III. BAHAN DAN METODE
3.4. Pelaksanaan Penelitian
Prosedur Kerja
Semua peralatan yang digunakan seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, beaker glass dicuci dan dikeringkan 3-4 menit, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Seluruh permukaan dan dinding laminar air flow (LAFC) dibersihkan dengan semprotan alkohol 70%. Fan dinyalakan untuk mengalirkan udara agar tetap bersih sebelum digunakan untuk mengisolasi.
Persiapan Media
Media CMC dibuat dengan cara menimbang 10 gram media cmc ke dalam beker glass berisi 1000 ml aquadest. Larutan dipanaskan sambil diaduk, kemudian media dimasukkan kedalam erlenmayer lalu ditutup dengan kapas dan ditutup dengan aluminium foil. Media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit, lalu dituangkan ke cawan petri sesuai kebutuhan untuk menumbuhkan bakteri, kemudian media tersebut disimpan kembali ke pendingin.
Media SA (Starch Agar) ditimbang starch sebanyak 2 gr dan agar 3 gr dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 200 ml aquades pada
media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
Media SIM ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
Media SCA ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer.Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf
Media Gelatin ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
Media TSIA ditimbang sebanyak 3 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 70 ml aquades pada media dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Media disterilkan dengan autoklaf.
3.4.1. Isolasi Bakteri usus larva O. rhinoceros L dari Tandan kosong sawit dan Batang sawit.
Bakteri dari usus larva O. rhinoceros L. dilakukan dengan metode penusukan pada bagian perut larva dan dibuka menggunakan gunting steril, Kemudian menggunakan pinset untuk menarik usus keluar. Dan saluran pencernaan kemudian ditimbang dan digerus. kemudian dimasukkan ke dalam
tabung erlenmeyer yang berisi 100 ml larutan fisiologis. Tabung erlenmeyer tersebut kemudian dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 1 jam hingga diperoleh suspensi yang diharapkan berisi calon isolat bakteri. Suspensi tersebut kemudian diencerkan dengan pengenceran berseri (10-1 hingga 10-8) yaitu dengan cara 1 ml suspensi diambil dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi air steril sebanyak 9 ml. Hasil pengenceran tersebut kemudian diambil sebanyak 100 μl dan kemudian disebar menggunakan metode cawan sebar pada media NA Selanjutnya isolat diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada suhu 37oC.
3.4.2. Pemurnian Bakteri
Pemurnian bakteri dilakukan dengan inokulasi koloni bakteri yang tumbuh menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media dengan metode goresan sinambung. Pemilihan koloni dilakukan berdasarkan ciri morfologi koloni, yaitu bentuk koloni, warna koloni,elevasi koloni, dan tepian koloni. Koloni bakteri yang akan dimurnikan ditentukan dari perwakilan tiap kelompok yang memiliki ciri yang sama, dipilih satu koloni letaknya yang berjauhan dengan koloni lainnya untuk ditanam kembali pada media CMC sampai beberapa kali ulangan minimal tiga kali ulangan, kemudian ditemukan isolat murni.
Metode identifikasi bakteri yang dilakukan adalah dengan cara konvensional, Serangkaian uji yang digunakan dalam identifikasi bakteri meliputi pemeriksaan morfologi, pewarnaan gram, dan uji biokimia antara lain : Uji SA, uji SCA, uji katalase, uji motilitas, produksi indol, uji TSIA dan uji gelatinBeisher (1991) dalam Kusdarwati dan Sudarno (2011).
3.4.3. Teknik Pewarnaan Gram
Pengamatan sel bakteri dilakukan dengan meneteskan 1 tetes aquades pada kaca preparat ditambahkan 1 ose isolat, lalu difiksasi diatas api. Selanjutnya bakteri diwarnai dengan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditetesi iodine, dibiarkan selama 1 menit dan kembali dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya bakteri ditetesi etil alkohol dan dibiarkan selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan safranin kemudian dibiarkan selama 30 detik lalu dicuci lagi dengan air mengalir. Selanjutnya kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas serap dan ditambahkan minyak emersi.Bentuk dan warna sel bakteri diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali.Bakteri gram negatif berwarna merah dan bakteri gram positif berwarna biru (Schaad et al., 2001).
3.4.4. Uji Biokimia Bakteri
Hidrolisis Pati
Cairkan media pati (SA) steril kemudian tuangkan kedalam petri steril dan biarkan hingga memadat, lalu dibagi menjadi dua keadaan, lalu dicucukkan biakan bakteridengan menggunakan jarum ose pada masing-masing kuadran.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator. Teteskan iodine pada permukaan koloni bakteri. Uji positif apabila terdapat zona bening pada koloni setelah ditetesi iodine.
Hidrolisis Gelatin
Ambil media gelatin semi padat dalam tabung reaksi, tusuk secara lurus menggunakan jarum ose lurus yang sudah berisi inokulum bakteri pada bagian
tengah media.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator.Kemudian dimasukkan ke dalam pendingin selama 10 menit.Uji positif jika media tetap cair setelah dimasukkan kedalam pendingin.
Uji Sitrat
Ambil media SCA lalu goreskan inokulum bakteri pada media denganjarum ose bengkok.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator.Lalu diamati perubahanwarna pada media. Uji positif terjadi jika terdapat perubahan warna pada media yang berwarna hijau menjadi biru.
Uji Hidrogen Sulfida
Siapkan media miring TSIA goreskan inokulum pada permukaan media dengan menggunakan jarum ose bengkok, kemudian tusuk bagian tengah media dengan ose lurus.Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator.
Amati keretakan yang terjadi pada media dan adanya endapan berwarna hitam.
Uji Motalitas
Siapkan media SIM dalam tabung reaksi, inokulasikan bakteri dengan ose lurus dengan cara menusukkan ketengah media secara lurus pada tabung reaksi.
Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang 370C diinkubator. Amati tipe pergerakan bakterinya.
Uji Katalase
Siapkan objeck glas yang basah kemudian inokulasikan satu lup ose pada glass tersebut dan amati perubahannya. Amati adanya gelembung udara.
3.4.5. Uji Molekuler 16S rRNA
Isolasi DNA dilakukan dengan metode isolat bakteri murni ditumbuhkan pada media agar LB. Sebanyak satu ose isolat disuspensikan ke dalam tabung ependorf yang berisi 100 µl aquabidest steril dan dipanaskan pada suhu 950C selama 15 menit.Kemudian diputar dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.000xg selama 5 menit.Supernatan (yang telah mengandung DNA bakteri) disimpan pada suhu 40C. DNA hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA dengan menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan untuk untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah primer 63f (5’ – CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC - 3’) dan 1387r (5’ – GGG CGG WGT GTA CAA GGC - 3’) yang merupakan primer universal untuk berbagai strain bakteri.
Sebanyak 5 µl DNA template; 2,5 µl 10 x PCR buffer (PCR core, Promega); 2,5 µl MgCl2; 0,5 µl dNTP; 1 µl (5pmol) masing-masing primer; 0,2 µl (1 unit) Taq DNA polymerase dimasukkan ke dalam tabung ependorf 500 µl. PCR dilakukan pada volume total 25 µl dengan menambahkan 12,3 µl aquabidest. Kemudian mesin PCR diprogram dan dijalankan pada kondisi pradenaturasi 940C selama 2 menit 45 detik, annealing 450C selama 45 menit, ekstensi 720C selama 1 menit 2 detik perputaran.Kemudian tahapan denaturasi selanjutnya 940C selama 45 detik, annealing selama 450C 45 detik, ekstensi 720C selama 1 menit dan dilakukan sebanyak 35 siklus. Tahap akhir amplifikasi dilakukan pada suhu 720C selama 10 menit.
Hasil PCR divisualisasi pada gel agarosa 1% dan diwarnai dengan etidium bromida. DNA hasil amplifikasi tersebut dimurnikan lalu disekuens secara komersial untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Lalu data sekuens tersebut
dibandingkan dengan data di GenBank dari database The National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
3.4.6 Tahap Pengomposan
Pembuatan Mikro organisme lokal (MOL)
Adapun bahan yang digunakan pada tahap ini adalah buah-buahan, jenis buah yang digunakan dalam pembuatan Mol ini adalah pepaya, pisang, nenas.
Ditambahkan air kelapa dan gula merah.
Pembuatan Starter Bakteri
Larutan stok starter dibuat dengan cara menanam bakteri yang tumbuh pada media NA kedalam medium NB 9 ml. Bakteri yang ditanam pada medium NB diinkubasikan selama 48 jam. Kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 50%, dibuat dengan cara 5 ml larutan stok starter dilarutkan kedalam 5 ml NB.
Pengomposan
Uji Pengomposan dilakukan di dalam Laboratorium dengan menggunakan ember. Disiapkan molase buatan yang dibuat dari bahan buah-buahan (Pepaya, pisang, nenas) kemudian diblander dan dibiarkan selama 10 hari untuk masa fermentasi, hasil fermentasi dinyatakan berhasil ditandai dengan adanya buih dan berwarna coklat. Setelah itu diaplikasikan atau disemprotkan diatas kotoran sapi diaduk dan ditambah dengan serasah dengan perbandingan 6:4. Setelah satu minggu kemudian starter bakteri yang berasal dari larva disemprotkan dengan
dosis 10 ml dengan kerapatan 108 diatas permukaan kotoran sapi dan serasah yang telah diaplikasikan dengan mol. Diamati skala kematangan pengomposan tersebut.