PERANAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TERHADAP PERKEMBANGAN ILMU PENGETAHUAN
KARYA TULIS ILMIAH
Oleh
ELLIWATI HASIBUAN, S.Si, M.Si NIP. 1962 1017 2000 03 2 001
Pranata Laboratorium Perguruann Tinggi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
JUDUL KARYA TULIS ILMIAH : PERANAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR TERHADAP
PERKEMBANGAN ILMU PENGETAHUAN.
Nama : Elliwati Hasibuan, S.Si, M.Si
NIP : 1962 1017 2000 03 2 001
Karya tulis ilmiah ini telah disetujui oleh
Kepala LaboratoriumTerpadu Kultur Sel dan Jaringan
Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara
Medan, 8 Juni 2015 Disetujui,
PERNYATAAN
PERANAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TERHADAP PERKEMBANGAN ILMU PENGETAHUAN
KARYA TULIS ILMIAH
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam karya tulis ilmiah ini tidak terdapat karya pernah diajukan dan sepanjang pengetahuan saya tidak terdapat karya atau pendapat orang lain kecuali secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan sumbernya dalam daftar pustaka.
Medan, 8 Juni 2015 Penulis
Elliwati Hasibuan, S.Si, M.Si NIP. 196210172000 03 2001
ABSTRAK
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah juataan kali hanya dalam beberapa jam.
Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen Utama, yaitu DNA cetakan, Oligonukleotida primer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzin DNA Polimerase, dan komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan alat Termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperature untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat yaitu denaturasi, anneling dan pemanjangan untaian DNA. Produk PCR dapat di identifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
Kata kunci : polymerase Chain Reaction (PCR)
Medan, 8 Juni 2015 Penulis
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang memberi limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya tulis ilmiah yang berjudul : PERANAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR) TERHADAP PERKEMBANGAN ILMU
PENGETAHUAN
Ucapan terimakasih yang tak terhingga sampaikan kepada Bapak Prof. dr. Gontar Alamsyah Siregar dan ibu Dr. dr.Dina Keumala Sari, MG,SpGK selaku Kepala Laboratorium Kultur Sel dan Jaringan/Laboratorium Terpadu FK USU yang memberi saran dan dorongan sehingga Karya tulis ilmiah ini dapat diselesaikan.
Penulis menyadari Karya tulis ilmiah ini masih jauh dari sempurna, untuk itu kritik dan saran sangat penulis harapkan ntuk perbaikan dan penyempurnaan Karya Tulis Ilmiah ini.
Akhirnya penulis mengucapkan terimakasih atas segala perhatian yang telah diberikan.
Medan, 6 Juni 2015 Penulis,
Elliwati Hasibuan, S.S.i, M.Si
2.2. Tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR) ...4
2.3. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) ...8
2.4. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)………...10
2.5. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR). ………...11
BAB KESIMPULAN DAN SARAN...14
6.1.Kesimpulan…………..…...………14
6.2. Saran………15
DAFTAR GAMBAR
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis.Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers.Primer DNA suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan dan berasal dari patogen yang terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3‟ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium
menstimulasi aktivasi polimerase.
1.2. Permasalahan
1. Apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)? 2. Apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)?
3. Alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)?
1. 3. Tujuan
Dari rumusan masalah tersebut, maka beberapa tujuan yang ingin dicapai antara lain:
1. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR).
2. Untuk mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR).
3. Untuk mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR).
4. Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR).
5. Untuk mengetahui apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR).
1.4. Manfaat
Manfaat yang diperoleh dari penulisan ini untuk dapat memperoleh pengetahuan tentang proses Polymerase Chain Reaction (PCR) serta manfaat dari PCR bagi mahasiswa/peneliti.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengertian PCR
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic.Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.
perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipat gandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri.
PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR.
teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.
2.2. Tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Denaturasi
merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit.
Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut: 1).Denaturasi.
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC– 95oC.
2).PenempelanPrimer.
Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya misalnya pada 72oC.
3). Reaksi Polimerisasi (Extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3‟nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA
polimerase.
Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3‟
dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5‟-nya.Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut
Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
a). Pradenaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
b). Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.
2.3. Gambar Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)
a. Gambar thermocycler
Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik reaksi berantai polimerase
1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2) 3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing
sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus) 5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N‟-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, N‟N „Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)
Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer) 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)
1).Enzim DNAPolymerase
Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik.Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin
2). Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan synthesizer. komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa.Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target.Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA
3). Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi
2.5. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaction (PCR Polymerase Chain) dapat digunakan untuk: a. Amplifikasi urutan nukleotida.
b. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi. c. Bidang kedokteran forensik.
d. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
1). Isolasi Gen.
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut „junk
DNA‟, DNA „sampah‟ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus „mengorbankan‟ sapi atau babi.
Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama „probe‟ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita
inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
2). DNA Sequencing.
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
3). Identifikasi Forensik.
DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya
dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung.Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Banyak orang yang juga yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua „sesungguhnya‟ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
4). Diagnosa Penyakit.
BAB 3
KESIMPULAN DAN SARAN 3.1. Kesimpulan
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro.
PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.
Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR), Enzim DNA Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi; Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2.
Manfaat Polymerase Chain Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan DNA “finger print”.
3.2. Saran
DAFTAR PUSTAKA
Annas Kurniawan, 2012 PCR (Polimerase Chain Reaction) Universitas Pendidikan Ganeshan Singaraja Bali
Budi, Siska. 2012. “PCR ( Polymerase Chain Reaction )” (Online).
Yudha. 2012. “Polymerase Chain Reaction (PCR)”. (Online). http://biologi-yudha. blogspot .com /2012/ 06/ polymerase-chain-reaction-pcr.html.
Mahmudin, 2010 Polimerase Chain Reaction (PCR)
Nasir, M 2002 Bioteknologi Molekuler. Citra Aditya Bandung
Zuhriana K Yusuf 2010 Saintek vol 5, N0 6, Tahun 2010 Polimerase Chain
