ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI SIMBION LARVA Oryctes rhinoceros L. DARI BATANG SAWIT DAN TANKOS
MELALUI UJI BIOKIMIA DAN MOLEKULER SERTA PERANAN BAKTERI TERHADAP PENGOMPOSAN
TESIS
Oleh
OCTANINA SARI BR SIJABAT 157001022 / M.AET
PROGRAM MAGISTER AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2018
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI SIMBION LARVA Oryctes rhinoceros L. DARI BATANG SAWIT DAN TANKOS
MELALUI UJI BIOKIMIA DAN MOLEKULER SERTA PERANAN BAKTERI TERHADAP PENGOMPOSAN
TESIS
Oleh
OCTANINA SARI BR SIJABAT 157001022
Tesis Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister Pertanian Dalam Program Studi Agroteknologi
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara
PROGRAM MAGISTER AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2018
Judul Penelitian : ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI SIMBION LARVA Oryctes rhinoceros L. DARI BATANG SAWIT DAN TANKOS MELALUI UJI BIOKIMIA DAN MOLEKULER SERTA PERANAN BAKTERI TERHADAP PENGOMPOSAN
Nama : Octanina Sari Br Sijabat
Nim : 157001022
Program Studi : Magister Agroteknologi
Menyetujui, Komisi Pembimbing
( Dr.Ir.Marheni,M.P ) ( Prof. Dr.Ir.Darma Bakti,M.S) Ketua Anggota
Ketua Program Studi Agroteknologi Dekan Fakultas Pertanian
( Prof.Ir.Edison Purba, Ph.D ) ( Dr.Ir.Hasanuddin, M.S)
Tanggal Lulus : 14 Desember 2017
Telah diuji pada tanggal : 14 Desember 2017
PANITIA PENGUJI TESIS:
Ketua : Dr. Ir Marheni, M.P
Anggota : Prof. Dr Ir. Darma Bakti, M.S Penguji : 1. Dr. Ir. Hasanuddin, M.S
2. Prof. Dr.Ir. Abdul Rauf, M.P
PERNYATAAN
Judul Tesis
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI SIMBION LARVA Oryctes rhinoceros L. DARI BATANG SAWIT DAN TANKOS MELALUI
UJI BIOKIMIA DAN MOLEKULER SERTA PERANAN BAKTERI TERHADAP PENGOMPOSAN
Dengan ini penulis menyatakan bahwa tesis ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Magister Agroteknologi pada Program Studi Magister Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara adalah benar merupakan karya penulis sendiri.
Adapun pengutipan-pengutipan yang penulis lakukan pada bagian-bagian tertentu dari hasil karya orang lain dalam penulisan tesis ini, telah penulis cantumkan sumbernya secara jelas sesuai dengan norma, kaidah dan etika penulisan ilmiah.
Apabila di kemudian hari ternyata ditemukan seluruh atau sebagian tesis ini bukan hasil karya penulis sendiri atau adanya plagiat dalam bagian-bagian tertentu, penulis bersedia menerima sanksi pencabutan gelar akademik yang
penulis sandang dan sanksi-sanksi lainnya sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku.
Medan, Desember 2017 Penulis,
Octanina Sari Br. Sijabat
Abstract
OctaninaSari Sijabat, 2017.The Identification of Bacterial Symbiont’s of The Larvae Oryctes rhinoceros L. From Empty bunches and palm stems using Biochemical test and Molekuler and The Role of The bacteria in Composting Process. Supervied by Dr.Ir.Marheni, M.P and Prof.Dr.Ir.DarmaBakti, M.S
Oryctes rhinoceros L. has symbioses with micro organisms in their hind guts which further break down plant material consumed by beetle. The aim of this research is to determine the identification of the existence of the bacterial species in the hind gut larvae of the symbiotic bacteria using biochemical test and analysis based on 16S rRNA. The result of this research indicate that there were two differentbacterials:Bacillus siamensis and Bacillus stratosphericus found. The bacteria was used for starting the composting 30 days was accelerated to 18 days and more specifically, the Bacillus siamensis can speed up composting with the end result at C/N 13.16.
Keywords : Larvae O. rhinoceros L, Bacterial Symbionts, 16S rRNA, Composting.
ABSTRAK
Octanina Sari Sijabat, 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Simbion Larva Oryctes rhinoceros L. Dari Batang Sawit Dan Tankos Melalui Uji Biokimia dan Molekuler Serta Peranan Bakteri Terhadap Pengomposan. Dibimbing oleh Dr.Ir.Marheni,M.P dan Prof.Dr.Ir.DarmaBakti,M.S
Adanya bakteri simbion larva Oryctes rhinoceros L. pada saluran pencernaan bagian belakang yang mana kumbang ini mengkonsumsi bahan batang tanaman dan tankos. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi bakteri simbion yang ada di usus belakang larva melalui uji biokimia dan molukuler 16S rRNA. Hasil dari penelitian ini ditemukan bahwa terdapat dua spesies bakteri yang berbeda Bacillus siamensis and Bacillus stratosphericus.
Bakteri simbion ini dapat digunakan untuk mempercepat kematangan kompos dari 30 hari menjadi 18 hari. Khususnya Bacillus siamensis dengan hasil C/N 13.16
Kata Kunci : Larva O. rhinoceros L, Bakteri Simbion, 16S rRNA, Pengomposan
KATA PENGANTAR
Puji dan Syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkat Rahmat dan Karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
Adapun judul tesis adalah“Isolasi dan Identifikasi Bakteri Simbion Larva Oryctes rhinoceros L. dari Batang Sawit dan Tankos Melalui Uji Biokimia dan Molekuler Serta Peranan Bakteri Terhadap Pengomposan”
Tesis merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Pertanian pada program studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan
Dengan selesainya penulisan Tesis ini, penulis menyampaikan rasa
terimakasih dan penghargaan kepada ketua komisi pembimbing yaitu Dr. Ir Marheni, M.P dan Anggota pembimbing Bapak Prof. Dr Ir. Darma Bakti,
M.S atas bimbingan dan pengarahan kepada penulis mulai dari perencanaan penelitian hingga penyelesaian penulisan Tesis ini.
Ucapan terimakasih penulis sampaikan juga kepada Rektor Universitas Sumatera Utara Bapak Prof Dr Runtung Sitepu, SH. Mhum, Dekan Fakultas Pertanian Bapak Dr. Ir. Hasanuddin, M.S dan Ketua Program Magister Agroteknologi USU Bapak Prof, Ir Edison Purba Ph.D yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan program PascaSarjana.
Kepada orangtua, ayahanda L.M Sijabat dan ibunda N. Br Sembiring Meliala, abang dan adik Joan Egia Sijabat, SPd, Jan Piyanta Sijabat, Amd, Jerry Afrimsya Sijabat, S.P, Arnila Sari Br Sijabat, S.P terimakasih atas pendidikan, dukungan moral dan material, nasihat dan doa sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan ini. Serta seluruh keluarga dan sahabat Pasukan 11 (Maya, Yunda, Cholis, Kia, Kevin, Whin, Iklas, Anton, Tri, April), Frans Panjaitan, Koko Tampubolon, Faisal Nst, Vera, Fitra, Lisda dan seluruh sahabat yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan dalam menyelesaikan pendidikan ini, penulis mengucapkan terimakasih.
Medan, Desember 2017 Penulis
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Selayang pada tanggal 30 Oktober 1985 dari Ayah L.M Sijabat dan Ibu N. Br Sembiring Meliala. Penulis merupakan putri ke-tiga dari lima bersaudara.
Penulis lulus SD Negeri 054874 Selayang tahun 1997, lulus SMP Taman Siswa Binjai tahun 2000, Pada tahun 2003 Penulis lulus dari SMU Negeri 3 Binjai dan melanjutkan Perguruan tinggi Universitas Sumatera Utara Fakultas Pertanian Jurusan Ilmu Hama Penyakit Tumbuhan melalui Jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada tahun 2008 penulis mendapatkan gelar Sarjana Pertanian (S.P). Pada tahun 2016 penulis mendapatkan kesempatan melanjutkan pendidikan kejenjang Magister (S2) Fakultas Pertanian Jurusan Agroteknologi Universitas Sumatera Utara.
Hal.
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRACT ... i
ABSTRAK ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
RIWAYAT HIDUP ... iv
DAFTAR ISI ... v
DAFTAR TABEL ... vi
DAFTAR GAMBAR ... ... vii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
I. PENDAHULUAN... 1
1.1. LatarBelakang ... 1
1.2. Rumusan Masalah ... 4
1.3. TujuanPenelitian ... 5
1.4. Hipotesis... 5
1.5. ManfaatPenelitian ... 5
II. TINJAUAN PUSTAKA ... 6
2.1. BiologiOryctes rhinoceros L. ... 6
2.2. Tandan Kosong Sawit dan Batang Sawit ... 8
2.3. Bakteri Simbion ... 9
2.4. Pengomposan ... 14
III. METODE PENELITIAN ... 16
3.1.TempatdanWaktu ... 16
3.2. Bahan dan Alat ... 16
Bahan ... 16
Alat ... 16
3.3.Metode Penelitian ... 17
3.4.Pelaksanaan Penelitian ... 17
3.4.1. Isolasi Bakteri Simbion Dari Usus larva ... 18
3.4.2. Pemurnian Bakteri ... 19
3.4.3 Teknik Pewarnaan Gram ... 20
3.4.4. Uji Biokimia Bakteri ... 20
3.4.5. Uji Molekuler 16S rRNA... ... 22
3.4.6. Tahap Pengomposan ... 23
3.5.Pengamatan ... 24
3.5.1. KarakteristikMorfologiBakteri Simbion ... 24
3.5.2.IdentifikasiSpesiesBakteriBerdasarkan 16 S rRNA ... 24
3.5.3. SkalaKematanganKompos ... 24
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 25
V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 39
DAFTAR PUSTAKA ... 40 LAMPIRAN
DAFTAR TABEL
No. Judul Hal.
1. Presentase Kerusakan Serangan Hama ... 8 2. Hasil Identifikasi Morfologi dan Uji Biokimia ... 26 3. Kondisi Fisik Kompos ... ……… 36
DAFTAR GAMBAR
No. Judul Hal.
1. Telur O. rhinoceros L ... 6
2. Tandan kosong di Lapangan ... 8
3. Batang Sawit Mati di lapangan ... 9
4. Pohon Phylogenik ... 30
5. Suhu Harian Pengomposan ... 32
6. Penyusutan Bahan Kompos ... 37
DAFTAR LAMPIRAN
No. Judul Hal.
1. Kerangka Penelitian ... 46
2. Larva Oryctes rhinoceros L. ... 47
3. Proses Isolasi Bakteri dari Batang ... 48
4. Proses Isolasi Bakteri dari Tankos ... 48
5. Pewarnaan Bakteri ... 49
6. Uji Biokimia... 50
7. Pita DNA ... 51
8. Hasil Squancing Bakteri Simbion Larva dari Batang ... 52
9. Hasil Squancing Bakteri Simbion Larva dari Tankos ... 53
10. Persiapan Pengomposan... 54
11. Suhu Harian Pengomposan ... 55
12. Standar Kualitas Kompos ... 56
13. Perubahan Warna Pengomposan Berdasarkan Munsell ... 57
14. Hasil Akhir Pengomposan ... 58
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Oryctes rhinoceros L. (Coleoptera:Scarabaeidae) merupakan hama penting pada tanaman kelapa sawit di Indonesia. Di Sumatera Utara O. rhinoceros semula diketahui sebagai hama utama tanaman kelapa sawit belum menghasilkan (TBM), namun hama ini kemudian ditemukan juga pada tanaman sudah menghasilkan (TM) (Pasaribu dan de Chenon, 2005; Utomo et al., 2007).
Kumbang dewasa terbang ke tajuk kelapa sawit pada malam hari dan mulai bergerak ke bagian paling atas ketiak pelepah daun.Kumbang merusak pelepah daun yang belum terbuka dan dapat menyebabkan pelepah patah.
Kerusakan pada tanaman baru terlihat jelas setelah daun membuka 1-2 bulan kemudian berupa guntingan segitiga seperti huruf ”V”. Gejala ini merupakan ciri khas kumbang O.rhinoceros. Hama ini dapat menurunkan produksi tandan buah segar pada panen tahun pertama hingga 60% dan menimbulkan kematian tanaman muda hingga 25 % (Susanto et al., 2011).
Kebijakan tanpa bakar yang diberlakukan di perkebunan kelapa sawit yaitu melarang pembakaran pembukaan lahan, pembakaran pohon-pohon tua untuk menanam kembali dan tandan kosong.Pemberlakuan kebijakan ini menyebabkan terjadinya penumpukan bahan organik di lapangan yang dijadikan sebagai sumber
unsur organik yang dapat mendukung pertumbuhan dan produksi sawit (Purba et al., 1997).
Permasalahan hama kumbang badak ini semakin serius dengan pemanfaatan tandan kosong pada areal tanaman kelapa sawit sebagai mulsa dan pengganti pupuk non organik. Pemanfaatan tandan kosong banyak diaplikasikan
pada areal tanaman belum menghasilkan (TBM) dan pada tanaman menghasilkan (TM).Dampak negatif pemanfaatan tandan kosong yaitu sebagai tempat berkembangbiak O. rhinoceros. Akibat serangan hama ini perkebunan kelapa
sawit bisa mengalami kerugian finansial yang sangat besar (Santi dan Sumaryo, 2008).
Tersedianya tumpukan batang kelapa sawit baik yang masih berdiri maupun yang sudah dicacah memberi peluang bagi O. rhinoceros untuk mendapatkan tempat peneluran. Ketersediaan bahan organik menyediakan makanan dan peletakan telur bagi kumbang, selanjutnya kumbang akan meletakkan telur pada sisa-sisa bahan organik yang telah melapuk. Bahan- bahan organik tersebut seperti batang kelapa sawit yang masih berdiri dan telah melapuk, rumpukan batang kelapa sawit, batang kelapa sawit yang telah dicacah, serbuk gergaji, tunggul-tunggul karet serta tumpukan tandan kosong kelapa sawit (PPKS, 2012).
Proses dekomposisi suatu media menunjukkan adanya perubahan fisik dan
kimia dari media bahan organik. Senyawa fenol dan fenil fenol memikat O. rhinoceros datang dan menjadikan bahan organik tersebut sebagai media
peneluran (Renou et al., 1998).
Bahan organik Tandan kosong kelapa sawit merupakan limbah utama dari industri pengolahan kelapa sawit menjadi minyak sawit. Persentase limbah TKKS adalah 23% dari tandan buah segar, sedangkan persentase serat dan cangkang biji masing-masing adalah 13% dan 5,5% dari tandan buah segar. Komponen utama dari limbah padat kelapa sawit adalah selulosa dan lignin sehingga limbah ini disebut juga limbah lignoselulosa (Fuadi dan Heri, 2016).
Saluran pencernaan serangga memiliki mikroorganisme nonpathogenik yang banyak,didalam usus dapat menyimpan 105-109 sel prokariotik yang telah berafiliasi dengan dua puluh enam filum.Mikrobiota serangga sangat penting untuk pertumbuhan dan perkembangan normal, hal initelah ditunjukkan bahwa sekitar 65% serangga memiliki bakteri simbiotik. Hubungan simbiosis antara bakteri dan serangga bervariasi dari mutualistik dan komensal. Berdasarkan peran bakteri simbion tersebut, simbion intraselular pada serangga diklasifikasikan sebagai endosimbion primer atau sekunder. Penggerek akar sawit dari genus Oryctes dianggap sebagai hama yang sangat merugikan. Adanya endosymbionts pada genus Oryctes,asosiasiserangga-bakteri dalam hal ini akan berguna untuk pengendalian hama serangga potensial (Elsayed et al., 2015).
Kemampuan mikroba dalam proses degradasi ini dikarenakan mikroba memiliki enzim selulase. Mikroba di dalam usus rayap merupakan mikroba simbion yang saling berhubungan dengan organisme lain dalam proses pendegradasian lignoselulosa (Shelton dan Grace, 2003 ; Mackenzie, 2007;
Berlanga et al., 2011 dalam Aini, 2015).
Hidrolisis polysakarida adalah proses kunci dari pencernaan makanan serangga herbivora. Serangga herbivora dapat memanfaatkan lignocellulosa sebagai sumber energi, kemampuan ini didukung oleh adanya mikroba dalam usus yang menghasilkan enzim hidrolitik (Arumsari et al., 2016).
Pada proses pengomposan bakteri yang berperan sangat beragam. Bakteri yang berperan dalam degradasi selulosa merupakan bakteri simbion yang tidak hanya diperankan oleh bakteri selulolitik tetapi juga diperankan oleh bakteri non selulolitik yang membantu dalam proses degradasi material kompos lainnya.
Dalam tubuh rayap terdapat bakteri yang dapat mencerna selulosa dalam bentuk kertas filter hingga 65% lebih tinggi bila dibandingkan dengan bakteri dalam tubuh siput, cacing tanah dan ulat bulu. Mikroorganisme yang sering dimanfaatkan dalam proses degradasi sekaligus sebagai penyubur akar tanaman diantaranya adalahPseudomonas sp, Bacillussp, dan Streptomycessp(Suwanto dan Agustiyani, 2011;Gupta et al., 2012).
1.2. Rumusan Masalah
Keberadaan hama sangat merugikan dalam lahan pertanian dapat menimbulkan kerugian yang cukup besar, seperti kumbang tanduk yang menyerang perkebunan kelapa sawit dari tanaman belum menghasilkan (TBM) sampai tanaman menghasilkan (TM). Keberadaan hama ini semakin dipercepat karena tersedianya tempat perkembangbiakan hama dilapangan seperti batang sawit yang sudah tidak produktif (mati) yang dibiarkan dilapangan dan tandan kosong kelapa sawit yang ditumpukkan disekitar piringan batang sawit. Adanya bakteri simbion yang dapat mensintesa lignoselulosa yang dikonsumsi sehingga perlu diketahui spesies bakteri simbion tersebut untuk mengenal karakteristikny amelalui uji biokimia dan molekuler serta peranan bakteri tersebut untuk mempercepat kematangan pengomposan.
1.3. Tujuan Penelitian
- Melakukan karakterisasi fisiologis dan morfologi, pada bakteri simbion dari saluran pencernaan Larva O. rhinoceros L Pada tandan kosong dan batang sawit.
- Mengidentifikasi spesies berdasarkan sekuen gen pengkode 16S rRNA pada bakteri simbion pada larva O. rhinoceros pada tandan kosong sawit dan batang sawit.
- Memanfaatkan bakteri simbion larva menjadi starter pembuatan kompos.
1.4. Hipotesa Penelitian
- Adanya perbedaan fisiologi dan morfologi bakteri simbion larva
- Adanya perbedaan spesies bakteri simbion Larva O. rhinoceros L. pada batang kelapa sawit dan tandan kosong sawit.
- Bakteri simbion dapat membantu mempercepat skala kematangan kompos.
1.5. Manfaat Penelitian
Hasil yang diperoleh dari karakterisasi fisiologis dan molekuler diharapkan memberikan informasi mengenai identitas bakteri simbion dari saluran pencernaan Larva O. rhinoceros L. Pada tandan kosong dan batang sawit dan bakteri simbion tersebut dapat dimanfaatkan sebagai starter pengomposan untuk mempercepat kematangan pembuatan kompos.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Biologi Oryctes rhinoceros L
Kumbang O. rhinoceros.Ltermasuk (Coleoptera:Scarabaeidae) mengalami metamorfosis sempurna.Hama inimeletakkantelur pada sisa-sisa bahan organik.(Gambar 1).
Gambar 1.Telur O.rhinoceros L.
Sumber: Nugroho, 2009
Setiap gumpalan serat media berisi satu butir telur, telur berbentuk lonjong dan
berubah menjadi oval, saat telur berumur satu minggu memiliki panjang 4,75-5,80 mm dan lebar 2,95–3,25 mm dan diameter 3–4 mm. Periode telur
berlangsung selama 11–13 hari. Telur didalam gumpalan serat tandan kosong sawit dan batang sawit (Susanto et al., 2011)
Larva terdiri dari tiga instar, instar pertama 12–21 hari, instar kedua 21–60 hari dan instar ketiga 60–165 hari. Larva memiliki tiga pasang tungkai.Larva sering tampak melengkung membentuk setengah lingkaran (lampiran 2), berwarna keputih–putihan dengan caput yang berwarna kehitaman. Larva instar satu
1
berukuran 7–8 mm dan larva dewasa 60-105 mm dengan lebar 25 mm. Larva dewasa menjelang pupa akan menjalin dan membalut tubuhnya dengan serat tandan kosong sawit lalu berada dalam gulungan serat sampai menjadi imago (Susanto et al, 2011).
Hasil penelitian Marheni (2012) menyebutkan perbedaan tempat berkembang larva menyebabkan umur stadia larva juga berbeda, Umur perkembangan setiap instar larva dengan pakan tandan kosong sawit lebih singkat dibandingkan larva yang berada dalam batang sawit. Larva yang berkembang pada batang sawit umurnya dapat mencapai 151 hari sedangkan masa stadia larva dengan pakan tandan kosong sawitberlangsung selama 102 hari.
Pupa yang baru muncul berwarna putih dan lama kelamaan menjadi cokelat kemerahan, masa pupa 19 – 27 hari hidup dalam kokon yang dibuat dari bahan–bahan organik disekitar tempat hidupnya.Pupa jantan memiliki ukuran 3–
5cm dan betina lebih pendek (Prawirosukarto et al, 2000).
Kumbang berwarna cokelat gelap sampai hitam, mengkilap, panjang 35-50 mm dan lebar 20-23 mm dengan satu tanduk yang menonjol pada bagian kepala.
Jantan memiliki tanduk yang lebih panjang dari betina, sedangkan betina mempunyai banyak rambut pada ujung ruas terakhir abdomen dan jantan tidak memiliki rambut tersebut.Umur betina lebih panjang dari umur jantan dan kumbang yang baru jadi akan tetap tinggal di tempatnya antara 15-20 hari kemudian terbang keluar dapat hidup sekitar 6-9 bulan (Mariau, 1991).
Skala untuk menentukan intensitas kerusakan yang disebabkan oleh O. rhinoceros (Lobalohin et al., 2014) (Tabel 1).
Tabel.1 Persentase Kerusakan Serangan Hama
Skala Persentase Kerusakan (%) Kriteria
0 0 Normal
1 0 < x ≤ 25 Ringan
2 25 < x ≤ 50 Sedang
3 50 < x ≤ 75 Berat
4 x > 75 Sangat berat
2.2. Tandan kosong sawit dan Batang sawit
Secara fisik, tandan kosong kelapa sawit merupakan sumber serat dan dapat memenuhi kebutuhan produk-produk berbasis serat untuk material komposit polipot pengganti media tanam dan sebagainya.Berdasarkan kandungan haranya, 75% TKS yang dihasilkan PKS diaplikasikan sebagai mulsa di perkebunan kelapa sawit sedangkan 25% sisanya dikonversi menjadi kompos. Rasio C/N TKS yang tepat dapat diaplikasikan sebagai bahan pembenah tanah untuk memperbaiki proses penyerapan pupuk (Nasution at al., 2014). (Gambar 2).
Gambar 2. Tandan Kosong yang diaplikasikan di lapangan Sumber: Nugroho, 2009
Batang sawitmengandung 45,7% selulosa; 14,4%, hemiselulosa dan Lignin 18,8%, Pada tandan kosong sawit mengandung; 45,95%, selulosa; 22,85%,
2
hemiselulosa dan lignin; 16,49% (Sidebang, 2008). Kandungan lignin lebih kompleks dan lunak pada tandan kosong kelapa sawit dibandingkan lignin dan serat pada batang (Ibrahim dan Chuah, 2004).(Gambar 3).
Gambar 3. Batang sawit yang membusuk Sumber: Nugroho, 2009
Media perkembangbiakan yang digunakan oleh O.rhinoceros untuk melakukan perkawinan, meletakkan telur, makanan larva dan tempat pupa sampai dewasa.Imago betina datang dan meletakkan telur pada tandan kosong sawit dan onggokan batang sawit(Rahayuwati et al.,2002; Pasaribu &Chenon, 2005).
2.3. Bakteri Simbion Serangga
Saluran pencernaan merupakan penghubung antara lingkungan dengan fisiologis hewan, sehingga kemungkinan secara permanen mengandung mikroba yang berasal dari lingkungan.Bakteri tersebut kemungkinan bersifat patogen ataupun menguntungkan (Anam et al, 2012).
Serangga yang mencerna komponen kayu menggunakan lignoselulosa sebagai nutrisi sering dibantu oleh mikroorganisme dengan berbagai cara diantaranya akuisisi enzim yang dihasilkan mikroba pada substrat yang dicerna,
3
pencernaan pendahuluan substrat oleh mikroorganisme sebelum dicerna, kemudian pengayaan bahan nutrisi dalam bentuk sel mikrobial dan metabolit, selanjutnya pengeluaran dan detoksifikasi zat ekstraktif kayu, mikroba yang hidup diusus menghasilkan dan melepaskan enzim dan mikroorganisme yang bekerja sebagai pengurai yang melepaskan sumber karbon utama untuk asimilasi serangga (Muin et al, 2010).
Pencernaan dan penyerapan bahan makanan berlangsung pada bagian saluran pencernaan yang dibagi tiga: usus depan, usus tengah, usus belakang, proses pencernaan makanan berlangsung di usus belakang, di bagian ini terdapat sejumlah bakteri simbion yang mengeluarkan enzim selulase untuk menguraikan selulosa (Solihat, 2006).
Keberadaan mikroba di dalam usus rayap merupakan suatu bentuk interaksiyang menguntungkan.Rayap memberikanperlindungan berupa tempat yang anaerob dan makanan bagi mikroba. Mikroba menyumbang enzim selulase untuk membantu prosespencernaan serat kasar bagi rayap.Didalam saluran pencernaan rayap terdapatmikroba selulolitik yang berperan dalam mendegradasi partikel-partikel kayumenjadi senyawa terlarut yang banyak mengandung selulosa (kurang lebih 40-45% bahan kering).Bakteri berperandalam menjaga keseimbangan populasi dan metabolisme di dalam saluranpencernaan rayap.Selain itu, beberapa bakteri mampu mendegradasi selulosa.
Dalam melakukan aktivitasnya, bakteri membutuhkan nitrogen dan fosfor darilingkungan saluran pencernaan.Simbion menciptakan kondisi yang cocok untuk protozoa simbion melaluiproduksi nutrisi dan penjagaan kondisi keasaman dan anaerob di saluran pencernaan (Sineb, 2016).
Keanekaragaman bakteri dapat dieksplorasi dengan menggunakan karakterisasi
fenotip yang meliputi karakter morfologi, fisiologis, dan reaksi biokimia (Holtet al., 1994).
Pewarnaan gram mempermudah pemeriksaan mikroskopikuntuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi dengan cara mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pewarnaan. Reaksi pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan komposisi kimiawi dinding sel bakteri.Sel-sel gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal, sedangkan lapisan peptidoglikan pada sel-sel gram negatip jauh lebih tipis. Pewarnaan gram menggunakan empat macam pereaksi yang berbeda, yang dibagi menjadi pewarna primer biasanya menggunakan kristal violet, pereaksi peluntur menggunakan lugol-iodine, senyawa pemucat menggunakan etil alkohol 95%, dan terakhir pewarna pembanding menggunakan safranin (James etal., 2014; Setiawan, 2016).
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode konvensional dan molekuler. Metode konvensional dapat dilakukan dengan berdasarkan pada karakteristik fenotip yaitu pewarnaan gram, morfologi dan reaksi biokimia. Namun, metode identifikasi bakteri secara konvensional ini memiliki beberapa kelemahan.Metoda ini tidak dapat digunakan untuk organisme yang belum teridentifikasi. Lebih lanjut, kita kadang-kadang dihadapkan dengan organisme yang menunjukkan karakteristik biokimia yang tidak cocok dengan pola setiap genus dan spesies yang dikenal. Sementara itu, identifikasi organisme
ketika dikultur tumbuhnya lambat menjadisangat sulit (Woo et al., 2003; Setiawan, 2016).
Karakter fisik dan biokimiamerupakan karakter yang tidak statis dan berubah karena adanya stress dan evolusi, maka hal ini juga mempengaruhi hasil identifikasi (Ochman et al., 2005).
Identifikasi dapat dilakukan melalui penentuan 16S rDNA (gen16S rRNA) dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) sekuensing.Segmen 16S rDNA bakteri diamplifikasi melalui PCR, lalu urutannya ditentukan melalui sekuensing.Urutan basa dari 16S rDNA tersebut dibandingkan dengan berbagai urutan 16S rDNA dari berbagai organisme prokariot pada gene bank.
Perbandingan urutan 16S rDNA juga merupakan cara untuk mengetahui filogenetik dan evolusi diantara berbagai organisme prokariot, karena gen ini mengandung sekuenurutan DNA yang sangat terkonservasi (Innis et al., 1990).
Beberapa famili dari kumbang telah berevolusi dengan symbiosis kompleks dengan mikroorganisme seperti kumbang badak (O. rhinoceros L.)yang
memiliki koloni bakteri penghasil metana di dalam usus belakangnya (Speight, 1998).
Larva O. rhinoceros yang diambil dari kompos jerami padi dapat diisolasi dan diidentifikasi ditemukan Bacillus. Bakteri ini juga ditemukan pada larva Holotrichia parallela(Coleoptera:Scarabaeidae) pada instar ketiga.Bacillus dapat bertahan dalam waktu yang cukup tinggi berkisar dari suhu dan pH seperti di dalam saluran pencernaan larva lepidoptera ( Arumsari et al., 2016).
Bacillus spp.Adalahkelompok bakterigram positif. berbentuk batang dan lurus, berukuran 0.5-2.5 μl x 1.2-10 μl, dan dapat membentuk rantai atau juga berpasangan dengan ujung yang bulat atau persegi. Umumnya endospora berbentuk oval, terkadang berbentuk bulat atau silinder dan sangat tahan pada
kondisi aerobik atau aerobik fakultatif, dengan kemampuan fisiologis yang peka terhadap panas, pH, dan salinitas. Bakteri tersebut dapat ditemukan pada habitat
yang luas, beberapa spesies adalah patogen pada vertebrata dan invertebrata (Holt et al., 1994).
Bacillus spp. memiliki kemampuan antagonis berupa antibiosis terhadap jamur (Abidin et al.,2015). Antimikroba dan antifungal yang dihasilkan oleh Bacillus sp. diantaranya adalah surfactin (fengycin, iturin, bacillomycin) dan senyawa peptid antibiotik lain(Stein,2005).Selain itu, Bacillus sp. mampu memacu pertumbuhan bagi tanaman karena diketahui dapat membantu menghasilkan hormon pertumbuhan seperti asam indoleasetat (IAA), asam giberelat, sitokinin, dan etilen pada tanaman (Sulistiani. 2009).
Bacillus spp mampu memanfaatkan bahan organik yang terkandung di dalam limbah dengan cara melepaskan enzim untuk menguraikan senyawa organik untuk menghasilkan produk sampingan berupa gas karbondioksida (CO2), metana (CH4), hidrogen (H2) dan air (H2O), serta energi sebagai penunjang aktivitas metabolism. Karakteristik Bacillus sp. Adalah selulolitik, proteolitik, lipolitik, dan amilolitik (Retnosari, 2013).
Genus bacillus dapat menghasilkan Senyawa antibiotik yang dapat merusak dinding sel bakteri patogen.Sehingga aktivitas metabolisme bakteri patogen menjadi terganggu dan menyebabkan sel bakteri patogen mati. Adanya pengaruh senyawa antibiotik juga memiliki peran dalam proses sintesa protein sel. Sintesa protein sel dapat terhambat bila terkena senyawa antibiotik sehingga sel menjadi rusak dan tidak dapat melakukan sintesa protein (Javandira et al., 2013).
2.4. Pengomposan
Pemanfaatan sampah ataupun limbah menjadi suatu produk yang mempunyai nilai ekonomi merupakan sesuatu yang diharapkan semua pihak.Pemanfaatan limbah padat memerlukan teknologi yang tepat sesuai dengan karakteristik limbah (Choiriah, 2006).
Serasah adalah salah satu sumber hara karena mempunyai peranan penting bagi tanah dan mikroorganisme. Setelah mengalami penguraian atau proses dekomposisi, serasah menjadi senyawa organik sederhana dan menghasilkan hara, sehingga dapat langsung dimanfaatkan oleh tanaman. Peran serasah dalam proses penyuburan tanah dan tanaman sangat tergantung pada laju produksi dan laju dekomposisinya. Selain itu komposisi serasah akan sangat menentukan dalam penambahan hara ke tanah dan dalam menciptakan substrat yang baik bagi organisme pengurai.Besarnya kandungan lignin akan menghambat proses dekomposisi karena lignin merupakan senyawa yang komplek sehingga sulit terurai oleh mikroorganisme tanah.Kecepatan pelapukan serasah akan berkorelasi dengan jumlah mikroba dalam tanah (Aprianis, 2011).
Isolasi bakteri Selulotik dan lignolitik pada usus rayap dapat dimanfaatkan sebagai starter pembuatan pupuk organik. Proses pengomposan dengan starter bakteri dari rayap diharapkan dapat mempercepat waktu pengomposan dan proses degredasi yang lebih optimal (Yuniwati et al.,2012).
Lama waktu pengomposan dengan menggunakan metode tradisional membutuhkan waktu 3-4 bulan. Perkembangan metode pengomposan selanjutnya diarahkan pada proses pengomposan dalam waktu yang lebih cepat dan dapat mendegradasikan komponen organik lebih maksimal. Proses pengomposan tidak
dapat dipisahkan dengan peranagen biologis. Agen biologis yang sering dimanfaatkan dalam proses pengomposan adalah cacing, bakteri, jamur dan serangga. Lama waktu pengomposan dipengaruhi oleh bahan dasar pembuatan kompos (Simanungkalit et al., 2009).
Kriteria kematangan kompos bervariasi tergantung dari bahan asal kompos, kondisi dan proses dekomposisi selama pengomposan. Untuk menentukan kematangan kompos yaitu: 1) Karakteristik fisik, seperti suhu, warna, tekstur, dan besarnya kelarutan dalam larutan natrium hidroksida atau natrium fosfat; 2) Nisbah C/N, status dari kandungan hara tanaman, dan nilai kompos yang ditunjukkan oleh uji tanaman; 3) Tidak berbau dan bebas dari patogen, parasit dan biji rumput-rumputan. Kematangan kompos merupakan faktor utama dalam menentukan kelayakan mutu kompos (Gaur, 1981).
III. BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Agustus 2017 dan dilanjutkan uji molekuler di IPBCC Bogor sampai dengan Oktober 2017.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah larva O. rhinoceros L instar 3 di ambil dari tandan kosong sawit dan batang sawit.
Media CMC (Carboxy methyl cellulosa),SCA (Simmon’s Citrate Agar), TSIA (Triple Sugar Iron Agar), Media SIM, Gelatin, NB, bahan untuk uji pewarnaan gram (crystal violet, lugol iodine, safranin, etil alkohol 95%, dan aquades), Serasah daun rambutan dan jambu biji, Buah-buahan seperti pepaya, pisang, nenas, air kelapa dan bahan lainnya yang diperlukan.
Alat-alat yang digunakan untuk isolasi dan identifikasi antara lain, inkubator, autoclave, pipet, erlenmeyer,Bunsen, cawan Petri, neraca dengan ketelitian 0,1 g, gelas ukur, kapas, mikroskop binokuler, gelas objek, jarum ose, Pisau bedah, Thermometer, Thermal block PCR, mesin elektroforesis, UV iluminator, laminar air flow, hot plate stirer, freezer, ember dan alat lainnya yang diperlukan.
3.3. Metode Penelitian
Metode yang dilakukan dalam penelitian ini adalah metode pengamatan deskriptif dengan cara pengamatan untuk mengetahui karakteristik dan spesies bakteri simbion larva O. rhinoceros L. Pada tandan kosong dan kelapa sawit secara molekuler 16S rRNA. Serta Peranan bakteri dalam mempercepat skala kematangan kompos.
3.4. Pelaksanaan Penelitian
Prosedur Kerja
Semua peralatan yang digunakan seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, beaker glass dicuci dan dikeringkan 3-4 menit, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Seluruh permukaan dan dinding laminar air flow (LAFC) dibersihkan dengan semprotan alkohol 70%. Fan dinyalakan untuk mengalirkan udara agar tetap bersih sebelum digunakan untuk mengisolasi.
Persiapan Media
Media CMC dibuat dengan cara menimbang 10 gram media cmc ke dalam beker glass berisi 1000 ml aquadest. Larutan dipanaskan sambil diaduk, kemudian media dimasukkan kedalam erlenmayer lalu ditutup dengan kapas dan ditutup dengan aluminium foil. Media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit, lalu dituangkan ke cawan petri sesuai kebutuhan untuk menumbuhkan bakteri, kemudian media tersebut disimpan kembali ke pendingin.
Media SA (Starch Agar) ditimbang starch sebanyak 2 gr dan agar 3 gr dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 200 ml aquades pada
media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
Media SIM ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
Media SCA ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer.Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf
Media Gelatin ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
Media TSIA ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
3.4.1. Isolasi Bakteri usus larva O. rhinoceros L dari Tandan kosong sawit dan Batang sawit.
Bakteri dari usus larva O. rhinoceros L. dilakukan dengan metode penusukan pada bagian perut larva dan dibuka menggunakan gunting steril, Kemudian menggunakan pinset untuk menarik usus keluar. Dan saluran pencernaan kemudian ditimbang dan digerus. kemudian dimasukkan ke dalam
tabung erlenmeyer yang berisi 100 ml larutan fisiologis. Tabung erlenmeyer tersebut kemudian dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 1 jam hingga diperoleh suspensi yang diharapkan berisi calon isolat bakteri. Suspensi tersebut kemudian diencerkan dengan pengenceran berseri (10-1 hingga 10-8) yaitu dengan cara 1 ml suspensi diambil dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi air steril sebanyak 9 ml. Hasil pengenceran tersebut kemudian diambil sebanyak 100 μl dan kemudian disebar menggunakan metode cawan sebar pada media NA Selanjutnya isolat diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada suhu 37oC.
3.4.2. Pemurnian Bakteri
Pemurnian bakteri dilakukan dengan inokulasi koloni bakteri yang tumbuh menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media dengan metode goresan sinambung. Pemilihan koloni dilakukan berdasarkan ciri morfologi koloni, yaitu bentuk koloni, warna koloni,elevasi koloni, dan tepian koloni. Koloni bakteri yang akan dimurnikan ditentukan dari perwakilan tiap kelompok yang memiliki ciri yang sama, dipilih satu koloni letaknya yang berjauhan dengan koloni lainnya untuk ditanam kembali pada media CMC sampai beberapa kali ulangan minimal tiga kali ulangan, kemudian ditemukan isolat murni.
Metode identifikasi bakteri yang dilakukan adalah dengan cara konvensional, Serangkaian uji yang digunakan dalam identifikasi bakteri meliputi pemeriksaan morfologi, pewarnaan gram, dan uji biokimia antara lain : Uji SA, uji SCA, uji katalase, uji motilitas, produksi indol, uji TSIA dan uji gelatinBeisher (1991) dalam Kusdarwati dan Sudarno (2011).
3.4.3. Teknik Pewarnaan Gram
Pengamatan sel bakteri dilakukan dengan meneteskan 1 tetes aquades pada kaca preparat ditambahkan 1 ose isolat, lalu difiksasi diatas api. Selanjutnya bakteri diwarnai dengan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditetesi iodine, dibiarkan selama 1 menit dan kembali dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya bakteri ditetesi etil alkohol dan dibiarkan selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan safranin kemudian dibiarkan selama 30 detik lalu dicuci lagi dengan air mengalir. Selanjutnya kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas serap dan ditambahkan minyak emersi.Bentuk dan warna sel bakteri diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali.Bakteri gram negatif berwarna merah dan bakteri gram positif berwarna biru (Schaad et al., 2001).
3.4.4. Uji Biokimia Bakteri
Hidrolisis Pati
Cairkan media pati (SA) steril kemudian tuangkan kedalam petri steril dan biarkan hingga memadat, lalu dibagi menjadi dua keadaan, lalu dicucukkan biakan bakteridengan menggunakan jarum ose pada masing-masing kuadran.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator. Teteskan iodine pada permukaan koloni bakteri. Uji positif apabila terdapat zona bening pada koloni setelah ditetesi iodine.
Hidrolisis Gelatin
Ambil media gelatin semi padat dalam tabung reaksi, tusuk secara lurus menggunakan jarum ose lurus yang sudah berisi inokulum bakteri pada bagian
tengah media.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator.Kemudian dimasukkan ke dalam pendingin selama 10 menit.Uji positif jika media tetap cair setelah dimasukkan kedalam pendingin.
Uji Sitrat
Ambil media SCA lalu goreskan inokulum bakteri pada media denganjarum ose bengkok.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator.Lalu diamati perubahanwarna pada media. Uji positif terjadi jika terdapat perubahan warna pada media yang berwarna hijau menjadi biru.
Uji Hidrogen Sulfida
Siapkan media miring TSIA goreskan inokulum pada permukaan media dengan menggunakan jarum ose bengkok, kemudian tusuk bagian tengah media dengan ose lurus.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator.
Amati keretakan yang terjadi pada media dan adanya endapan berwarna hitam.
Uji Motalitas
Siapkan media SIM dalam tabung reaksi, inokulasikan bakteri dengan ose lurus dengan cara menusukkan ketengah media secara lurus pada tabung reaksi.
Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator. Amati tipe pergerakan bakterinya.
Uji Katalase
Siapkan objeck glas yang basah kemudian inokulasikan satu lup ose pada glass tersebut dan amati perubahannya. Amati adanya gelembung udara.
3.4.5. Uji Molekuler 16S rRNA
Isolasi DNA dilakukan dengan metode isolat bakteri murni ditumbuhkan pada media agar LB. Sebanyak satu ose isolat disuspensikan ke dalam tabung ependorf yang berisi 100 µl aquabidest steril dan dipanaskan pada suhu 950C selama 15 menit.Kemudian diputar dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.000xg selama 5 menit.Supernatan (yang telah mengandung DNA bakteri) disimpan pada suhu 40C. DNA hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA dengan menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan untuk untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah primer 63f (5’ – CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC - 3’) dan 1387r (5’ – GGG CGG WGT GTA CAA GGC - 3’) yang merupakan primer universal untuk berbagai strain bakteri.
Sebanyak 5 µl DNA template; 2,5 µl 10 x PCR buffer (PCR core, Promega); 2,5 µl MgCl2; 0,5 µl dNTP; 1 µl (5pmol) masing-masing primer; 0,2 µl (1 unit) Taq DNA polymerase dimasukkan ke dalam tabung ependorf 500 µl. PCR dilakukan pada volume total 25 µl dengan menambahkan 12,3 µl aquabidest. Kemudian mesin PCR diprogram dan dijalankan pada kondisi pradenaturasi 940C selama 2 menit 45 detik, annealing 450C selama 45 menit, ekstensi 720C selama 1 menit 2 detik perputaran.Kemudian tahapan denaturasi selanjutnya 940C selama 45 detik, annealing selama 450C 45 detik, ekstensi 720C selama 1 menit dan dilakukan sebanyak 35 siklus. Tahap akhir amplifikasi dilakukan pada suhu 720C selama 10 menit.
Hasil PCR divisualisasi pada gel agarosa 1% dan diwarnai dengan etidium bromida. DNA hasil amplifikasi tersebut dimurnikan lalu disekuens secara komersial untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Lalu data sekuens tersebut
dibandingkan dengan data di GenBank dari database The National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
3.4.6 Tahap Pengomposan
Pembuatan Mikro organisme lokal (MOL)
Adapun bahan yang digunakan pada tahap ini adalah buah-buahan, jenis buah yang digunakan dalam pembuatan Mol ini adalah pepaya, pisang, nenas.
Ditambahkan air kelapa dan gula merah.
Pembuatan Starter Bakteri
Larutan stok starter dibuat dengan cara menanam bakteri yang tumbuh pada media NA kedalam medium NB 9 ml. Bakteri yang ditanam pada medium NB diinkubasikan selama 48 jam. Kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 50%, dibuat dengan cara 5 ml larutan stok starter dilarutkan kedalam 5 ml NB.
Pengomposan
Uji Pengomposan dilakukan di dalam Laboratorium dengan menggunakan ember. Disiapkan molase buatan yang dibuat dari bahan buah-buahan (Pepaya, pisang, nenas) kemudian diblander dan dibiarkan selama 10 hari untuk masa fermentasi, hasil fermentasi dinyatakan berhasil ditandai dengan adanya buih dan berwarna coklat. Setelah itu diaplikasikan atau disemprotkan diatas kotoran sapi diaduk dan ditambah dengan serasah dengan perbandingan 6:4. Setelah satu minggu kemudian starter bakteri yang berasal dari larva disemprotkan dengan
dosis 10 ml dengan kerapatan 108 diatas permukaan kotoran sapi dan serasah yang telah diaplikasikan dengan mol. Diamati skala kematangan pengomposan tersebut.
3.5. Parameter Pengamatan
3.5.1. Karakteristik Morfologidan Uji Biokimia bakterisimbion Larva Pengamatan morfologi koloni dan sel bakteri dilakukan untuk mengetahui morfologi dari isolat bakteri. Uji sifat fisiologi bakteri untuk mengetahui bakteri tersebut gram positif atau gram negatif dari pewarnaan yang dilakukan dan uji biokimia.
3.5.2. Identifikasi Spesies Bakteri Berdasarkan 16S rRNA
Identifikasi ini dilakukan untuk mengetahui spesies dari bakteri simbion larva O. rhinoceros L. yang diambil dari tandan kosong sawit dan batang sawit di areal perkebunan. Kemudian dilakukan identifikasi spesies bakteri simbion menggunakan uji molekuler di IPBCC.
3.5.3. SkalaKematangan Pengomposan
Pengomposan yang dilakukan dengan menggunakan starter bakteri simbionlarvauntuk mempercepat kematangan kompos. Dilakukan pengamatan untuk mengetahui pengaruh bakteri simbion terhadap pengomposan dilihat dari tingkat standar kematangan kompos yaitu warna menjadi coklat kehitaman,
tekstur kompos yaitu jika diremas mudah dihancurkan atau mudah putus serat-seratnya, dan suhu sudah turun dan mendekati suhu pada awal proses
pengomposan, Nisbah C/N <20.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Morfologi dan Fisiologi
Keberadaan mikroba di dalam usus larva merupakan suatu bentuk interaksi yang menguntungkan (simbiosis mutualisme). Isolasi bakteri asal saluran pencernaan larva O. rhinoceros instar 3 menggunakan media CMC untuk mendapatkan bakteri yang murni. Dari isolasi pemurnian bakteri ini dapat dilihat morfologi biakan bakteri simbion larva yang diambil dari tankos dan batang sawit tampak tidak berbeda.Hasil dari pengamatan morfologi yaitu koloni berbentuk bulat, warna koloni putih, ukuran koloni tidak begitu besar, memiliki permukaan cembung dan tepi yang rata serta pertumbuhan menyebar.
Untuk pengelompokan bakteri tersebut, selanjutnya dilakukan pewarnaan bakteri agar dapat dilihat dibawah mikroskop dan diamati bentuk serta warna bakteri lebih detail.Secara mikroskopis, bakteri menunjukkan bentuk seperti batang (basil) dengan warna ungu kebiruan (Lampiran 5). Hal ini menandakan bahwa bakteri yang diisolasi berasal dari gram positif dan termasuk golongan bacillus. Hal ini sesuai dengan pernyataan Holt et al (1994) menyatakan bahwa Bacillus spp adalah kelompok bakteri gram positif, berbentuk batang dan lurus, dapat membentuk rantai atau juga berpasangan dengan ujung yang bulat atau persegi. Dan sesuai juga denganpendapat Pelczar dan Chan (1986) yang menyatakan pengamatan secara mikroskopik terhadap bakteri gram positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada sel bakteri. Hal ini terjadi karena bakteri ini mempunyai kandungan lipid yang lebih rendah sehingga dinding sel
bakteri akan lebih mudah terhidrasi akibat perlakuan dengan menggunakan alkohol. Dinding sel yang terhidrasi menyebabkan ukuran pori-pori sel menjadi kecil dan daya permeabilitas berkurang sehingga zat warna ungu kristal yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari sel dan sel akan tetap berwarna ungu.
Selain pengamatan secara morfologi, juga dilakukan pengamatan fisiologi yang meliputi tes biokomia (Lampiran 6).Uji biokimia sederhana terdiri dari uji TSIA (Triple Sugar Iron), uji SCA (Simmons Citrate Agar), SIM, SA, GELATIN, Katalase. Hasil uji biokimia isolat dapat dilihat pada tabel 2 berikut.
Tabel 2. Hasil Identifikasi Morfologidan uji Biokimia Isolat
Hasil Uji Bakteri (Batang) Bakteri (Tankos) Makrokopis Pertumbuhan
menyebar,Koloni bulat,
berwarna kream
kekuningan
Pertumbuhan menyebar,Koloni bulat, berwarna kream pucat
Mikroskopis BerbentukBasil,Gram positif
BerbentukBasil,Gram positif
Uji Biokimia
SA (-) (-)
GELATIN (+) (+)
SCA (+) (-)
TSIA (-) (-)
SIM (+) (+)
KATALASE (+) (+)
Hasil uji hidrolisis pati (SA) dengan menambahkan beberapa tetes larutan iodin. Warna larutan yang diteteskan pada bakteri berubah menjadi warna biru,
hal ini menunjukkan keberadaan pati. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sale (1961) bahwa uji positif apabila menghasilkan warna kuning ketika
diteteskan pada medium. Bila amilum yang ada pada medium tidak dapat disederhanakan oleh bakteri, warna akan berubah menjadi ungu atau biru kehitaman karena Iodin mengakibatkan pelekukan struktur lurus amilum yang mengakibatkan dilihat sebagai warna biru.
Uji gelatin yang positif ditandai dengan medium gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama ± 30 menit. Hal ini menunjukkan bahwa isolat dapatmenghidrolisis gelatin ataupun protein yangmerupakan molekul berukuran besar menjadi polipeptida dan kemudian menjadi asam amino dengan menggunakan enzim proteolitik ekstraseluler berupa gelatinase dan protease(Aronson et al.,1971).
Hasil pengujian dengan SCA menunjukkan bahwa isolat yang berasal dari bakteri simbion tankos tidak mampu menggunakan sitrat, sedangkan isolat bakteri simbion batang mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Hal ini ditandai dengan berubahnya medium dari hijau menjadi biru karena adanya peningkatan pH dalam media. Uji TSIA bakteri simbion tankos ditandai dengan bagian atas berwarna kuning dan bagian bawah berwarna kuning yang menunjukkan laktosa dan sukrosa mampu difermentasikan. Apabila bagian
atasberwarna merah dan bagian bawah berwarna kuning, hanya glukosa saja yang mampu difermentasikan oleh bakteri uji simbion batang. Uji motilitas terhadap isolat menunjukkan bahwa isolat bersifat motil,ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri dalam media. Uji katalase yang dilakukan menunjukkan isolat memilikienzim katalase. Hal ini ditandai dengan terbentuk gelembung udara di sekitar koloni dengan penambahan 3% H2O2 (Cappuccino and Sherman, 1983).
Dari hasil uji tersebut diperoleh bakteri berasal dari genus Bacillus dari
spesies berbeda yang menjadi simbion larva. Menurut Holt et al (1994) Bacillus spp. memiliki sifat gram positif dan biasanya motil. Endospora oval,
kadang-kadang bundar atau silinder dan sangat resisten pada kondisi yang tidak menguntungkan. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak lebih dari satu spora per sel dan sporulasi tidak tahan pada udara terbuka. Kemampuan fisiologi beragam, sangat peka terhadap panas, pH dan salinitas, kemoorganotrof dengan metabolisme fermentasi atau pernapasan. Biasanya bersifat katalase dan oksidase positif, tersebar luas pada bermacam-macam habitat.
Identifikasi Spesies Bakteri Berdasarkan 16S rRNA
Hasil PCR divisualisasi pada gel agarosa 1% dan diwarnai dengan etidium bromida.DNA hasil amplifikasi tersebut dimurnikan lalu disekuens secara komersial untuk mengetahui urutan basa DNA-nya, Pita DNA dapat dilihat pada (Lampiran 7). Lalu data sekuens tersebut dibandingkan dengan data di GenBank dari database The National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
Identifikasi bakteri dari batang dan tankos dengan menggunakan 16S rRNA ini untuk mengetahui susunan dari nukleotida karena semua spesies memiliki perbedaan susunan atau deretan dari masing-masing rantai nucleotida (Timin, Guanin, Adenin, Citosin). Sehingga dari susunan nukleotida tersebut dapat dilihat atau diidentifikasi spesies atau nama suatu organisme.Hasil sequencingdapat dilihat pada lampiran.Urutan nukleotida hasil sequencing ditunjukkan adalah spesies Bacillus siamensis yang terdapat pada larva yang hidup di batang sawit yang telah membusuk (Lampiran 8).Sedangkan hasil sequencing spesies bakteri simbion larva yang hidup di tandan kosong sawit adalah Bacillus stratosphericus dengan susunan nucleotida dapat dilihat pada (lampiran 9), didapatkan 18 isolat yang mempunyai kemiripan susunan nukleotida dengan tingkat kemiripan 98 %.
Pohon filogenetik didesain menggunakan perbandingan sekuen 16S rRNA dari bakteri lain pada program pelacakan database BLAST divisualisasikan menggunakan program ClustalW. Pembentukan pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA06. Pohon phylogenik dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar 4. Pohon Phylogenik dari gen simbion larva dengan CLUSTAL W dan 1000 replikasi dan GenBank.
B. siamensis adalah bakteri yang berasal dari gram positif, facultatif anaerobic dan berbentuk batang bersifat motil. Koloni pada media berwarna putih krem.
Tumbuh pada suhu 37oC dengan pH 6-7 (Sumpavapol et al., 2010).
Menurut penelitian Chenet al (2016) B. siamensis merupakan bakteri biokontrol yang menghasilkan lipopeptida potensial mengurangi penggunaan pestisida dilahan pertanian untuk menghambat perkembangan jamur F.oxysporum.
B. stratosphericus dapat ditemukan pada ketinggian di stratosfer tidak terbatas pada atmosfer dan dapat ditemukan di berbagai lingkungan akibat siklus atmosfer dan mampu bertahan dalam kondisi yang tidak menguntungkan, memungkinkannya untuk berkoloni dan beradaptasi dengan lingkungan yang bervariasi. Ketahanan B. stratosphericus dalam keadaan buruk termasuk resistensi terhadap radiasi UV dan toleransi terhadap halo dimana sampai 17,5% NaCl tidak rusak pada sel.Ini dapat tumbuh pada suhu antara 8°C dan 37°C, dan pada pH 6- 10 Selanjutnya, sementara logam berat tertentupada konsentrasi tinggi umumnya bersifat toksik pada kebanyakan organisme, B. Stratosphericussangat toleran
terhadap ion Fe, Co, Ni, dan Cu, dan cukup toleran terhadap Zn (Shivaji et al., 2006)
Odisi et al(2012) B. stratosphericus prospek untuk memproduksi enzim lipase dan selulase dan menurut Dunlap (2015) B. stratosphericus dapat menghasilkan enzim lipase yang kompatibel biodetergen dengan memanfaatkan ampas kelapa untuk dijadikan sebagai sebuah substrat yang memasok sumber karbon serta trigliserida.
Setelah didapatkan spesies bakteri yaitu B. siamensis dan B. stratosphericus maka bakteri tersebut dijadikan starter untuk mempercepat
kematangan kompos.Karena genus bacillus dapat menghasilkan enzim lipase dan selulosa yang dapat dimanfaatkan sebagai inokulum mikroba.
Beberapa penelitian telah melakukan penambahan inokulan mikroba dalam proses
pengomposan (Satyanarayana.et.al.,2012,.Jusoh.et.al.,2013; dalam Saskiawan, 2015).
Pengomposan
Perubahan suhu (lampiran 11) dan pH selama pengomposan terjadi sebagai akibat adanya aktivitas metabolisme mikroba. Proses metabolisme tersebut menghasilkan panas sehingga dalam pengomposan akan terjadi kenaikan suhu. Kenaikansuhu disebabkan adanya aktivitas metabolisme mikroba yang berlangsung.Starter bakteri dimasukkan ketika kompos sudah mencapai suhu thermofilik (diatas 300C).
Gambar 5. Suhu Harian Pengomposan
hasil penelitian dapat dilihat bahwa pencampuran MOL dan penambahan starter bakteri B. siamensis dan B. stratosphericus yang ditambahkan pada akhir minggu pertama yaitu diatas 300C berpengaruh terhadap kecepatan kematangan kompos, dari hasil pengamatan dari hari pertama sampai hari ke-18 tampak
0 10 20 30 40 50 60
Hari 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
(Temperatur) MOL + B.
siamensis
(Temperatur) MOL + B.
stratosphericus MOL
perubahan secara fisik bahan yang menggunakan Mol dan starter lebih cepat matang (Suhu turun) bila dibandingkan pengomposan tanpa menggunakan starter.
Penambahan starter ini sesuai dengan genus bakteri yang termasuk thermofilik.
Hal ini sesuai dengan pernyataan Holt (1994) dan Darius (2001) yang menyatakan bahwa pada proses pengomposan ada 3 tahapan berbeda dengan suhu, yaitu : mesofilik, thermofilik dan tahap pendinginan. Pada tahap awal mesofilik suhu proses akan naik dari suhu lingkungan, terus meningkat ke tahap thermofilik, dimana mikroorganisme akan digantikan oleh bakteri thermofilik.
Bakteri genus Bacillus termasuk pada bakteri mesofilik dan termofilik dengan kisaran suhu 25-60°C (Holt, 1994).Aktivitas awal Bacillus menghasilkan enzim- enzim hidrolase diantaranya adalah amilase, protease, lipase, gelatinase, selulase.
Enzim amilase mengkatalis hidrolisis polisakarida menjadi disakarida seperti maltosa kemudian merubahnya menjadi glukosa, glukosa akan mengalami glikolisis di sitoplasma dan menghasilkan asam piruvat. Enzim protease mengkatalis hidrolisis pemutusan ikatan peptida dan akan menghasilkan asam amino. Enzim lipase mengkatalis trigliserida menjadi asam lemak rantai panjang dan gliserol.Enzim gelatinase mengkatalis hidrolisis gelatin, gelatin merupakan suatu protein yang dapat diperoleh dari hidrolisis kolagen.Enzim selulase mengkatalis hidrolisis selulosa.
Kualitas serasah juga mempengaruhi aktivitas mikroorganisme dan fauna tanah.Semakin baik kualitas serasah, maka pelepasan hara oleh mikroorganisme ke tanah semakin mudah.Dekomposisi lignin dan holoselulosa pada spesies Acacia mangium membutuhkan waktu 1-3 bulan. Hasil tersebut menunjukkan bahwa proses dekomposisi juga dipengaruhi oleh jenis mikrobia yang tersedia.
Senyawa-senyawa serasah terdekomposisi dan termineralisasi sehingga menyediakan unsur-unsur yang penting bagi pertumbuhan mikroorganisme.
Menurut Rindyastuti dan Agung (2010) dekomposisi adalah proses alami mengubah senyawa organik kompleks menjadi senyawa organik yang sederhana.
Organisme yang mampu melakukan proses dekomposisi adalah invertebrata yang bersifat detritus dan mikroorganisme seperti bakteri dengan melibatkan proses enzimatis pemecah molekul. Dengan adanya proses dekomposisi, organisme mengembalikan nutrien ke alam. Proses tersebut yang mendasari penggunaan materi tumbuhan untuk dijadikan sumber nutrien bagi tanah melalui pengomposan.
Untuk menguji bau atau aroma yang dihasilkan dari bahan kompos dilakukan dengan cara mencium bau kompos dan membandingkan dengan bau tanah bila didapatkan hasil yang sama maka sesuai dengan Standar Mutu Internasional yaitu kompos dikatakan matangjika tidak ada bau menyengat atau sama dengan bau tanah (Lampiran 12). Tidak adanya bau yang biasanya timbul pada proses dekomposisi anaerobik. Bau yang tercium dalam proses pengomposan anaerobik disebabkan karena adanya senyawa H2S. Hilangnya bau pada kompos matang disebabkan karena Sulfur dikonsumsi oleh bakteri, dan di dalam bakteri dioksidasi menjadi asam sulfat (Djuarnaniet al.,2005).
Nisbah C/N suatu bahan organik memberikan gambaran tentang mudah tidaknya bahan tersebut didegradasi, tingkat kematangan dan mobilisasi nitrogen yang dikandungnya.Nisbah C/N nyata dipengaruhi oleh waktu dekomposisi, nisbah C/N menurun dengan semakin lamanya waktu dekomposisi. Penurunan C/N ini biasanya sejalan dengan proses perubahan suhu timbunan kompos.
Pada awal pengomposan tekstur bahan kompos terlihat masih berupa serasah yang kering berwarna coklat terang dengan tingkat kelembaban rendah karena mengalami penguapan yang cepat. Setelah mengalami pengadukan, berangsur-angsur tekstur bahan kompos berubah menjadi lebih remah karena sudah mulai terjadi proses dekomposisi dengan warna coklat gelap dan berangsur menjadi berwarna coklat kehitaman (Lampiran 13). Senyawa polifenol yang dihasilkan pada proses pengomposan senyawa lignoselulosa menjadi kuinon.
Kuinon selanjutnya bereaksi dengan senyawa amino membentuk asam fulvik yang berwarna gelap (hitam).
Salah satu indikasi tingkat kematangan kompos adalah dengan perubahan warna menjadi coklat kehitaman menyerupai tanah. Hal ini disebabkan oleh terbentuknya senyawa humik pada proses pengomposan. Pernyataan Setyorini (2006) bahwa kompos yang berwarna kehitaman mengandung senyawa humus seperti asam humik, asam fulvik dan hematomalanik yang lebih banyak.Perubahan tekstur bahan kompos menjadi lebih remah dan hancur juga mengakibatkan perubahan warna menjadi coklat kehitaman.
Dari pengamatan hari pertama sampai hari ke 18 dan 30 dapat dilihat perubahan warna bahan yang digunakan serasah yang berwarna kekuningan dan kotoran sapi yang masih basah. Penambahan Mol diawal yang telah disiapkan sebelumnya menjadikan campuran bahan tersebut mendapatkan bakteri yang diperlukan pada awal proses pengkomposan yaitu jenis bakteri yang berasal dari golongan mesofil, dan pada akhir minggu pertama dilakukan penambahan bakteri starter yang berasal dari jenis thermofil, agar pematangan kompos bisa lebih cepat lagi dengan penambahan bakteri yang berasal dari golongan thermofilik tersebut
yaitu B. siamensis dan B. stratosphericus. Dapat dilihat dari pengamatan visual bahwa penggunaan Bacillus menjadikan proses pengomposan lebih cepat matang dari kriteria fisik yang dapat dilihat dan telah diuji Nisbah C/N bila dibandingkan kompos yang hanya menggunakan MOL tampak lebih basah dan teksturnya lebih kasar pada pengamatan dan pematangan kompos lebih lama.
Pada perlakuan pengomposan dengan menggunakan mikroorganisme lokal dari pengamatan visual serasah yang dicampur dengan kotoran sapi pada pengamatan akhir tampak cacahan masih kasar, warna coklat dan kompos sudah berbau seperti tanah.
Pada perlakuan pengomposan dengan penambahan Bakteri B. stratosphericus dari pengamatan visual cacahan sudah lebih halus warna coklat
kehitaman dan berbau tanah.Begitu juga dengan pengomposan dengan penambahan mikroorganisme lokal dan bakteri B. siamensis tidak berbeda jauh kondisi fisiknya dengan B. stratosphericus (Tabel 3).
Tabel 3.Kondisi fisik bahan kompos akhir pengomposan
Perlakuan Kondisi Fisik C/N pH MOL (30 Hari) Serasah masih tampak cacahan kasar, 10.33 7.45 berwarna coklat tua, tidak berbau.
Mol + B. stratosphericus Cacahan serasah lebih halus, coklat 7.65 7.24 (18 Hari) kehitaman, berbau tanah, lebih kering
Mol + B. siamensis Cacahan serasah lebih halus, coklat 13.16 7.25 (18 Hari) kehitaman, berbau tanah, agak lembab
Sesuai dengan Djuarnani (2005) kompos dikatakan matang apabila tidak berbau menyengat dan baunya menyerupai dengan bau tanah. Pengamatan secara visual
menunjukkan bahwa serasah yang telah dicampur dengan kotoran sapi yangdigunakan berwarna kecoklatan.Setelah proses pengomposan dengan perlakuan penambahan bakteri, tampak berwarnacoklat kehitaman, memiliki aroma seperti tanah, dengan tekstur jerami sedikit lebih lembek atau remah. Hal ini sesuai dengan pernyataan Gaur (1981) bahwa parameter untuk menentukan kematangan kompos yaitu: 1) Karakteristik fisik, seperti suhu, warna, tekstur, dan besarnya kelarutan dalam natrium fosfat, 2) NisbahC/N< 20, status dari kandungan hara tanaman, dan nilai kompos yang ditunjukkan oleh uji tanaman; 3) Tidak berbau dan bebas dari patogen, parasit dan biji rumput.
Bahan kompos matang akhir akan mengalami penurunan volume atau berat lebih dari 50% dari berat awal dapat dilihat pada gambar 6 berikut:
Gambar 6. Penyusutan Bahan Kompos
Proses pematangan kompos terjadi seiring dengan penyusutan bahankompos. Berdasarkan gambar penyusutan bahan padaproses pengomposan pada penelitian ini lebih besar dari 50%.Nilai reduksi paling besar terdapat pada
415 482
430
0 200 400 600 800 1000 1200
MOL MOL+B.
stratosphericus
MOL+B.
siamensis
Penyusutan Bahan
Berat Awal (gr) Berat Akhir (gr)
komposter denganpenambahan Mikroorganisme lokal sebesar 58.5 %.Reduksi bahan pada kompos dengan penambahan mikro organisme lokal ditambah denganB. stratosphericus yakni sebesar51.8%.Sedangkan untuk komposter dengan penambahan mikroorganisme lokal ditambah dengan B. siamensis reduksi bahan sebesar 57 %.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1. Dari hasil identifikasi bakteri simbion larva O. rhinoceros L diperoleh spesies Bakteri yang berbeda dalam satu genus yaituB. siamensis dan B.
stratosphericus.
2. Bakteri simbion larva O. rhinoceros L. dari golongan thermofildapat dimanfaatkan sebagai starter pengomposan.
3. Penggunaan starter bakteri dari genus Bacillus dapat mempercepat kematangan pengomposan dari 30 hari menjadi 18 hari.
Saran
1. Pemanfaatan starter bakteri dapat mempersingkat waktu pengomposan dan kompos yang dihasilkan dapat digunakan untuk mengurangi penggunaan pupuk kimia.
2. Perlu penelitian lanjutan untuk pengomposan tankos.
