mencapai suhu 121˚C. Setelah mencapai suhu tersebut, ditunggu selama 15 menit untuk membunuh kontaminan yang kemungkinan dapat mengkontaminasi alat dan medium (Hadioetomo 1993).

Sterilisasi kering dilakukan dengan cara menyimpan alat yang telah dibungkus kertas ke dalam oven dengan suhu 180˚C selama 2 jam. Kemudian dikeluarkan dari dalam oven dan disimpan dalam rak khusus peralatan steril (Hadioetomo 1993). Pemilihan sterilisasi uap dan sterilisasi kering bergantung pada alat dan bahan yang akan disterilisasi.

2. Membuat media POR 1,5%

Sebanyak 1,5 gram bacto agar, 0,1 gram KNO3, dan 100 ml air laut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer (Lampiran 2). Erlenmeyer kemudian ditutup dengan kapas lalu dipanaskan dengan hot plate menggunakan magnetic stirrer, ditunggu sampai larutan tercampur homogen dan berwarna bening. Kemudian larutan media disterilisasi. Sebelum dituang, media steril didiamkan hingga agak dingin agar tidak terbentuk uap air pada tutup cawan petri pada saat penuangan. Setelah dituangkan agar didiamkan pada suhu ruang sampai memadat. Proses penuangan dilakukan didalam laminar flow cabinet agar media dan alat yang telah disterilisasi tidak terpapar kontaminasi yang terbawa oleh udara. Proses pembuatan media dapat dilihat di Lampiran 3.

3.4.3 Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan murni. Salah satu metode pengisolasian bakteri ketika pertama kali diisolasi dari sampel adalah pengenceran. Pengenceran ini bertujuan untuk mengurangi jumlah bakteri didalam sampel sehingga dapat mempermudah mendapatkan kultur murni.:

Sampel dihaluskan menggunakan mortar lalu diambil sebanyak 1 gram. Sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama yang berisi 4,5 ml larutan air laut steril.

Tabung reaksi divortex agar larutan tercampur homogen.

Setelah homogen, larutan diambil sebanyak 0,5 ml dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi kedua yang berisi 5 ml air laut steril.

Tabung reaksi divortex agar larutan tercampur homogen.

Proses pengenceran dilakukan hingga memperoleh pengenceran 10-6 dan 10-7 (Lampiran 4).

Dari masing-masing pengenceran 10-6 dan 10-7 diambil sebanyak 0,1 ml. Kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium POR.

Sampel diratakan menggunakan L Glass.

Cawan petri ditutup dan dilapisi dengan plastik wrap.

Disimpan dalam inkubator dengan suhu 30°C selama 3x24 jam.

Diamati setiap hari sampai terjadi pertumbuhan koloni bakteri pada biakan campuran.

Semua proses isolasi bakteri dilakukan didalam laminar flow cabinet untuk menghindari kontaminasi, baik alat maupun bahan, dari mikroorganisme yang terbawa oleh udara. Proses isolasi bakteri dapat dilihat pada Lampiran 5.

3.4.4 Kultivasi dan Purifikasi Bakteri

Kultivasi adalah proses menumbuhkan bakteri dalam biakan murni. Agar kultivasi berhasil, diperlukan suatu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai. Kondisi fisik yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri antara lain: suhu, atmosfer gas dan keasaman atau kebasaan.

Purifikasi bakteri adalah proses kultivasi yang dilakukan berulang-ulang sehingga didapat kultur murni atau isolat tunggal. Kultivasi dan purifikasi bakteri dilakukan dengan cara:

Ditentukan bakteri mana yang akan dikultivasi berdasarkan koloninya.. Koloni bakteri yang akan dimurnikan diseleksi berdasarkan pada bentuk, warna, dan kenampakan lainnya.

Setiap koloni dipindahkan ke dalam cawan petri yang berbeda. Bakteri yang akan dimurnikan diambil menggunakan jarum ose. Jarum ose dibakar dengan bunsen hingga berwarna merah.

Setelah jarum ose dingin, bakteri diambil dan dipindahkan ke cawan petri yang berisi medium POR menggunakan metode gores (streak method).

Dilakukan proses yang sama untuk setiap koloni. Cawan petri ditutup dan dilapisi dengan plastik wrap.

Proses diulangi hingga didapatkan isolat murni dimana hanya terdapat bakteri yang sama dalam isolat tersebut.

Isolasi dan purifikasi isolat bakteri dilakukan berdasar penampakan morfologis dengan metode goresan (streak method) hingga diperoleh kultur murni (Cappucino dan Sherman 2008). Proses purifikasi bakteri dapat dilihat pada Lampiran 6.

3.4.5 Pewarnaan Bakteri

Untuk memastikan bakteri telah murni dan untuk mengetahui bakteri tersebut termasuk kedalam golongan bakteri gram positif atau negatif, maka dilakukan pewarnaan dan pengamatan mikroskop dengan prosedur sebagai berikut (Cappucino dan Sherman 2008) :

NaCl fisiologis steril diteteskan sebanyak 1 tetes di atas objek glass. Isolat bakteri yang akan diamati diambil dengan jarum ose.

Isolat dioleskan pada NaCl fisiologis steril yang ada pada objek glass dan diratakan.

Bakteri dan NaCl yang tercampur dikeringkan di atas bunsen.

Diteteskan pewarna I (gentian violet) di atas NaCl dan bakteri yang dikeringkan lalu diratakan dan didiamkan selama 1 menit.

Bilas pewarna I dengan akuades dan dikeringkan.

Diteteskan lugol dan diratakan lalu tunggu selama 1 menit. Bilas lugol dengan akuades lalu dikeringkan di atas bunsen. Bilas dengan alkohol kemudian dikeringkan.

Bilas dengan akuades kemudian dikeringkan.

Diteteskan pewarna II (air fuchsin) lalu diratakan dan didiamkan selama 45 detik.

Bilas dengan akuades kemudian dikeringkan di atas bunsen.

Bentuk koloni dan warna (Gram) diamati dengan menggunakan mikroskop.

Proses pewarnaan Gram dapat dilihat pada Lampiran 7.

Dalam pengamatan menggunakan mikroskop, yang perlu diperhatikan adalah : 1 Bentuk sel bakteri

Jika semua sel bakteri berbentuk sama, berarti koloni bakteri tersebut sudah murni.

2 Warna bakteri

Jika berwarna ungu, berarti bakteri termasuk ke dalam bakteri gram positif dan jika berwarna merah, berarti bakteri tersebut termasuk ke dalam bakteri gram negatif.

3.4.6 Uji Aktivitas Agarase

1 Uji Aktivitas Secara Kualitatif

ini dilakukan pada media POR. Pengujian ini dilakukan dengan cara:

Bakteri yang ada pada isolat tunggal diambil menggunakan jarum ose. Bakteri tersebut dipindahkan ke cawan petri lain yang berisi medium POR.

Bakteri dikultivasi selama 3x24 jam.

Setelah bakteri tumbuh, dilakukan pewarnaan menggunakan Lugol Iodin dengan cara menuangkannya sebanyak 2 ml ke dalam cawan petri. Cawan petri digoyang-goyangkan hingga lugol iodin tersebar merata ke seluruh permukaan medium.

Perendaman dilakukan selama 15 menit. Setelah 15 menit, lugol iodin dibuang.

Luasan zona bening dan koloni yang dihasilkan diamati dan diukur diameternya.

Dari seluruh isolat tunggal yang diuji aktivitas agarase, diambil 6 sampel yang menghasilkan indeks agarase terbesar (Indeks agarase = rata-rata diameter zona bening : rata-rata diameter bakteri). Proses pengujian aktivitas agarase secara kualitatif dapat dilihat pada Lampiran 8.

2. Uji Aktivitas Secara Kuantitatif

Uji aktivitas ini dilakukan dengan cara menghitung kadar gula pereduksi dari hasil hidrolisis. Penentuan kadar gula ini dilakukan dengan menggunakan metode Somogyi-Nelson Alkaline Cooper. Untuk menggunakan metode ini memerlukan 4 macam reagen yaitu ;

Reagen A :Sebanyak 25 g natrium karbonat, 25 g natrium-kalium tartrat, 20 g natrium bikarbonat, dan 200 g natrium sulfat anhidrat, dilarutkan dalam 1 L air.

Reagen B :Sebanyak 30 g tembaga sulfat pentahidrat dilarutkan dalam 200 ml air, kemudian ditambahkan 4 tetes asam sulfat pekat.

Reagen C :Sebanyak 25 g amonium molibdat dilarutkan dalam 450 mL air yang mengandung 21 mL asam sulfat pekat dan 3 g natrium hidrogen arsenat heptahydrat (Na2HAsO4.7H2O) dilarutkan dalam

25 mL air. Larutan arsenat secara perlahan ditambahkan ke dalam larutan amonium molibdat, yang diencerkan sampai 500 mL dan dipanaskan secara hati-hati pada suhu 55o C selama 30 menit atau 37o C selama 12-15 jam, kemudian disimpan dalam botol berwarna coklat.

Reagen D :Sebanyak 1 mL reagen B dicampurkan dengan 25 mL reagen A. Reagen D harus dibuat segar pada saat akan dilakukan pengujian gula pereduksi. Sedangkan reagen yang lain bisa disimpan dan masih dapat digunakan dikemudian hari.

Sebelum dilakukan pengujian, dilakukan persiapan sebelum pengujian : Kultur bakteri yang telah diuji indeks agarase secara kualitatif, dipindahkan ke dalam tabung reaksi berisi POR 0.1%. Kemudian dikultivasi didalam incubator shaker dengan suhu 30˚C. Bakteri diinkubasi selama 3x24 jam.

Pengujian secara kuantitatif dilakukan dengan cara :

Dicampurkan sebanyak 1 ml sampel dan 1 ml reagen D ke dalam tabung reaksi.

Larutan dipanaskan pada air mendidih selama 20 menit Didinginkan pada air mengalir selama 5 menit

Ditambahkan 1 mL reagen C lalu dikocok sampai tidak terdapat gelembung gas.

Larutan dibiarkan selama 10 menit.

Disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm.

Kemudian larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.

Nilai absorbansi yang dihasilkan harus dikurangi dengan absorbansi blanko (media cair) agar didapatkan absorbansi murni dari sampel (tanpa ada kandungan absorbansi dari blanko).

Jumlah gula pereduksi ditentukan melalui persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa dan dinyatakan dalam mg/ml. Kurva standar glukosa dibuat dengan pembuatan larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi (0 mg/ml, 0,2

mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml dan 1 mg/ml). Proses pengujian aktivitas agarase secara kuantitatif dapat dilihat pada Lampiran 9.

Sampel yang memiliki nilai gula pereduksi tertinggi, kemudian akan dijadikan sebagai kandidat utama sebagai penghasil enzim agarase terbesar. Dari hasil spektrofotometer, akan diambil 2 nilai tertinggi yang kemudian akan dikarakterisasi secara biokimia dan dianalisis molekuler dengan metode 16s rRNA.

3.4.7 Modifikasi Media Pertumbuhan

Modifikasi media pertumbuhan dilakukan untuk mengetahui kebutuhan bakteri target terhadap pepton sebagai sumber karbon alternatif dan NaCl untuk mengetahui kebutuhan bakteri terhadap ion Na dan Cl yang menjadi ciri bakteri laut.

1. Membuat media POR 1,5% dan modifikasi media dengan menggunakan air tawar atau akuades

Sebanyak 1,5 gram bacto agar, 0,1 gram KNO3, dan 100 ml air tawar atau akuades dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ditutup dengan kapas lalu dipanaskan dengan hot plate menggunakan magnetic stirrer, tunggu sampai larutan tercampur homogen dan berwarna bening. Kemudian larutan media disterilisasi. Sebelum dituang, media steril didiamkan hingga agak dingin agar tidak terbentuk uap air pada tutup cawan petri pada saat penuangan. Setelah dituangkan, diamkan pada suhu ruang sampai memadat.

2. Membuat media POR 1,5% dan modifikasi media dengan menggunakan pepton 1%

Sebanyak 1,5 gram bacto agar, 0,1 gram KNO3, bubuk pepton 1 gram dan 100 ml air laut dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ditutup dengan kapas lalu dipanaskan dengan hot plate menggunakan magnetic stirrer, tunggu sampai larutan tercampur homogen dan berwarna bening. Kemudian larutan media disterilisasi. Sebelum dituang, media steril didiamkan hingga agak dingin agar tidak terbentuk uap air pada tutup cawan petri pada saat penuangan. Setelah dituangkan, diamkan pada suhu ruang sampai memadat.

3.4.8 Identifikasi Bakteri Agarolitik 1. Karakterisasi Biokimia

Karakterisasi bakteri dilakukan secara mikrobiologis meliputi karakter morfologi, fisiologi dan uji biokimiawi (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology) sebagai pendukung data identifikasi secara molekuler. Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan enzim yang dihasilkannya. Enzim tersebut terdiri dari enzim ekstraselular dan intraselular. Berikut merupakan uji yang dilakukan terhadap bakteri target :

2. Analisis Molekuler 16S rRNA

Analisis ini bertujuan untuk mengidentifikasi 2 isolat bakteri yang memiliki aktivitas agarase tertinggi. Analisis ini dilakukan dengan cara :

1. Persiapan bakteri menggunakan kultur cair

Sebelum melakukan isolasi DNA genom dari bakteri, dilakukan kultur cair untuk memperbanyak bakteri. Tahap-tahapnya adalah (Lampiran 10):

Isolat terpilih ditumbuhkan ke dalam kultur cair (POR 0.1%) Hidrolisis Pati Hidrolisis Lemak Hidrolisis Gelatin Hidrolisis Casein Enzim ekstraselular Indol Metil Red Voges Proskauer Sitrat

Enzim intraselular Uji IMViC

Fermentasi Karbohidrat Reduksi Nitrat Uji Urease Uji Katalase Uji Gula-Gula Glukosa Laktosa Sukrosa

Dilakukan inkubasi selama 3x24 jam dengan suhu 37˚C.

2. Isolasi DNA genom bakteri

Isolasi DNA genom dilakukan untuk mendapatkan DNA genom dari isolate. Metode isolasi DNA genom bakteri yang digunakan adalah metode Alkaline Lysis yang telah dimodifikasi (Sambrook 1989) yang dijelaskan sebagai berikut (Lampiran 11):

Bakteri hasil kultur cair dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan tinggi (12.000 rpm).

Pellet DNA diambil dari hasil sentrifugasi dengan cara membuang supernatannya.

Ditambahkan 300 µl buffer ekstraksi (Lampiran 16) dan 3 µl RNAse ke dalam setiap tabung lalu tabung ditutup dan dilakukan resuspensi menggunakan vortex selama 5 menit sampai pellet larut.

Ditambahkan 150 µl Na asetat lalu dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung dan diamkan selama 10 menit pada suhu ruang agar proses lysis terjadi.

Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml yang baru. Dilakukan presipitasi dengan menambahkan etanol absolute sebanyak 450 µl.

Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Dilakukan pencucian dengan etanol 70% sebanyak 450 µl. Lalu di-flix agar larutan tercampur.

Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 30 detik. Genom DNA dikeringkan dengan cara mengambil supernatannya. Dibiarkan selama 10 menit agar genom DNA sudah benar-benar kering.

sampai genom larut. Hasil isolasi disimpan pada suhu -20°C.

3. Amplifikasi DNA dengan PCR

Amplifikasi gen pengkode 16S rRNA dilakukan dengan PCR untuk mendapatkan sekuen 16S rRNA yang akan digunakan sebagai bahan sekuensing untuk menentukan jenis bakteri (Lampiran 12). Amplifikasi dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah DNA target yang ada sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis. Amplifikasi DNA dilakukan dengan bantuan thermocycler atau yang lebih dikenal dengan alat PCR.

Dalam proses amplifkasi DNA perlu diketahui primer yang tepat (Tabel 2), komponen yang digunakan (Tabel 3) dan pengaturan program PCR (Tabel 4). Primer disebut juga oligonukleotida yang berarti sejumlah kecil nukleotida. Primer diproduksi secara sintetis biasanya berupa urutan DNA dengan panjang sekitar 20 nukleotida. DNA polymerase akan menambahkan nukleotida ke 3’-OH bebas dari primer ini sesuai dengan aturan dasar pasangan yang normal (MCPherson and Moller 2006).

Tabel 2. Primer 16S rRNA Universal Primer Urutan Nukleotida (5’ – 3’)

9F F: GAGTTTGATCCTGGCTC

1541R R: AAGGAGGTGATCCAGCC

1492R R: GGCTACCTTGTTACGACTT Sumber : Lewaru 2012

Tabel 3. Komponen Reaksi PCR

Komponen PCR Konsentrasi Akhir Volume (µl) Nuclease free water - 9

KAPA2G Fast Ready Mix 1x 12,5

Primer forward 0,5 µM 1,25

Primer reverse 0,5 µM 1,25

DNA template - 1

Pengaturan dasar program PCR bersifat tentatif. Pengaturan program dasar PCR biasanya sama tetapi ketika pita DNA yang diharapkan tidak keluar dan/atau double band maka perlu dilakukan optimasi dengan cara mengubah suhu dan waktu proses annealing.

Tabel 4. Pengaturan Program PCR

Siklus Suhu Waktu Jumlah

Siklus Inisisasi 95°C 2 menit 1 Denaturasi 95°C 30 detik 30 Annealing 58°C 30 detik Elongasi 75°C 1 menit

Final elongasi 75°C 5 menit 1

Final hold 4°C - 1

Sumber : Lewaru 2012 yang dimodifikasi

4. Elektroforesis

Tahap – tahap elektroforesis :

a. Persiapan elektroforesis (Lampiran 13)

Gel agarose dibuat (konsentrasi 1%) dan dilarutkan pada TE buffer. Dipanaskan di atas hot plate.

Gel dituangkan ke atas lempeng atau plate.

Lembaran perspex tipis yang menyerupai sisir ditancapkan saat agar masih dalam keadaan panas dan belum memadat.

Lembaran perspex dicabut setelah agarose memadat.

Gel agarose dimasukkan ke dalam tangki yang berisi buffer. Buffer yang digunakan adalah tris-borat-EDTA (TBE) 0,5x.

b. Pelaksanaan elektroforesis (Lampiran 14)

Hasil amplifikasi DNA dan marker masing-masing sebanyak 2µl dan 1µl dimasukkan pada setiap sumur.

Tangki ditutup dan diberi aliran listrik dengan cara manyambungkan kabel ke stop kontak.

Sisi yang berisi hasil amplifikasi diberi arus negatif. Besarnya arus elektroforesis adalah 75 volt selama 60 menit.

Setelah selesai, dilakukan perendaman dengan EtBr selama 30 menit. Dilakukan perendaman kembali dengan akuades selama 10 menit. Lalu gel diangkat menggunakan spatula dan ditiriskan.

Pita DNA dilihat dengan alat ultraviolet transilluminator.

3.5 Parameter Pengamatan

Hal yang diamati dalam penelitian ini adalah : 1. Morfologi koloni bakteri

Morfologi koloni bakteri dilihat berdasarkan ukuran, warna dan bentuk koloni. Ukuran koloni terbagi menjadi pinpoint, kecil, sedang dan besar. Bentuk koloni dapat dilihat dari pinggiran, elevasi dan bentuk koloni tersebut.

Gambar 6. Bentuk Koloni Bakteri (Sumber : Cappucino 2008)

2. Bentuk dan warna sel bakteri

Bentuk sel bakteri dapat dilihat setelah dilakukan proses pewarnaan Gram. Bentuk sel bakteri terdiri dari bulat (coccus), batang (basil) dan spiral (spirilia). Bakteri Gram positif ditunjukkan dengan warna ungu dan bakteri Gram negatif ditunjukkan dengan warna merah. Umur isolat saat dilakukan

pewarnaan adalah 3x24 jam.

3. Aktivitas agarase yang dihasilkan oleh bakteri

Aktivitas agarase dapat dilihat dengan pengujian baik secara kuantitatif dan kualitatif. Secara kualitatif pengujian dilakukan menggunakan pereaksi Lugol Iodin. Indeks agarolitik dihitung dengan membagi nilai rata-rata diameter zona bening dengan nilai rata-rata diameter bakteri. Secara kuantitatif, pengujian dilakukan dengan menggunakan metode Somogyi Nelson Alkaline Cooper untuk mencari nilai konsentrasi gula pereduksi yang merupakan hasil dari hidrolisis enzim agarase

4. Karakteristik bakteri setelah dilakukan pengujian secara biokimia. 5. Hasil sekuensing yang dianalisis secara bioinformatif

3.6 Analisis Data

3.6.1 Analisis Aktivitas Agarase Secara Kualitatif dan Kuantitatif

Pengujian aktivitas agarase secara kualitatif menggunakan metode difusi pereaksi pada media agar dengan penambahan pereaksi Lugol Iodin untuk mengamati diameter zona bening yang terbentuk. Kemampuan bakteri dalam memproduksi enzim agarase dapat dilihat dengan menghitung indeks agarolitiknya, yaitu diameter zona bening : diameter koloni bakteri. Indeks tersebut akan dianalisis secara deskriptif dengan menyertakan tabel dan gambar untuk mengetahui isolat yang memiliki indeks agarolitik tertinggi.

Analisis aktivitas agarase secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung konsentrasi gula pereduksi yang terbentuk. Terlebih dahulu dibuat kurva standar glukosa. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk menentukan nilai regresi linear sebagai rumus yang menjadi dasar untuk perhitungan kadar gula pereduksi pada sampel. Adapun rumus regresi linear yang diperoleh adalah sebagai berikut :

Keterangan : a = 0.082 b = 0.037

Y = aX - b

Y = absorbansi

Rumus yang didapat adalah Y = 0,082X – 0,037 dengan nilai R2 (regresi linier) adalah 0,987. Kemudian sampel yang telah diuji menggunakan meode Nelson Simogyi diukur nilai absorbansinya pada OD 540. Nilai absorbansi tersebut akan menjadi nilai Y. Dengan demikian nilai kadar gula pereduksi (X) dapat didapatkan. Nilai kadar gula pereduksi tersebut akan dianalisis secara deskriptif dengan menyertakan tabel untuk mengetahui isolat yang memiliki nilai gula pereduksi tertinggi.

3.6.2 Analisis Bioinformatik

Setelah mendapatkan data hasil sekuensing, berupa deret nukleotida dari setiap primer dalam format abi, data disejajarkan dan diedit menggunakan program BioEdit (Lampiran 17) sehingga diperoleh konstruksi gen lengkap 16S rRNA berupa konsensus. Hasil konsensus tersebut dimasukkan ke website www.ncbi.nlm.nih.gov. Program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yang terdapat di dalam situs akan mencocokkan hasil sekuensing dengan data yang terdapat di genbank untuk mendapatkan daftar mikroorganisme yang basa nitrogennya (nukleotida) dianggap paling mirip (Lampiran 18). Data-data mikroorganisme dengan kemiripan terdekat, berupa urutan nukleotida, disimpan dan diberi nama. Diambil sebanyak 15 data urutan nukleotida untuk setiap isolat.

Konstruksi pohon filogenetik (dendogram) dilakukan dengan bantuan program MEGA5.2. Data-data urutan 16S rRNA dari isolat yang hendak dicari posisinya pada pohon filogenetik serta data-data dari hasil olahan program BLAST dimasukkan ke dalam program MEGA5.2 (Lampiran 19). Kemudian dicari model yang paling tepat untuk menentukan pohon filogenetik tersebut dengan cara menekan menu models → find best DNA/protein models. Visualisasi pohon filogenetik dilakukan dengan menekan menu phylogeny. Hasil yang telah diperoleh kemudian dianalisis secara deskriptif disertai tabel dan gambar.