Prediksi dan pembuktian kemungkinan fotosensitisasi ciprofloxacin dan furosemide dengan paparan radiasi UVA dan pencegahannya dengan antioksidan vitamin C [Asam Askorbat] - USD Repository

(1)

PREDIKSI DAN PEMBUKTIAN KEMUNGKINAN FOTOSENSITISASI CIPROFLOXACIN DAN FUROSEMIDE DENGAN PAPARAN RADIASI UVA DAN PENCEGAHANNYA DENGAN ANTIOKSIDAN VITAMIN C

(ASAM ASKORBAT)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Tekla Rosa Oktivia NIM : 048114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(2)

ii

PREDIKSI DAN PEMBUKTIAN KEMUNGKINAN FOTOSENSITISASI CIPROFLOXACIN DAN FUROSEMIDE DENGAN PAPARAN RADIASI UVA DAN PENCEGAHANNYA DENGAN ANTIOKSIDAN VITAMIN C

(ASAM ASKORBAT)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Tekla Rosa Oktivia NIM : 048114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

(3)

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(4)

iv

(5)

v

PERSEMBAHAN

Tak Cukup H anya dengan Berkata-kata

Buah kerja ini kupersembahkan untuk :

Bapa di surga yang memberikan rencana yang indah untukku

Bapak Marjoko, teman yang selalu memberi semangat dan cerita-cerita hangat

Mama, E. Herlena, perempuan yang tak pernah berhenti menyayangi dan berkorban untuk anak-anaknya

Kakak, Marsela Dian Novita, cerewet dan manja, tapi sangat perhatian

Laurensius Yudya K, penyemangat dan sumber inspirasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(6)

vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Tekla Rosa Oktivia

Nomor Mahasiswa : 048114003

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

“Prediksi Dan Pembuktian Kemungkinan Fotosensitisasi Ciprofloxacin Dan Furosemide Dengan Paparan Radiasi UVA Dan Pencegahannya Dengan Antioksidan Vitamin C (Asam Askorbat)”

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 21 Juli 2008

Yang menyatakan

( Tekla Rosa Oktivia )

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(7)

vii

PRAKATA

Syukur kepada Allah merupakan kata yang tepat untuk diucapkan ketika

sebuah pekerjaan telah selesai dikerjakan. Demekian pula ungkapan penulis ketika

menyelesaikan skripsi ini. Atas berkat rahmat dan karunia-Nya, maka skripsi yang

berjudul ”Prediksi dan Pembuktian Kemungkinan Fotosensitisasi Ciprofloxacin

dan Furosemide Dengan Paparan Radiasi UVA dan Pencegahannya dengan

Antioksidan Vitamin C (Asam Askorbat)” telah selesai dikerjakan.

Penulisan skripsi ini bertujuan untuk memenuhi salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Ilmu Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Disamping itu, skripsi ini juga

diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Selama penyusunan skripsi ini banyak hambatan dan kesulitan yang

dihadapai, namun demikian hambatan dan kesulitan ini dapat teratasi berkat

adanya bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis

menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt dan Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku

Dekan dan Wakil Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. Dan Ibu C. M. Rana Rini Nastiti,

S.Si., Apt. selaku Ketua dan Wakil Program Studi Ilmu Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. sebagai pembimbing yang bersedia dan

setia untuk membimbing dan memberikan waktu dalam

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(8)

viii

memberikan pengarahan dan saran dalam penelitian dan penulisan skripsi

ini.

4. Bapak Jeffry Julianus, M.Si dan Ibu dr. Fenty, M.Kes., Sp.PK yang sudi

meluangkan waktu untuk menguji dan berdiskusi bersama penulis.

5. Bapak Drs. A. Yuswanto, S U., PhD., Apt., dan Rm Sunu, SJ yang turut

mendukung dan meluangkan waktu untuk berdiskusi.

6. dr. Yohanes Widodo W., SpKK(K) yang rela membimbing, memberikan

ide, dan membantu penulis dalam melakukan penelitian.Serta Mbak Nur,

Pak Han, dr Yuyu, dr Febri, dr Arum, dr Iik, dr Devi, dr Maria, dr Sasa, dr

Resati, dan dr Herwinda yang mau membantu saat berjuang bersama

melakukan penelitian.

7. Para Dosen Fakultas Farmasi yang telah memberikan ilmu kepada penulis

selama penulis menuntut ilmu di Fakultas Farmasi Unversitas Sanata

Dharma Yogyakarta. Serta seluruh laboran Laboratorium Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang rela membantu dan memberikan kecerian

saat penulis sedang lelah dalam penelitian.

8. Keluarga penulis, Bapak Marjoko, Ibu Emerenciana Herlena, dan Kakak

penulis Marsela Dian Novita dan Alexander yang selalu memberikan

dukungan material dan spiritual serta memberikan kebebasan yang

bertanggung jawab bagi penulis untuk mengembangkan dan

mengeksplorasi diri selama proses kehidupan penulis, khususnya ketika

kuliah di Fakultas Farmasi dan saat penulis melakukan penelitian ini.

9. Laurensius Yudya Kristiawan, SE atas ide dan pendapat yang diberikan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(9)

ix

kepada penulis sehingga penulis dapat memiliki pandangan

baru serta kesetiannya menemani penulis dari jauh.

10.Cendani, teman sekelompok penelitian yang selalu ceria. Akhirnya kita

bisa selesai.

11.Cah-cah UKF Dolanz-Dolanz : Ayu, Cicil, Chandy, Chicka, Lian, Adit,

Budi, Boriz, Blangkon, Cho-cho, Cawas, Edot, Felix, Fheri Gozo nk, Rudi,

Robet, Probo, Tintus yang selau memberikan keceria an dan kegilaan

selama penulis kuliah di Fakultas Farmasi Unversitas Sanata Dharma

Yogyakarta. Kapan kita kemana?

12.Anak-anak Wisma Ananda : Imel, Lian, Maya, Nita, Lisa, Mia, Iren, dan

yang lain, terima kasih atas dukungan dan doanya.

13.Limdra, Heni, Tata, teman-teman kelompok praktikum dan teman-teman

Farmasi angkatan 2004 yang tidak dapat disebutkan satu persatu, jangan

pernah berhenti memberi warna di hidupmu.

14.Kawan-kawan Tarekat Djuang MUDA (TADJAM) Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta dan Front Perjuangan Pemuda Indonesia yang

memberikan sudut pandang tersendiri dalam memandang sebuah

permasalahan di Indonesia.

Tak ada gading yang tak retak. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh

dari sempurna. Oleh karena itu, penulis dengan rendah hati mengharapkan kritik

dan saran yang dapat menyempurnakan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat

berguna bagi orang-orang yang membutuhkan.

Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(10)

x

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 17 Juli 2008 Penulis

Tekla Rosa Oktivia

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(11)

xi INTISARI

Ciprofloxacin yang merupakan antibiotik spektrum luas dan furosemide yang merupakan diuretik kuat memiliki efek samping yang mirip. Hal ini disebabkan oleh kemampuan kedua obat tersebut untuk mentransferkan elektron yang diwujudkan dalam fungsi ciprofloxacin dan furosemide sebagai

photosensitizer. Namun, energi yang diperlukan untuk menimbulkan reaksi

fotosensitivitas akibat ciprofloxacin dan furosemide masih belum pasti. Oleh karena itu, dalam penelitian ini prediksi kemungkinan fotosensitisasi ciprofloxacin dan furosemide dilakukan dengan komputasi pemodelan molekul sedangkan pembuktiannya dilakukan dengan metode fotohemolisis.

Berdasarkan hasil pemodelan molekul diperoleh prediksi bahwa UVA tidak dapat menginduksi fotosensitisasi ciprofloxacin dan furosemide. Hal ini sejalan dengan hasil fotohemolisis. Lebih lanjut, fenomena ini dibuktikan dengan tidak terdapatnya perbedaan yang signifikan ketika vitamin C ditambah sebagai antioksidan (p 0,05).

Kata kunci : photosensitizer, UVA, fotohemolisis, ciprofloxacin, furosemide,

vitamin C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(12)

xii ABSTRACT

Both, ciprofloxacin, a broad spectrum antibiotic, and furosemide, a potent diuretic, has similar side effect, due to their ability in transfering electron which is manifested as photosensitizer. However, the energy required to cause photosensitizing still uncertain. Therefore, in this study the prediction of photosensitization possibilities were done by computational molecule modeling, while the confirmation were carried out by photohemolysis.

The molecule modeling predicted that the energy of UVA could not induce photosensitization of ciprofloxacin and furosemide, which is in line with photohemolysis result. Further, this phenomena was confirmed by insignificant difference when vitamin C was added as antioxidant.

Key word : photosensitizer, UVA, photohemolysis, ciprofloxacin, furosemide, vitamin C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(13)

xiii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

HALAMAN PENGESAHAN ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMI ... vi

PRAKATA ... vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... x

INTISARI ... xi

ABSTRACT ... xii

DAFTAR ISI ... xiii

DAFTAR TABEL ... ... xvii

DAFTAR GRAFIK ... xxi

DAFTAR GAMBAR ... xxii

DAFTAR LAMPIRAN ... xxiv

BAB I. PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Permasalahan ... 4

2. Keaslian penelitian ... 5

3. Manfaat Penelitian ... 6

B. Tujuan Penelitian ... 6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(14)

xiv

1. Tujuan umum ... 6

2. Tujuan khusus ... 7

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ... 8

A. Vitamin C (Asam Askorbat) ... 8

B. Fotosensitivitas ... 9

C. Ciprofloxacin ... 14

D. Furosemide ... 15

E. Sinar Ultra Violet ... 16

F. Landasan Teori ... 17

G. Hipotesis ... 17

H. Rencana Penelitian ... 18

BAB III. METODE PENELITIAN ………... 19

A.Jenis dan Rancangan Penelitian ... 19

B. Variabel dan Definisi Operasional ... 19

1. Variabel penelitian ... 19

2. Definisi operasional ... 19

C.Alat dan Bahan Penelitian ... 20

1. Alat penelitian ... 20

2. Bahan penelitian ... 20

D.Tata Cara Penelitian ... 21

1. Prediksi dengan komputasi pemodelan molekul menggunakan hyperchem ... 21

2. Aklimasi bahan ... 21

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(15)

xv

3. Pembagian kelompok perlakuan ... 22

4. Pembuatan pelet eritrosit ... 25

5. Inkubasi dengan vitamin C ... 25

6. Inkubasi dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml atau furosemide 0,008 mg/ml dan radiasi UVA ... 26

7. Pengukuran hemolisis …….………. 26

E. Analisis Hasil ...………... 28

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 29

A. Prediksi Energi yang Diperlukan agar Ciprofloxacin dan Furosemide Berfungsi sebagai Photosensitizer dengan Komputasi Pemodelan Molekul ……… 29

B. Penentuan Dosis Vitamin C, Ciprofloxacin, dan Furosemide … 35 C. Pengaruh Radiasi UVA 18 J/cm2 terhadap Reaksi Fotosensitivitas Ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan Furosemide 0,008 mg/ml ………... 36

D. Efek Vitamin C (L-Asam Askorbat) pada Kelompok Perlakuan Ciprofloxacin 0,08 mg/ml yang diradiasi UVA ………. 41

E Efek Vitamin C (L-Asam Askorbat) pada Kelompok Perlakuan Furosemide 0,008 mg/ml yang diradiasi UVA ……….. 43

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...………. 48

A Kesimpulan ... 48

B Saran ... 48

DAFTAR PUSTAKA ... 50

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(16)

xvi

LAMPIRAN ... 52

BIOGRAFI PENULIS ... 75

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(17)

xvii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Energi HOMO dan LUMO ciprofloxacin ... 29

Tabel II. Energi HOMO dan LUMO furosemide ... 29

Tabel III. Energi/ panas pembentukan dengan metode semiempiris pada

ciprofloxacin ... 30

Tabel IV. Energi/ panas pembentukandengan metode semiempiris pada

furosemide ... 30

Tabel V. Panjang gelombang range UVB yang menunjukkan serapan

ciprofloxacin ...…... 32

Tabel VI. Absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan furosemide 0,008

mg/ml ... ... 37

Tabel VII. Absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan furosemide 0,008

mg/ml yang memenuhi syarat linieritas ... 37

Tabel VIII. Mean absorbansi dan SD ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan

furosemide 0,008 mg/ml ... 38

Tabel IX. Rerata absorbansi beberapa kelompok perlakuan vitamin C

... 41

Tabel X. Analisis Post Hoc kelompok furosemide 0,008 mg/ml dengan

variasi dosis vitamin C ... 45

Tabel XI. Absorbansi perlakuan ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan

variasi dosis vitamin C dan UVA ...…... 60

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(18)

xviii

Tabel XII. Absorbansi perlakuan furosemide 0,008 mg/ml dengan

variasi dosis vitamin C dan UVA ... 60

Tabel XIII. Ringkasan data ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan variasi

UVA yang diproses ... 61

TabelXIV. Analisis sebaran data secara deskriptif kelompok

ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan variasi UVA ... 61

Tabel XV. Normalitas data absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml

dengan variasi perlakuan UVA ... 62

Tabel XVI. Ringkasan data ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan variasi

UVA yang diproses (logaritma absorbansi) ... 62

Tabel XVII. Analisis sebaran data secara deskriptif kelompok

ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan variasi UVA (logaritma

absorbansi) ...…... ... 62

Tabel XVIII. Normalitas data logaritma absorbansi ciprofloxacin 0,08

mg/ml dengan variasi perlakuan UVA ... ... 63

Tabel XIX. Peringkat absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan

variasi radiasi UVA dengan uji Mann-Whitney

... 63

Tabel XX. Signifikansi absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml tanpa

UVA dan dengan UVA dengan uji Mann-Whitney

... 63

Tabel XXI. Ringkasan data furosemide 0,008 mg/ml dengan variasi

UVA yang diproses ... 63

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(19)

xix

Tabel XXII. Analisis sebaran data secara deskriptif kelompok

furosemide 0,008 mg/ml dengan variasi UVA ... 64

Tabel XXIII. Normalitas data absorbansi furosemide 0,008 mg/ml

dengan variasi perlakuan UVA ... 64

Tabel XXIV. Rata-rata, SD, dan SE absorbansi furosemide 0,008 mg/ml

... 65

Tabel XXV. Hasil uji-t tidak berpasangan furosemide 0,008 mg/ml

... 65

Tabel XXVI. Ringkasan data ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan variasi

dosis vitamin C yang diproses ... 65

Tabel XXVII. Analisis sebaran data secara deskriptif kelompok

ciprofloxacin 0,08 mg/ml dengan variasi dosis vitamin C

... ... 66

Tabel XXVIII. Normalitas data absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml

dengan variasi dosis vitamin C ... 67

Tabel XXIX. Homogenitas varian antar kelompok ciprofloxacin 0,08

mg/ml dengan variasi dosis vitamin C ... 67

Tabel XXX. Analisis varian antar kelompok ciprofloxacin 0,08 mg/ml

Tabel XXXI. Ringkasan data furosemide 0,008 mg/ml dengan variasi

dosis vitamin C yang diproses ... 67

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(20)

xx

Tabel XXXII. Analisis sebaran data secara deskriptif kelompok

furosemide 0,008 mg/ml dengan variasi dosis vitamin C

... 68

Tabel XXXIII. Normalitas data absorbansi furosemide 0,008 mg/ml

Tabel XXXIV. Homogenitas varian antar kelompok furosemide 0,008

mg/ml dengan variasi dosis vitamin C (absorbansi)

... 69

Tabel XXXV. Homogenitas varian antar kelompok furosemide 0,008

mg/ml dengan variasi dosis vitamin C (logaritma

absorbansi) ... 69

Tabel XXXVI. Analisis varian antar kelompok furosemide 0,008 mg/ml

dengan variasi dosis vitamin c (logaritma absorbansi)

... 69

Tabel XXXVII. Analisis Post Hoc ... 70

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(21)

xxi

DAFTAR GRAFIK

Halaman

Grafik 1. Mean absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan furosemide

0,008 mg/ml ... 38

Grafik 2. Mean absorbansi pada kelompok perlakuan furosemide 0,008

mg/ml ... ... 43

Grafik 3. Mean log absorbansi pada kelompok perlakuan furosemide

0,008 mg/ml ... 44

(22)

xxii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. L-asam askorbat (vitamin C) ... 8

Gambar 2.

Asam-1-siklopropil-6-fluoro-4-oxo-7-piperazin-1-il-1,4-dihidro-quinolin-3-karboksilat (ciprofloxacin) ... 14

Gambar 3. Asam-4-kloro-2-[(furan-2-ilmetil)-amino]-5-sulfamoil benzoat

(furosemide) ... 15

Gambar 4. Spektra serapan ciprofloxacin berdasarkan bentuk geometri

optimasi metode MNDO ... 31

optimasi metode AM1 ...…... 31

optimasi metode PM3 ... 32

Gambar 7. Spektra serapan furosemide berdasarkan bentuk geometri

optimasi metode MNDO …... 33

Gambar 8. Spektra Serapan Furosemide Berdasarkan Bentuk Geometri

Optimasi Metode AM1 ... 34

Gambar 9. Spektra serapan furosemide berdasarkan bentuk geometri

optimasi metode PM3 ... 34

Gambar 10. Spektra serapan ciprofloxacin di range UVB berdasarkan

bentuk geometri optimasi metode MNDO ... 70

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(23)

xxiii

bentuk geometri optimasi metode AM1 ...…... 71

bentuk geometri optimasi metode PM3 ... 71

Gambar 13. Laminar air flow model AUC4A1 ... 72

Gambar 14. Inkubator (RS Biotek) ... 72

Gambar 15. Lampu UV A (LIPI) (a) ... 73

Gambar 16. Lampu UV A (LIPI) (b) ... 73

Gambar 17. Microplate reader (Anthos reader 2001) ... 74

Gambar 18. Plate perlakuan setelah dibaca dengan microplate reader ... 74

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(24)

xxiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Optimasi bentuk geometri dengan hyperchem ... 52

Lampiran 2. Penentuan spektra serapan pada range UV-Vis ... 57

Lampiran 3. Prediksi energy LUMO dan HOMO ... 59

Lampiran 4. Data absorbansi ... 60

Lampiran 5. Hasil analisis kelompok perlakuan ciprofloxacin 0,08 mg/ml

yang tidak diradiasi UVA dan yang diradiasi UVA 18 J/cm2

...…... ... 61

Lampiran 6. Hasil analisis kelompok perlakuan furosemide 0,008 mg/ml

yang tidak diradiasi UVA dan yang diradiasi UVA 18 J/cm2

... 63

Lampiran 7. Analisis varian (ANOVA) kelompok perlakuan

ciprofloxacin dengan variasi dosis vitamin C

... 64

Lampiran 8. Analisis varian (ANOVA) kelompok perlakuan furosemide

Lampiran 9. Spektra serapan ciprofloxacin di range UVB …………... 70

Lampiran 10. Foto alat percobaan ……...……... 72

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(25)

1

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Efek samping obat akibat penggunaan obat dalam suatu terapi

pengobatan merupakan sesuatu yang tidak jarang kita temui atau bahkan kita

sendiri kerap mengalaminya. Ada berbagai macam bentuk efek samping obat,

misalnya back-pain pada penggunaan obat golongan statin, ortastic hypotension

akibat penggunaan diuretik, dan mengantuk akibat penggunaan antihistamin.

Sasaran efek samping obat pun beragam, mulai dari sistem saraf pusat, sistem

pencernaan, ginjal, darah, kelenjar endokrin dan sistem metabolisme, hingga kulit/

dermal.

Fotosensitivitas merupakan salah satu efek samping obat yang responnya

tampak pada kulit. Fotosensitivitas dikategorikan dalam 2 bentuk, yaitu

fototoksisitas dan fotoalergi. Namun insidensi reaksi fototoksisitas lebih besar

dibandingkan dengan reaksi fotoalergi (Buck, 1998; Dubakiene dan Kupriene,

2006; Lugovic et al., 2007).

Fotosensitivitas dapat muncul karena adanya senyawa kimia

(photosensitizer) dan cahaya (Lugovic et al., 2007; Dubakiene et al., 2006;

Vassileva et al., 1998; Spielmann et al., 1994). Senyawa kimia tersebut dapat

menyebabkan reaksi fotosensitivitas karena adanya fotoaktivasi senyawa kimia

oleh cahaya. Cahaya yang dapat menginduksi reaksi fotosensitivitas adalah radiasi

sinar UV (200-400 nm) dan radiasi sinar tampak (400-800 nm) (Dubakiene et al.,

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(26)

2

2006). Namun, pada umumnya reaksi fotosensitivitas diinduksi oleh UVA

(Spielmann et al., 1994).

Reaksi fotosensitivitas ini dapat terjadi karena adanya absorpsi foton dari

radiasi sinar UV atau sinar tampak oleh senyawa kimia. Proses absorpsi ini

menghasilkan terbentuknya dua bentuk elektron yang tereksitasi (electronically

excited species), yaitu singlet dan triplet. Namun yang berperan dalam reaksi

fotosensitivitas adalah bentuk triplet karena umurnya yang lebih panjang

dibandingkan bentuk singlet. Bentuk triplet ini, dengan atau tanpa oksigen, akan

membentuk radikal dan memicu adanya spesies oksigen reaktif (Spielmann et al.,

1994). Spesies oksigen reaktif ini akan mengoksidasi biomolekul seperti lipid,

protein, dan DNA sehingga menimbulkan kerusakan sel yang berujung pada

munculnya reaksi-reaksi di kulit (Spielmann et al., 1994; Vassileva et al., 1998).

Fotooksidasi pada membran sel terjadi akibat oksidasi lipid membran

yang dapat diaktifkan melalui proses nonenzimatik spesies oksigen reaktif pada

asam lemak tidak jenuh, maupun melalui proses enzimatik oleh lipoksigenase dan

siklooksigenase (Lee, 2001).

Munculnya reaksi fotosensitivitas tergantung pada jumlah (dosis)

senyawa kimia dan cahaya yang menginduksi senyawa kimia tersebut, serta

panjang gelombang cahaya yang tepat. Namun, dosis senyawa kimia dan cahaya

yang dapat menimbulkan reaksi fotosensitivitas bervariasi pada tiap individu

(Dubakiene et al., 2006; Ferguson dan Dawe, 1997).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(27)

3

Ciprofloxacin dan furosemide adalah jenis obat yang merupakan

photosensitizer (Buck, 1998; Lugovic et al., 2007; Shields, 2004). Kedua obat ini

diinduksi oleh radiasi UVA (Vassileva et al., 1998; Spielmann et al., 1994).

Insidensi reaksi fotosensitivitas akibat penggunaan ciprofloxacin adalah 1-4 %

(Vassileva et al., 1998). Ciprofloxacin merupakan salah satu antibiotik golongan

fluoroquionolon yang dapat menimbulkan reaksi fotosensitivitas. Reaksi

fotosensitivitas yang ditimbulkan oleh ciprofloxacin tergolong dalam kategori

ringan (Ting et al., 2003). Ciprofloxacin dapat menimbulkan reaksi

fotosensitivitas diduga karena adanya H pada posisi 8 dari struktur kimia

ciprofloxacin. H-8 ini membuat ciprofloxacin tidak stabil terhadap radiasi UVA

(Matsumoto et al., 1992).

Furosemide dilaporkan menimbulkan efek samping berupa

fotosensitivitas, fotohemolisis yang tergantung pada oksigen, dan fotoperoksidasi

lipid (Broch, et al., 2002). Furosemide memiliki serapan maksimal pada panjang

gelombang 330 nm. Furosemide memiliki potensi yang tinggi untuk terdegradasi

oleh cahaya (Rubino, 2005).

Seperti telah diungkapkan di atas bahwa fotosensitivitas ciprofloxacin

dan furosemide terjadi karena adanya absorpsi foton sinar UVA oleh kedua obat

tersebut sehingga terbentuk radikal. Penulis berasumsi jika terdapat penangkal

radikal (antioksidan) maka reaksi fotosensitivitas dapat dicegah. Vitamin C

merupakan penangkal radikal yang baik. Vitamin C merupakan donor elektron

dan agen pereduksi. Vitamin C akan mereduksi radikal dengan pembentukan

senyawa yang kurang reaktif (Padayatty et al., 2003).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(28)

4

Hal ini membuat penulis ingin mengetahui apakah vitamin C dapat

mencegah munculnya reaksi fotosensitivitas ciprofloxacin dan furosemide.

Metode yang digunakan untuk melihat munculnya reaksi fotosensitivitas adalah

fotohemolisis. Fotohemolisis merupakan salah satu metode invitro yang paling

sederhana untuk menskrining senyawa yang diduga sebagai photosensitizer. Pada

eritrosit, kerusakan oksidatif membran akan berpengaruh pada kerapuhan

membran yang akan berakibat timbulnya hemolisis (May dan Davis, 1998). Pada

metode ini akan dilihat tingkat kerusakan membran eritrosit yang tercermin dari

jumlah hemoglobin yang terdapat dalam supernatan (Spielmann et al., 1994).

Jumlah hemoglobin akan tercermin dalam absorbansi. Jika vitamin C dapat

mencegah reaksi fotosensitivitas maka tidak terjadi fotohemolisis (absorbansi

kelompok perlakuan dengan vitamin C akan lebih kecil daripada absorbansi

kelompok tanpa vitamin C).

1. Permasalahan

Dari latar belakang tersebut di atas, muncul beberapa permasalahan,

yaitu:

a. Apakah ciprofloxacin dan furosemide dapat menimbulkan reaksi

fotosensitivitas jika diradiasi UVA?

b. Apakah vitamin C dapat dijadikan calon senyawa untuk mencegah terjadinya

reaksi fotosensitivitas ciprofloxacin dan furosemide yang tercermin dengan

tidak terjadinya fotohemolisis?

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(29)

5

c. Pada dosis berapakah vitamin C dapat mencegah reaksi fotosensitivitas

ciprofloxacin dan furosemide yang tercermin dengan tidak terjadinya

fotohemolisis?

2. Keaslian penelitian

Owen (1998) meneliti tentang respon fototoksisitas beberapa golongan

antibiotik floroquinolon, termasuk ciprofloxacin, yang diradiasi UVA 20 J/cm2

pada telinga mencit. Dosis ciprofloxacin yang digunakan adalah 200 mg/kg dan

ciprofloxacin menunjukkan eritema dengan tingkat keparahan yang sedang. Ting

(2003) juga meneliti tentang respon fototoksisitas beberapa golongan antibiotik

floroquinolon, termasuk ciprofloxacin, dengan dosis 50, 100, dan 200 mg/kg.

Penelitian ini menggunakan UVA dengan panjang gelombang 365±30 nm.

Respon yang diamati adalah eritema dan edema pada telinga tikus galur Wistar

dan penebalan telinga (auricular thickness) pada mencit Balb/c. Hasil penelitian

ini menunjukkan ciprofloxacin menyebabkan fototoksisitas dengan tingkat

keparahan yang sedang. Penelitian tentang fototoksisitas ciprofloxacin sehingga

terjadi fotooksidasi membran eritrosit dengan metode fotohemolisis pernah

dilakukan oleh Brahmanti et al. (in press). Pada penelitian ini digunakan

ciprofloxacin dosis 0,08 mg/ml (400 mg) yang diradiasi UVB 720 mJ/cm2.

Penelitian tentang fototoksisitas furosemide pernah dilakukan oleh

Selvaag et al. (2002). Berdasarkan hasil uji clonogenic, furosemide yang diradiasi

UVA 23 atau 48 J/cm2 terbukti fototoksik pada sel HaCaT. Sedangkan penelitian

tentang pengaruh vitamin C terhadap fotooksidasi membran sel akibat UVB dan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(30)

6

ofloxacin pernah dilakukan oleh Rusfianti et al. (2003) dan diperoleh dosis

vitamin C terkecil yang berefek adalah 500 mg (0, 1 mg/ml).

Dengan demikian, penelitian tentang prediksi dan pembuktian

kemungkinan fotosensitisaasi ciprofloxacin dan furosemide dengan paparan

radiasi UVA dan pencegahannya dengan antioksidan vitamin C yang dilakukan

dengan komputasi pemodelan molekul dan fotohemolisis belum pernah dilakukan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat Ilmu Pengetahuan

Menambah khasanah ilmu pengetahuan sehingga dapat memperdalam kajian

ilmiah efek samping photosensitizer dalam penelitian ini.

b. Manfaat Metodologis

Sebagai upaya pengembangan dan aplikasi metode komputasi pemodelan

molekul dan metode fotohemolisis

c. Manfaat Praktis

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat diketahui kemungkinan

fotosensitisaasi ciprofloxacin dan furosemide yang diberi paparan radiasi

UVA dan kemampuan vitamin C dalam mencegah fotosensitisasi tersebut.

B. Tujuan 1. Tujuan umum

Untuk mengetahui apakah ciprofloxacin dan furosemide dapat

menimbulkan reaksi fotosensitivitas jika diradiasi UVA dan pencegahannya

dengan vitamin C.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(31)

7

2. Tujuan khusus

a. Untuk mengetahui apakah ciprofloxacin dan furosemide dapat menimbulkan

reaksi fotosensitivitas jika diradiasi UVA.

b. Untuk mengetahui peluang/kemungkinan vitamin C dijadikan calon senyawa

untuk mencegah terjadinya reaksi fotosensitivitas ciprofloxacin dan

furosemide yang tercermin dengan tidak terjadinya fotohemolisis.

c. Untuk mengetahui dosis vitamin C yang dapat mencegah reaksi

fotosensitivitas ciprofloxacin dan furosemide yang tercermin dengan tidak

terjadinya fotohemolisis.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(32)

8

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Vitamin C (Asam Askorbat)

HO HO

OH

O

OH

BM 176,14

Gambar 1. L-asam askorbat (vitamin C) (Anonim, 1995)

Vitamin C adalah antioksidan yang larut air. Vitamin C berbentuk kristal

putih. Vitamin C merupakan derivat heksosa dan memiliki enam rantai carbon.

Vitamin C memiliki empat isomer, namun bentuk yang aktif adalah L-asam

askorbat (Shekelle , Morton , dan Hardy, 2003). Vitamin C stabil dalam bentuk

kering namun mudah teroksidasi dalam larutan bila terdapat udara. Proses

oksidasi dipercepat oleh panas, cahaya, dan enzim oksidatif (Middleton, 2005).

Vitamin C merupakan donor elektron dan agen pereduksi. Vitamin C

disebut antioksidan karena dengan mendonorkan elektronnya, vitamin C

mencegah senyawa lain teroksidasi. Vitamin C mendonorkan dua elektron dari

ikatan rangkap pada posisi C2-C3. Namun, pada proses ini, vitamin C sendiri akan

teroksidasi. Senyawa yang menerima elektron dari vitamin C atau yang direduksi

oleh vitamin C dapat dibagi menjadi beberapa kelas, yaitu

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(33)

9

1. senyawa dengan elektron yang tidak berpasangan, misalnya radikal oksigen,

radikal sulfur, dan radikal nitrogen-oksigen;

2. senyawa reaktif tetapi tidak berbentuk radikal, misalnya nitrosamin;

3. senyawa yang terbentuk dari reaksi radikal dan kemudian beraksi dengan

vitamin C, misalnya radikal tocopheroxyl yang direduksi oleh vitamin C

(Padayatty et al., 2003).

B. Fotosensitivitas

Fotosensitivitas merupakan efek farmakologi yang tidak diinginkan pada

kulit yang terjadi ketika seseorang menggunakan senyawa kimia atau obat secara

topikal atau sistemik, atau keduanya, dan terpapar sinar UV atau tampak, baik

secara alami maupun disengaja (Dubakiene et al., 2006; Vassileva et al., 1998).

Fotosensitivitas dikategorikan dalam 2 bentuk, yaitu fototoksisitas dan fotoalergi.

Namun insidensi reaksi fototoksisitas lebih besar dibandingkan dengan reaksi

fotoalergi (Buck, 1998; Dubakiene et al., 2006; Lugovic et al., 2007).

Fototoksisitas dapat terjadi setelah penggunaan obat untuk pertama kali

dan tidak berhubungan dengan mediator imunologi. Umumnya, reaksi

fototoksisitas muncul pada penggunaan obat secara sitemik. Respon fototoksisitas

berupa eritema, edema, dan hiperpigmentasi (Buck, 1998; Dubakiene et al.,

2006). Faktor yang mempengaruhi insidensi dan intensitas reaksi fototoksik

adalah:

1. konsentrasi, absorpsi, dan farmakokinetika obat;

2. kuantitas dan spektrum radiasi energi;

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(34)

10

3. faktor yang berhubungan dengan kulit, seperti ketebalan stratum corneum,

kuantitas melanin, temperatur, dan kelembaban (Dubakiene et al., 2006;

Vassileva et al., 1998).

Pada tingkat molekular, umumnya reaksi fototoksisitas menyebabkan kerusakan

nukleus, sitoplasma, dan komponen membran sel (Vassileva et al., 1998;

Spielmann et al., 1994).

Fotoalergi merupakan bentuk hipersensitivitas dimana obat membentuk

komplek senyawa yang menimbulkan respon imun (immunogenic complex)

dengan protein kulit (cutaneous protein) dengan adanya energi cahaya (Buck,

1998) Fotoalergi terjadi pada orang yang sensitif dan tidak tergantung pada dosis.

Reaksi ini muncul akibat penggunaan obat baik secara topikal atau sistemik

(Dubakiene et al., 2006).

Salah satu metode invitro untuk melihat reaksi fotosensitivitas adalah

fotohemolisis. Fotohemolisis merupakan metode yang digunakan untuk melihat

kerusakan membran akibat adanya photosensitizer (Vassileva et al., 1998;

Spielmann et al., 1994). Fotohemolisis dilakukan dengan memaparkan sinar

tampak atau UV pada suspensi eritrosit. Selanjutnya suspensi disentrifugasi

sehingga eritrosit yang utuh akan mengendap dan hemoglobin dari eritrosit yang

mengalami kerusakan membran akan berada pada lapisan supernatan. Pada

metode ini digunakan eritrosit karena eritrosit memberikan hasil yang

reprodusibel tentang kerusakan membran sel (Spielmann et al., 1994).

Secara umum, mekanisme reaksi fotosensitivitas dapat dilihat pada

bagan 1 di bawah ini.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(35)

Radiasi UV atau sinar tampak ↓

Photosensitizer ↓

Senyawa kimia pada fase tereksistasi (triplet)

TYPE II TYPE I

Bagan 1. Mekanisme fotosensitisasi Transfer energi oksigen Transfer elektron Ikatan kovalen dengan biomolekul seperti DNA Pembentukan photoproduct yang toksik Berikatan dengan protein kulit Pembentukan hapten sebagai photoproduct Oksigen singlet

yang tereksistasi Radikal

Antigen lengkap Biomolekul Photosensitizer Ditambah oksigen Superoxide, Hidrogen peroxide, hydroxyl radikal

Oksidasi biomolekul Oksidasi biomolekul seperti lipid, protein,

atau DNA Perubahan

molekular Kerusakan sel Reaksi pada kulit Mensensitisasi kulit Sensitisasi Fotoalergi Fototoksik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(36)

12

Reaksi fototoksik dapat terjadi melalui empat jenis mekanisme, namun diantara

empat mekanisme, mekanisme yang paling umum adalah mekanisme tipe I dan

tipe II. Sedangkan reaksi fotoalergi dapat terjadi melalui dua mekanisme.

Mekanisme reaksi proses fotosensitisasi furosemide dapat dilihat pada

reaksi dibawah ini.

COOH

SO2NH2

Cl H

N R

COOH

SO2NH2

Cl H

N R

COOH

SO2NH2

Cl H

N R

COOH

SO2NH2

OH H N R H+ COOH

SO2NH2

H N R O hv -e

-+ H₂O - HCl

*

Keterangan :

R =

O

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(37)

13

Setelah terkena radiasi UV, furosemide akan mengalami eksitasi menjadi

bentuk triplet dan mentransfer elektron sehingga menjadi suatu kation radikal.

Adanya muatan positif pada kation radikal furosemide tersebut membuat

furosemide rentan terhadap serangan nuk leofilik oleh pelarut, dalam hal ini air.

Tahap ini dilanjutkan dengan substitusi Cl oleh hidroksil dan berakhir pada

terbentuknya radikal furosemide (Rubino, 2005). Radikal furosemide tersebut

selanjutnya akan bereaksi dengan O2 sehingga terbentuk superoksida, hidrogen

peroksida, atau radikal hidroksil yang akan mengoksidasi biomolekul seperti

membran dan menyebabkan reaksi fotosensitivitas. Reaksi di bawah ini

merupakan salah satu mekanisme reaksi radikal furosemide dengan O2.

COOH

SO2NH2

H N R

O

COOH

SO2NH2

H N R O O O COOH

SO2NH2

H N R O O O COOH

SO2NH2

H N R O H+ COOH

SO2NH2

H N R OH Asam-2-[(furan-2-ilmetil)-amino]-4-hidroksi-5-sulfamoil-benzoat superoksida O O

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(38)

14

C. Ciprofloxacin

Ciprofloxacin termasuk dalam golongan fluoroquinolon yang merupakan

antibiotik spektrum luas (Goswami et al., 2006). Ciprofloxacin merupakan

photosensitizer yang menimbulkan reaksi fototoksisitas, namun tidak

menimbulkan reaksi fotoalergi (Dubakiene et al., 2006; Lugovic et al., 2007).

Ting et al. (2003) menunjukkan urutan potensi fototoksisitas beberapa obat

golongan fluoroquinolon, yaitu sparfloxacin > lomefloxacin > ciprofloxacin >

norfloxacin.

N

COOH F

N

O

HN

C17H18FN3O3 BM 331,346

Gambar 2. Asam1siklopropil6fluoro4oxo7piperazin1il1,4dihidroquinolin3 -karboksilat (ciprofloxacin) (Matsumoto et al., 1992)

Matsumoto et al. (1992) menunjukkan bahwa radiasi UVA dapat

mendegradasi ciprofloxacin. Radiasi UVA 0,3 J/cm2, 1 J/cm2, dan 3 J/cm2

mendegradasi ciprofloxacin sehingga bentuk aslinya tersisa 57,8 ± 3,67%, 15,9 ±

4,16%, dan kurang dari 1%. Diduga, posisi H pada atom C nomor 8 yang dapat

memacu fototoksisitas. Berdasarkan workshop European Centre for the

Validation of Alternative Methods (ECVAM), ciprofloxacin termasuk dalam

daftar obat/senyawa kimia yang digunakan dalam evaluasi prosedur fototoksisitas.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(39)

15

Ciprofloxacin menimbulkan reaksi fototoksisitas pada penggunaan sistemik

dengan mekanisme pembentukan radikal (Spielmann et al., 1994).

D. Furosemide

Furosemide merupakan diuretik yang menimbulkan reaksi fototoksisitas,

namun tidak menimbulkan reaksi fotoalergi (Dubakiene et al., 2006; Lugovic et

al., 2007; Shields, 2004; Spielmann et al., 1994). Furosemide berbentuk serbuk

kristal berwarna putih, tidak berbau, tidak berasa, dan hampir tidak larut di air.

Furosemide tidak stabil bila terpapar cahaya namun stabil di udara. Furosemide

meleleh pada suhu 203°C dan memiliki pKa 3,9 (Middleton, 2005).

COOH

Cl H₂NO₂S

H

N CH2 O

C12H11ClN2O5S BM 330,74

Gambar 3. Asam-4-kloro-2-[(furan-2-ilmetil)-amino]-5-sulfamoil benzoat (furosemide) (Anonim, 1995)

Furosemide menimbulkan reaksi fototoksisitas pada UVA, baik pada

penggunaan topikal atau sistemik, dengan mekanisme pembentukan radikal atau

fotoproduk yang toksik. Adapun frekuensi reaksi fototoksisitas furosemide pada

photopatch test dengan radiasi UVA 10 J/cm2 sebesar 0,5%. Sama seperti

ciprofloxacin, berdasarkan workshop European Centre for the Validation of

Alternative Methods (ECVAM), furosemide juga termasuk dalam daftar

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(40)

16

obat/senyawa kimia yang digunakan dalam evaluasi prosedur fototoksisitas

(Spielmann et al., 1994).

E. Sinar Ultraviolet (UV)

Radiasi UV tergolong dalam spektrum elektromagenetik. Berdasarkan

panjang gelombang, sinar UV terbagi menjadi tiga, yaitu UVA, UVB, dan UVC

(Delgado et al., 2006; Patton et al., 1999; Svobodova et al., 2003). Berdasarkan

International Commission of Illumination (CIE), range spektra untuk

masing-masing sinar UV adalah sebagai berikut.

§ UVA berada pada panjang gelombang 315-400 nm.

§ UVB berada pada panjang gelombang 280-315 nm.

§ UVC berada pada panjang gelombang 100-280 nm. Namun daerah spektra di

bawah 180 nm disebut vacuum UV. (Delgado et al., 2006)

Walaupun sinar matahari meradiasikan sinar UV, sinar UVC dan UVB

dengan panjang gelombang kurang dari 290 nm akan diabsorpsi oleh lapisan ozon

di atmosfer. Namun, penipisan lapisan ozon menyebabkan meningkatnya radiasi

sinar UVB yang mencapai permukaan bumi (Patton et al., 1999).

Reaksi fototoksisitas terutama disebabkan oleh UVA karena penetrasi

UVA lebih dalam daripada UVB. Pada intensitas 1%, UVA pada panjang

gelombang 400 nm dapat menembus hingga kedalaman 400 µm (lapisan dermis).

Sedangkan UVB pada panjang gelombang 300 nm hanya menembus hingga

kedalaman 28 µm (lapisan epidermis) (Delgado et al., 2006).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(41)

17

F. Landasan Teori

Ciprofloxacin dapat terdegradasi oleh UVA. Selain itu, adanya atom H

pada C8 dapat memicu terjadinya fototoksisitas (Matsumoto et al., 1992).

Sedangkan furosemide, jika diradiasi, dapat tereksitasi, mentransfer elektron, dan

berujung pada terbentuknya radikal (Spielmann et al., 1994). Furosemide

memiliki serapan maksimal pada panjang gelombang 330 nm (Rubino, 2005).

Dengan demikian, radikal furosemide dapat terbentuk bila furosemide diradiasi

oleh UVA. Bila radikal furosemide tersebut bereaksi dengan O2 maka terjadi

reaksi fotosensitivitas.

Vitamin C dapat mencegah reaksi fotosensitivitas karena vitamin C dapat

bereaksi dengan spesies oksigen reaktif dan membentuk radikal vitamin C

(ascorbyl radical) yang relatif kurang reaktif (Padayatty et al., 2003).

G. Hipotesis

Hipotesis dari penelitian ini adalah

1. Struktur ciprofloxacin dan furosemide memungkinkan ciprofloxacin dan

furosemide berfungsi sebagai photosensitizer jika diradiasi UVA.

2. Vitamin C memiliki kemampuan mencegah fotohemolisis akibat

photosensitizing oleh ciprofloxacin dan furosemide.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(42)

18

H. Rancangan Penelitian

1. Prediksi energi yang diperlukan agar ciprofloxacin berfungsi sebagai

photosensitizer dengan komputasi pemodelan molekul.

2. Prediksi energi yang diperlukan agar furosemide berfungsi sebagai

photosensitizer dengan komputasi pemodelan molekul.

3. Pengaruh UVA terhadap fotohemolisis akibat reaksi fotosensitivitas

ciprofloxacin dan furosemide.

4. Pengaruh vitamin C terhadap fotohemolisis akibat photosensitizing

ciprofloxacin.

5. Pengaruh vitamin C terhadap fotohemolisis akibat photosensitizing

furosemide.

6. Analisis data dengan uji signifikansi berbagai perlakuan dengan SPSS.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(43)

19

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan

variabel eksperimental acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas : dosis vitamin C b. Variabel tergantung : absorbansi

c. Variabel perantara : komputasi pemodelan molekul dan metode

fotohemolisis

d. Variabel pengacau terkendali

1) cahaya ruangan

2) suhu selama perlakuan

3) alat percobaan

e. Variabel pengacau tak terkendali:

1) kadar CO2 dan temperatur inkubator

2. Definisi operasional

a. Fotosensitivitas merupakan efek farmakologi yang tidak diinginkan yang

timbul akibat penggunaan ciprofloxacin dan furosemide sebagai

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(44)

20

photosensitizer yang diradiasi UVA dan muncul sebagai reaksi

fototoksisitas dan ditunjukkan dengan terjadinya fotohemolisis.

b. Photosensitizer merupakan senyawa kimia yang setelah diradiasi UVA

dapat menyebabkan timbulnya reaksi fotosensitivitas.

c. Fotohemolisis merupakan suatu kejadian rusaknya membran eritrosit

sehingga hemoglobin dapat keluar dari eritrosit. Suatu kelompok

perlakuan dikatakan mengalami fotohemolisis jika absorbansi yang

ditunjukkan kelompok tersebut secara signifikan lebih besar daripada

absorbansi kelompok kontrol.

d. Absorbansi adalah serapan yang ditunjukkan lewat pembacaan dengan

microplate reader dan menunjukkan nilai serapan antara 0,100-2,500.

C. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat penelitian

Satu unit komputer, tabung falcon 50 ml; pipet volume 10 ml; mikropipet

0,5-10 µl, 5-20 µl, 20-200µl, 100-1000µl (BioH-T Proline); tabung venoject 3 ml

yang mengandung EDTA; jarum suntik 3ml (Terumo); eppendorf 1,5 ml steril;

rak eppendorf; plate 96-well (Corning); tip biru; tip kuning; lampu UV (PUVA)

(LIPI, lampu Phillip 40 W); Laminar Air Flow (LAF) model AUC4A1 serial

number 2003-5108; inkubator (RS Biotek); sentrifuge (Hettich Zentrifugen

Universal 32R); microplate reader (Anthos reader 2001 tipe 10 550).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(45)

21

2. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan adalah buffer TCM (p.a); vitamin C 1 g/5 ml

(Roche®, farmasetis ); furosemide (Lasix®, farmasetis); ciprofloxacin

(Baquinor®, Sanbe, farmasetis), albumin (Human) 25%, USP (Plasbumin®-25,

farmasetis); eritrosit; larutan Drabkin (Ecoline®, farmasetis); PBS steril (p.a);

aquadest.

D. Tata Cara Penelitian

1. Prediksi dengan komputasi pemodelan molekul menggunakan program hyperchem

Prosedur kerja komputasi dengan program hyperchem dapat dilihat pada

lampiran 1.

2. Aklimasi bahan

a. Pembuatan TCM Buffer 2X stok 200 ml

Larutkan 1,2 g Tris, 0,12 g KCl, 0,6 g CaCl2.2H2O, 0,08 g MgCl2.6H2O

dengan aquadest secukupnya. Lalu campur semuanya dan tambahkan aquadest

hingga 200 ml. Selanjutnya TCM Buffer 2X disterilkan dengan autoclave

selama 45 menit.

b. Pembuatan sediaan vitamin C yang mengandung TCM Buffer 2X & 0,03%

albumin (Stok vitamin C 200 mg/ml)

1) Dosis 1 : vitamin C 0,09 mg/ml

Ke dalam 10000 µL TCM Buffer 2X ditambahkan 24 µL albumin 25%

dan 9 µL vitamin C. Selanjutnya ditambahkan 9967 µL aquades steril

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(46)

22

Ke dalam 10000 µL TCM Buffer 2X ditambahkan 24 µL albumin 25%

dan 12 µL vitamin C selanjutnya ditambahkan 9964 µL aquades steril

Ke dalam 10000 µL TCM Buffer 2X ditambah 24 µL albumin 25% dan

15 µL vitamin C. Selanjutnya ditambahkan 9961 µL aquades steril

c. Pembuatan sediaan ciprofloxacin 0,08 mg/ml yang mengandung TCM Buffer

2X & 0,03% albumin (photosensitizer)

60 µL albumin 25% dan 2000 µL ciprofloxacin 2 mg/ml ditambahkan ke

dalam 25000 µL TCM Buffer 2X. Kemudian larutan tersebut ditambah

22940 µL aquades steril

d. Pembuatan sediaan furosemide 0,008 mg/ml yang mengandung TCM Buffer

2X & 0,03% albumin (photosensitizer)

60 µL albumin 25% dan 40 µL furosemide 10 mg/ml ditambahkan ke

dalam 25000 µL TCM Buffer 2X. Kemudian larutan tersebut ditambah

e. Pembuatan sediaan plasebo yang mengandung TCM Buffer 2X & 0,03%

albumin

15000 µL TCM Buffer 2X ditambah dengan 36 µL albumin 25% dan

3. Pembagian kelompok perlakuan

Pada penelitian ini terdapat 2 kelompok besar. Masing-masing kelompok

tersebut terbagi lagi menjadi 5 kelompok perlakuan. Jenis perlakuan untuk

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(47)

23

tiap kelompok antara lain :

a. Kelompok 1a

Pada hari pertama kelompok ini akan mendapatkan perlakuan tanpa

vitamin C (diberi plasebo). Di hari kedua kelompok ini akan mendapatkan

perlakuan dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml namun tidak diradiasi dengan

UVA 18 J/cm2.

b. Kelompok 1b

vitamin C (diberi plasebo). Di hari kedua kelompok ini akan mendapatkan

perlakuan dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan diradiasi dengan UVA 18

J/cm2.

c. Kelompok 1c

Pada hari pertama kelompok ini akan mendapatkan perlakuan dengan

vitamin C 0,09 mg/ml. Di hari kedua kelompok ini akan mendapatkan

J/cm2.

d. Kelompok 1d

J/cm2.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(48)

24

e. Kelompok 1e

J/cm2_.

f. Kelompok 2a

vitamin C (diberi plasebo). Di hari kedua kelo mpok ini akan mendapatkan

perlakuan dengan furosemide 0,008 mg/ml namun tidak diradiasi dengan

UVA 18 J/cm2_.

g. Kelompok 2b

vitamin C (diberi plasebo). Di hari kedua kelompok ini akan mend apatkan

perlakuan dengan furosemide 0,008 mg/ml dan diradiasi dengan UVA 18

J/cm2_.

h. Kelompok 2c

J/cm2_.

i. Kelompok 2d

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(49)

25

J/cm2.

j. Kelompok 2e

perlakuan dengan furosemide 0,008 mg/ml dan diradiasi denga n UVA 18

J/cm2.

4. Pembuatan pelet eritrosit

Darah diambil dari tiga relawan yang memiliki golongan darah yang sama.

Volume darah yang diambil dari masing-masing relawan adalah 3 ml.

Selanjutnya darah tersebut ditempatkan dalam venoject yang mengandung

EDTA dan disentrifugasi dengan kecepatan 2100 rpm selama 10 menit.

Setelah sentrifugasi supernatan dibuang. Kemudian endapan/eritrosit dicuci

dengan cara meresuspensi sel dengan PBS steril.

a. Resuspensi sel dengan PBS steril.

Dua mililiter PBS steril dimasukkan perlahan ke dalam tabung venoject

yang berisi endapan/eritrosit. Tabung venoject ditutup rapat, dikocok

dengan penggoyangan ringan, dan disentrifugasi 4200 rpm selama 5

menit. Supernatan dibuang. Proses resuspensi ini dilakukan sebanyak tiga

kali.

5. Inkubasi dengan vitamin C

396 µL TCM Buffer yang mengandung 0,03% albumin dengan berbagai

konsentrasi vitamin C sesuai perlakuan dimasukkan ke dalam eppendorf steril.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(50)

26

Ke dalam eppendorf-eppendorf steril tersebut ditambahkan 4 µL pelet

eritrosit, dikocok dengan penggoyangan ringan, lalu diinkubasi dalam gelap

selama 18 jam dalam inkubator dengan 5% CO2 dan temperature 37°C.

6. Inkubasi dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml atau furosemide 0,008 mg/ml dan radiasi UVA

Setelah inkubasi, dilakukan sentrifugasi 2100 rpm selama 10 menit, lalu

supernatan dibuang dengan mikropipet. Sel diresuspensi dengan

menambahkan 400 µl PBS steril ke dalam eppendorf lalu disentrifugasi 4200

rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dengan mikropipet.

200 µL ciprofloksasin 0,08 mg/ml dan furosemide 0,008 mg/ml ditambahkan

ke dalam tabung eppendorf sesuai dengan kelompok perlakuan

masing-masing dan diinkubasi 1 jam dalam inkubator 5% CO2 37°C. Setelah 1 jam,

kelompok perlakuan dengan UVA dipindahkan ke dalam microplate steril

sesuai peta well lalu diradiasi dengan UVA 18 J/cm2. Suspensi kemudian

dipindahkan ke dalam eppendorf dan diinkubasi selama 24 jam dalam

inkubator dengan 5% CO2 370C.

7. Pengukuran hemolisis

Suspensi di dalam tabung eppendorf disentrifugasi dengan kecepatan 2600

rpm selama 10 menit. 20 µL supernatan diambil dan dimasukkan ke

microplate (sesuai peta awal). Ke dalam microplate ditambahkan 180 µL

larutan Drabkin lalu dikocok dengan penggoyangan ringan. Selanjutnya

absorbansi dibaca dengan microplate reader dengan filter 450 nm.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(51)

27

PETA WELL PLATE

Keterangan : C 1 F C 2 F C 3 F C 1 C p C 2 C p C 3 C p F Cp F n o n U V A C p n o n U V A

C1F : kelompok vitamin C dosis 1 dengan furosemide 0,008 mg/ml dan

UVA 18 J/cm2

C1Cp : kelompok vitamin C dosis 1 dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml

dan UVA 18 J/cm2

N1

N2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(52)

28

dan UVA 18 J/cm2

F : kelompok tanpa vitamin C dengan furosemide 0,008 mg/ml dan

UVA 18 J/cm2

Cp : kelompok tanpa vitamin C dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan

UVA 18 J/cm2

F nonUVA : kelompok tanpa vitamin C dengan furosemide 0,008 mg/ml dan

tidak diradiasi UVA

Cp nonUVA : kelompok tanpa vitamin C dengan ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan

tidak diradiasi UVA

E. Analisis Hasil

Hasil pengujian ini akan dianalisis dengan analisis statistik uji t tidak

berpasangan dan ANOVA dengan p < 0,05.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(53)

29

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Prediksi Energi yang Diperlukan agar Ciprofloxacin dan Furosemide Berfungsi sebagai Photosensitizer dengan Komputasi Pemodelan Molekul

Dengan program HyperChem, penulis memprediksi energi yang diperlukan

agar ciprofloxacin dan furosemide berfungsi sebagai photosensitizer dengan

menghitung energi HOMO dan LUMO dari ciprofloxacin dan furosemide.

Tabel I. Energi HOMO dan LUMO ciprofloxacin

Metode Semiempiris Energi (eV)

MNDO AM1 PM3

HOMO - 9,120571 - 9, 110479 - 9,036491

LUMO - 0,9374977 - 0,8454623 - 0,9318895

? Energi 8,183037 8,265017 8,104602

Tabel II. Energi HOMO dan LUMO furosemide

Metode Semiempiris Energi (eV)

MNDO AM1 PM3

HOMO - 9,693231 - 9,369098 - 9,284696

LUMO - 1,521695 - 0,8592892 - 0,8592892

? Energi 8,171536 8.509809 8,243036

Tampak pada tabel di atas bahwa energi HOMO dan LUMO yang diperoleh

dari ketiga metode semiempiris menunjukkan nilai yang berbeda. Namun secara garis

besar dapat dikatakan bahwa ketiga metode tersebut menunjukkan hasil yang sama,

yaitu energi HOMO dan LUMO furosemide lebih rendah daripada energi HOMO dan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(54)

30

LUMO ciprofloxacin. Selain itu, berdasarkan perhitungan dengan metode AM1 dan

PM3, ? energi dari furosemide lebih besar daripada ciprofloxacin.

Selain itu, penulis juga menentukan spektra UV dari ciprofloxacin dan

furosemide. Penentuan spektra ini dimaksudkan untuk melihat apakah furosemide

dan ciprofloxacin memberikan serapan pada range panjang gelombang UVA.

Sebelum menentukan spektra serapan, penulis terlebih dahulu melakukan optimasi

bentuk geometri ciprofloxacin dan furosemide. Optimasi ini dilakukan dengan

metode semiempiris MNDO (Modified Neglect of Diatomic Overlap), AM1 (Austin

Model 1), PM3 (Parameterized Model 3). Adapun panas pembentukan yang

dihasilkan dari proses optimasi geometri dengan ketiga metode diatas dapat dilhat

pada tabel berikut.

Tabel III. Energi/panas pembentukan dengan metode semiempiris pada ciprofloxacin

Metode Energi/panas pembentukan (kcal/mol)

MNDO -115,3821335

AM1 -108,5714188

PM3 -126,5699844

Tabel IV. Energi/panas pembentukan dengan metode semiempiris pada furosemide

Metode Energi/panas pembentukan (kcal/mol)

MNDO 1,487449408

AM1 -132,7352448

PM3 -136,5048065

Dari bentuk goemetri yang telah optimal dengan tiga metode tersebut,

dilakukan penentuan spektra serapan dengan metode semiempiris ZINDO/s. Bentuk

spektra serapan ciprofloxacin dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(55)

31

Gambar 4. Spektra serapan ciprofloxacin berdasarkan bentuk geometri optimasi metode MNDO

Gambar 5. Spektra serapan ciprofloxacin berdasarkan bentuk geometri optimasi metode AM1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(56)

32

Gambar 6. Spektra serapan ciprofloxacin berdasarkan bentuk geometri optimasi metode PM3

Berdasarkan ketiga gambar di atas, tampak bahwa serapan yang terbesar

tidak terjadi pada range panjang gelombang UVA dan tidak terjadi serapan sama

sekali di range panjang gelombang UVA. Walaupun menunjukkan serapan di panjang

gelombang yang berbeda, namun ketiga metode tersebut menunjukkan bahwa serapan

maksimal ciprofloxacin terjadi pada range UVC. Selain di range panjang gelombang

UVC, ketiga metode tersebut juga menunjukkan serapan di range panjang gelombang

UVB. Adapun panjang gelombang pada range UVB yang menunjukkan serapan

ciprofloxacin dapat dilihat pada tabel di bawah ini (gambar dapat dilihat di lampiran)

Tabel V. Panjang gelombang range UVB yang menunjukkan serapan ciprofloxacin

Metode Panjang gelombang (nm)

MNDO 302,04

AM1 296

PM3 292,04

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(57)

33

Tidak adanya serapan ciprofloxacin pada range panjang gelombang UVA

yang ditunjukkan oleh hasil optimasi dengan komputasi bertentangan dengan

teori-teori sebelumnya yang mengatakan bahwa reaksi fotosensitivitas ciprofloxacin terjadi

pada range UVA. Oleh karena itu, penulis akan mengkaji hal tersebut dengan melihat

hasil dari metode fotohemolisis.

Lalu bagaimana dengan furosemide? Spektra serapan furosemide dapat

dilihat pada gambar berikut.

Gambar 7. Spektra serapan furosemide berdasarkan bentuk geometri optimasi metode MNDO

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(58)

34

Gambar 8 . Spektra serapan furosemide berdasarkan bentuk geometri optimasi metode AM1

Gambar 9. Spektra serapan furosemide berdasarkan bentuk geometri optimasi metode PM3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(59)

35

Sama seperti spektra serapan ciprofloxacin, serapan terbesar furosemide

yang ditentukan dengan metode MNDO, AM1, dam PM3 terjadi pada range panjang

gelombang UVC. Namun, berbeda dengan ciprofloxacin, furosemide tidak

menunjukkan serapan pada range panjang gelombang UVB.

Selain itu, ketiga spektra tersebut menunjukkan bahwa tidak terjadi serapan

pada range panjang gelombang UVA. Hal ini juga bertentangan dengan teori-teori

sebelumnya yang mengatakan bahwa reaksi fotosensitivitas furosemide terjadi pada

range UVA. Selain itu, menurut Rubino (2005), furosemide memiliki serapan

maksimal pada panjang gelombang 330 nm.

Spektra serapan furosemide yang hanya berada di range UVC menunjukkan

bahwa furosemide memerlukan energi untuk eksitasi yang lebih besar daripada

ciprofloxacin (energi UVC>UVB>UVA). Hal ini sesuai dengan ? energi HOMO dan

LUMO kedua obat tersebut. Berdasarkan perhitungan dengan metode AM1 dan PM3,

? energi dari furosemide lebih besar daripada ciprofloxacin.

B. Penentuan Dosis Vitamin C, Ciprofloxacin, dan Furosemide

Dosis vitamin C yang diperlukan dalam penelitian ini diacu dari penelitian

yang dilakukan oleh Rusfianti et al. (2003) tentang pengaruh dosis vitamin C pada

reaksi fotooksidasi membran sel. Pada penelitian tersebut digunakan variasi dosis

vitamin C, yaitu 0,05 mg/ml (250 mg), 0,1 mg/ml (500 mg), 0,2 mg/ml (1000 mg),

dan 0,6 mg/ml (3000 mg). Dari penelitian ini diperoleh hasil bahwa dosis vitamin C

0,1 mg/ml (500 mg) merupakan dosis terkecil yang berperan sebagai antioksidan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(60)

36

terhadap fotooksidasi membran sel. Penulis selanjutnya menentukan dosis teratas

dalam penelitian ini dengan mengambil nilai tengah dari dosis pertama dan kedua

dari penelitian Rusfianti et al. (2003) yang memberikan efek sehingga diperoleh dosis

0,15 mg/ml (750 mg). Selanjutnya dosis pertama dan kedua diperoleh dari

perhitungan log dosis 1,25 dari dosis teratas sehingga diperoleh dosis pertama 0,09

mg/ml (450 mg) dan dosis kedua 0,12 mg/ ml (600 mg).

Dalam penelitian ini penulis kesulitan dalam menentukan dosis

ciprofloxacin dan furosemide yang dapat menimbulkan reaksi fotosensitivitas. Oleh

karena itu penulis menggunakan dosis ciprofloxacin dan furosemide yang biasa

digunakan dalam 1 kali terapi pengobatan, yaitu 0,08 mg/ml (400 mg) dan 0,008

mg/ml (40 mg). Dosis kedua obat tersebut dikonversikan ke dalam satuan mg/ml

dengan membagi dosis obat tersebut dengan volume darah, yaitu 5 L.

C. Pengaruh Radiasi UVA 18 J/cm2 terhadap Reaksi Fotosensitivitas Ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan Furosemide 0,008 mg/ml

Pada penelitian ini terdapat kelompok perlakuan non UV dan UV.

Kelompok perlakuan non UV digunakan sebagai kelompok kontrol untuk melihat

apakah ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan furosemide 0,008 mg/ml terbukti menimbulkan

reaksi fotosensitivitas setelah diradiasi dengan UVA 18 J/cm2. Adapun data yang

diperoleh dapat dilihat pada tabel VI.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(61)

37

Tabel VI. Absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan furosemide 0,008 mg/ml Ciprofloxacin 0,08 mg/ml Furosemide 0,008 mg/ml

non UV UV non UV UV

0.131 0.14 0.133 0.18 0.164 0.144 0.091 0.162 0.102 0.146 0.135 0.144 0.217 0.158 0.092 0.125 0.146 0.147 0.148 0.133 0.127 0.138 0.129 0.147 0.125 0.12 0.126 0.155 0.12 0.153 0.146 0.139 0.131 0.142 0.133 0.136 0.132 0.136 0.126 0.129 0.145 0.149 0.138 0.131 0.118 0.155 0.117 0.153 0.123 0.126 0.125 0.14 0.144 0.131 0.142 0.133 0.132 0.134 0.142 0.129 0.131 0.136 0.138 0.118 0.137 0.148 0.132 0.133 0.144 0.132 0.135 0.135

Tabel VII. Absorbansi ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan furosemide 0,008 mg/ml yang memenuhi syarat linieritas

Ciprofloxacin 0,08 mg/ml Furosemide0,008 mg/ml

non UV UV non UV UV

0.131 0.14 0.133 0.18 0.164 0.144 0.135 0.162 0.102 0.146 0.135 0.144 0.217 0.158 0.132 0.125 0.146 0.147 0.148 0.133 0.127 0.138 0.129 0.147 0.125 0.12 0.126 0.155 0.12 0.153 0.146 0.139 0.131 0.142 0.133 0.136 0.132 0.136 0.126 0.129 0.145 0.149 0.138 0.131 0.118 0.155 0.117 0.153 0.123 0.126 0.125 0.14 0.144 0.131 0.142 0.133 0.132 0.134 0.142 0.129 0.131 0.136 0.138 0.118 0.137 0.148 0.133 0.144 0.132 0.135