THESIS
PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI
BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI
I MADE YOGA WINDU PRADANA
NIM 1492361006
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
ii
PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI
BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI
Tesis untuk memperoleh Gelar Magister
Pada Program Magister, Program Studi Kedokteran Hewan
Program Pascasarjana Universitas Udayana
I MADE YOGA WINDU PRADANA
NIM 1492361006
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
Lembaran Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 18 April 2016
Pembimbing I, Pembimbing II,
Prof. Dr. drh I Ketut Puja, M.Kes Dr. drh Wayan Bebas,M.Kes NIP. 19621231 198903 1 315 NIP. 19621231 198903 1 021
Mengetahui
Ketua Program Magister Direktur
Kedokteran Hewan Program Pascasarjana
Program Pascasarjana Universitas Udayana
Universitas Udayana
iv
Tesis ini Telah Diuji Pada
Tanggal 18 April 2016
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor
Universitas Udayana, 1506/UN.14.4/HK/2016,
Tanggal 12 April 2016
Ketua : Prof.Dr.drh. I Ketut Puja, M.Kes
Anggota :
1. Dr. drh. Wayan Bebas,M.Kes
2. Dr.drh.Tjok Gde Oka Pemayun,MS
3. Dr. drh. I Ketut Suatha, M.Si
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT
Saya yang bertandatangan di bawah ini :
Nama : I Made Yoga Windu Pradana
NIM : 1492361006
Program Studi : Kedokteran Hewan
Judul Tesis : Pengembangan Sari Kacang Kedelai Sebagai Bahan Pengencer Semen Anjing Kintamani
Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah Tesis ini bebas plagiat.
Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia
menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan
Perundang-undangan yang berlaku.
Denpasar, 1 April 2016
Yang membuat pernyataan,
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Bontang pada tanggal 27 Desember 1990,merupakan anak ke
dua dari pasangan I Nyoman Kembar Bagiarta, S.Ag dan Ni Ketut Rusni (Alm).
Penulis menempuh pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Yayasan Pupuk Kaltim
Bontang (2000-2005) melanjutkan ke SD Yayasan Pupuk Kaltim Bontang, SMP
Yayasan Pupuk Kaltim Bontang, dan SMA Yayasan Pupuk Kaltim Bontang. Penulis
pernah menjabat sebagai ketua muda-mudi hindu Kota Bontang pada tahun
2008-2009. Pada tahun 2009, penulis diterima sebagai mahasiswa Fakultas Kedokteran
Hewan Universitas Udayana. Penulis juga aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa
(BEM) dan Badan Perwakilan Mahasiswa (BPM) Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Udayana, serta memperoleh gelar profesi Dokter Hewan pada tahun
2015.
Penulis berkesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang Magister
pada Program Magister Kedokteran Hewan, Program Pascasarjana Universitas
Udayana tahun 2014. Dalam rangka menyelesaikan tugas akhir, penulis melakukan
penelitian tentang Pengembangan Sari Kacang Kedelai Sebagai Bahan Pengencer
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini pertama-tama perkenankan penulis memanjatkan puji syukur kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat berkah dan karunia-Nya, tesis ini dapat terselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada keluarga yang telah memotivasi penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga kepada Prof. Dr. drh. I Ketut Puja M.Kes. selaku pembimbing I yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat , bimbingan, dan saran selama penulis mengikuti Program Magister, khususnya dalam penyelesaian tesis ini. Terima kasih sebesar-besarnya pula penulis sampaikan kepada Dr. drh. Wayan Bebas, M.Kes. selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dan saran kepada penulis. Ucapan terima kasih ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, sp.PD-KEMD, Direktut Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A Raka Sudewi, Sp.S (K) serta Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Hewan Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. drh. I Ketut Puja M.Kes. atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada para penguji tesis yaitu Dr. drh. Tjok Gde Pemayun, M.S., Dr. drh. I Ketut Suatha, M.Si., dan Dr. drh Hapsari Mahatmi, M.P yang telah memberikan saran, masukan, dan koreksi sehingga tesis ini dapat terselesaikan. Ucapan terma kasih juga diberikan kepada dosen yang telah membimbing penulis di dalam mengikuti pendidikan Program Magister pada program Studi Ilmu Kedokteran Hewan Universitas Udayana. Selain itu penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya juga kepada teman-teman yaitu Manik, Galih Diparayoga, Edi Susanta, Windhu Mahardia, Nana Destriana, serta semua pihak yang telah mendukung dalam penyelesaian penulisan tesis ini. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Mahas Esa selalu melimpahkan anugrah-Nya kepada bapak/ibu semua serta kepada penulis
viii ABSTRAK
PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi viabilitas dan integritas DNA pada semen anjing dengan bahan pengencer sitrat-glukosa- kuning telur dan tris-sitrat-glukosa-sari kacang kedelai. Semen dikoleksi dilakukan dengan cara manual dari anjing kintamani yang sehat. Semen secara subjektif dan pemeriksaan mikroskopik guna menentukan viabilitas untuk dibuat pengencer. Semen yang hanya memiliki rata-rata motilitas 60% atau lebih yang digunakan dalam penelitian ini. Sampel semen dicampurkan ke dalam tris-sitrat-glukosa-sari kacang kedelai dan sitrat-glukosa-kuning telur dengan dua perbedaan tingkat pengenceran yaitu 1:2, 1:3. Dua pengencer di evaluasi motilitas, persentase hidup dan integritas DNA dalam waktu 0 jam, 3 jam dan 6 jam dengan penyimpanan suhu dingin 5oC. Data dianalisis dengan menggunakan Data was analyzed by multivariate analysis of variance (MANOVA). Hasil yang diperoleh menunjukkan terdapat perbedaan sangat nyata (p<0,01) terhadap motilitas, persentase hidup dan integritas DNA spermatozoa anjing kintamani antara pengencer sitrat-glukosa-kuning telur dan tris-sitrat-glukosa-sari kacang kedelai . Hasil juga menunjukkan persentase hidup dan integritas DNA sperma dengan rasio pengencer 1:2 berpengaruh nyata (p<0,01) dan waktu penyimpanan juga berpengaruh nyata (p<0,01) dari rasio pengencer sperma 1:3. Viabiltas dan integritas berpengaruh nyata (p<0,01) dengan waktu penyimpanan suhu 5oC. Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pengencer tris sitrat glukosa sari kacang kedelai mampu mempertahankan motilitas, viabilitas dan integritas DNA spermatozoa anjing kintamani pada suhu 5oC. Penelitian kedepannya dapat diinduksikan untuk mengevaluasi kemampuan fertilisasi spermatozoa dengan pengencer ini..
ABSTRACT
SOYA BEAN DEVELOMPMENT AS INGREDIENT OF KINTAMANI DOG SEMEN DILUTTER
The objective of this study was to evaluate the viability and integrity of canine semen extended in Egg yolk Glucose-Citrate and Tris-citrate-Glucose- soyabean. Semen was collected by Manual manipulation from an apparently healthy Kintamani dog stud. The semen was subjected to gross and microscopic examination to determine its viability for made extenders. Only semen with motility rate of 60% or higher was used in this study. Semen samples were extended in Tris-citrate-Glucose-soyabean and Egg yolk Glucose-Citrate at two different levels of sperm to extenders solutions of 1:2, 1:3. Two extenders were evaluated motility, percentage life and DNA integrity at 0 hour, 3 hours, and 6 hours on cold storage 5oC. Data was analyzed by multivariate analysis of variance (MANOVA). The results from the study showed a high significant difference (p<0.01) in sperm Motility, percentage of live and DNA integrity between Egg yolk Glucose-Citrate and Tris-citrate-Glucose- soyabean. The result also showed that sperm percentage of live and DNA integrity of semen in the ratio diluent 1:2 differed significanly (p<0.01) from of semen in the ratio diluent 1:3. The sperm viability and integrity were significanly (p<0,01) following the time of storage at 5°C. This study indicated that Tris-citrate-Glucose- soyabean extenders was sufficien to protect on the maintainance of motility, viability and DNA integrity of kintamani dog spermatozoa during storage at 5 oC. Further research should be conducted to evaluate the fertility capacity of spermatozoa with these extenders.
x
RINGKASAN
Anjing kintamani merupakan anjing ras Indonesia yang berasal dari Desa Sukawana Kecamatan Kintamani Kabupaten Bangli Bali. Para pecinta anjing mulai mengembangbiakan anjing ras ini. Namun cara pengembangbiakannya masih dilakukan dengan cara konvensional yaitu dengan cara mendatangkan pejantan. Cara seperti itu dapat membawa dampak dan berbagai permasalahan yang timbul karena transportasi hewan hidup dalam jarak yang jauh berisiko menimbulkan stres dan juga kurang praktis. Cara lain yang dapat digunakan yaitu dengan cara inseminasi buatan (IB). Salah satu hal terpenting dalam inseminasi buatan adalah bahan pengencer yang digunakan.
Bahan pengencer semen yang sering digunakan dalam inseminasi buatan adalah kuning telur karena kuning telur mengandung lesitin yang dapat melindungi spermatozoa dari cekaman dingin. Namun penggunaan bahan kuning telur dalam pengencer dapat menularkan bibit penyakit. Beberapa negara melarang eksport maupun import semen anjing yang menggunakan bahan campuran kuning telur. Oleh sebab itu digunakan bahan lesitin nabati yang diperoleh dari sari kacang kedelai. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan sari kecang kedelai sebagai bahan campuran pengencer semen anjing kintamani.
xii DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PRASYARAT GELAR ... ii
LEMBARAN PENGESAHAN ... iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... v
RIWAYAT HIDUP ... vi
2.2 Alat Reproduksi Anjing Jantan ... 6
2.2.1 Testis ... 6
2.2.2 Epididimis ... 7
2.2.3 Duktus Deferent ... 8
2.2.5 Urethra ... 10
2.2.6 Penis ... 11
2.3 Spermatogenesis dan Spermatozoa ... 11
2.4 DNA Spermatozoa ... 13
2.5 Semen Cair ... 15
2.6 Penampungan Semen ... 16
2.7 Bahan Pengencer Semen ... 17
2.7.1 Pengencer Sari Kacang Kedelai ... 18
2.7.2 Pengencer Kuning Telur ... 19
BAB III Kerangka Berpikir, Konsep, dan Hipotesis Penelitian ... 20
3.1 Kerangka Berpikir... 20
4.6 Definisi Operasional Variabel ... 25
4.7 Bahan Penelitian ... 25
4.9.3 Pembuatan Pengencer Sitrat Kuning Telur-Glukosa ... 27
4.9.4 Pengencer Semen ... 28
xiv
4.9.5.1 Motilitas ... 28
4.9.5.2 Jumlah Persentase Hidup ... 28
4.9.5.3 Integritas DNA ... 29
4.10 Analisis Data ... 29
BAB V Hasil Penelitian ... 30
5.1 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Motilitas Spermatozoa ... 30
5.2 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Hidup Spermatozoa ... 31
5.3 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Integritas DNA Spermatozoa ... 33
BAB VI Pembahasan ... 36
6.1 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Motilitas Spermatozoa Anjing Kintamani ... 36
6.2 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Hidup Spermatozoa Anjing Kintamani ... 37
6.3 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Integritas DNA Spermatozoa Anjing Kintamani ... 38
BAB VII Simpulan dan Saran ... 40
7.1 Simpulan ... 40
7.2 Saran ... 40
DAFTAR PUSTAKA ... 41
DAFTAR TABEL
4.1 Tabel Rancangan Penelitian ... 23
5.1 Rata-rata motilitas hidup spermatozoa anjing kintamani pada jenis
dan tingkat pengenceran dan lama waktu berbeda pada suhu 5oC... 31
5.2 Rata-rata persentase hidup spermatozoa anjing kintamani pada jenis
dan tingkat pengenceran dan lama waktu berbeda pada suhu 5oC ... 31
5.3 Rata-rata integritas DNA spermatozoa anjing kintamani pada jenis
xvi
DAFTAR GAMBAR
3.1 Kerangka Konsep Penelitian ... 22
5.1 Spermatozoa mati dan hidup dengan pewarnaan eosin nigrosin ... 32
5.2 DNA Spermatozoa yang mulai terdenaturasi dan normal dengan
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Anjing kintamani merupakan salah satu ras anjing asli Indonesia. Anjing
ras Anjing Kintamani adalah sebutan kelompok anjing lokal jenis pegunungan
yang hidup di sekitar Desa Sukawana, Kecamatan Kintamani, Kabupaten Bangli,
Bali (Gunawan, 2013). Anjing ras ini sering dikaitkan dengan hasil persilangan
anjing chow chow dengan anjing lokal yang ada di Bali. Namun, hasil penelitian
menyebutkan bahwa anjing Kintamani berasal dari anjing lokal bali yang
mengalami kehilangan keragaman genetik ( Puja et al., 2005).
Para pecinta anjing mulai mengembangbiakan anjing kintamani. Namun
pengembangbiakannya, para pecinta anjing kintamani masih menggunakan cara
perkawinan alami menggunakan pejantan. Para pecinta anjing sering
mendatangkan pejantan dari tempat yang jauh untuk mendapatkan pejantan yang
unggul. Cara konvensional ini membawa dampak dan berbagai permasalahan
yang timbul karena transportasi hewan hidup dalam jarak yang jauh berisiko
menimbulkan stres pada pejantan itu disamping penggunaan ini kurang praktis
(Gunawan, 2013).
Solusi untuk hal tersebut yaitu dengan cara inseminasi buatan (IB).
Inseminasi buatan pada anjing telah dipraktikkan secara rutin di banyak negara
2
penggunaan semen impor (Junaidi, 2006). Keberhasilan IB pada anjing telah
banyak dilaporkan baik yang menggunakan semen segar, dingin (Tsutsui et al.,
2003) maupun semen beku (Hayashi et al., 2013). Penggunaan semen dingin,
biasanya sudah melalui proses pengenceran. Penggunaan pengencer pada semen
dingin dimaksud untuk menambah volume semen, mempertahankan motilitas dan
viabilitas spermatozoa (Wiyanti et al., 2013)
Telah banyak pengencer dingin pada semen anjing dievaluasi, tampaknya
kuning telur tris merupakan pengencer paling baik pada penyimpanan dingin
semen anjing (Stro”m Holst et al, 2000). Kuning telur paling umum digunakan
sebagai campuran pengencer semen anjing untuk memproteksi spermatozoa dari
cekaman dingin. Tetapi adanya wabah avian influenza, lalulintas semen dingin
dan beku yang mengandung kuning telur mengalami kesulitan. Bahan kuning
telur berasal dari produk unggas. Bahan pengencer yang menggunakan kuning
telur ditemukan bakteri salmonella sebanyak 67,09 CFU/cm (Froning, 1998) Jika
bahan ini tercampur agen penyakit dapat menularkan bibit penyakit sehingga
mempengaruhi kualitas spermatozoa (Ariantie et al., 2014).
Beberapa negara telah melarang ekspor maupun import semen anjing yang
mengandung kuning telur (Abe et al., 2008). Karena itu, perlu dikembangkan
pengencer semen anjing tanpa kuning telur. Sebagai alternatif, tampaknya sari
kacang kedelai cocok digunakan sebagai pengencer, Sari kacang kedelai
mengandung lesitin nabati yang fungsinya sama dengan kuning telur yaitu
melindungi membran plasma spermatozoa (Aires et al., 2003) dan melindung
3
Berdasarkan latar belakang tersebut penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui kemampuan pengencer campuran sari kacang kedelai dengan rasio
pengencer berbeda sebagai medium untuk pengenceran semen anjing Kintamani
dalam mempertahankan viabilitasnya
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1 Bagaimanakah pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari kacang kedelai dan
tingkat pengenceran terhadap viabilitas spermatozoa anjing Kintamani.
1.2.2 Bagaimanakah pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari Kacang Kedelai dan
tingkat pengenceran terhadap Integritas DNA spermatozoa anjing Kintamani.
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
Melihat formulasi pengencer dalam upaya mempertahankan kualitas semen anjing
kintamani selama penyimpanan
1.3.2 Tujuan Khusus
1. Mengetahui pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari Kacang Kedelai dan tingkat
pengenceran terhadap viabilitas spermatozoa anjing Kintamani.
2. Mengetahui pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari Kacang Kedelai dan tingkat
4
1.4 Manfaat Penelitian
Dari hasil penelitian ini diharapkan akan dihasilkan pengencer semen
alternatif yang murah dan efektif bagi pecinta anjing anjing kintamani serta
memberikan sumbangsih ilmu pengetahuan dan teknologi sehingga dapat
5
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1 Anjing Kintamani
Anjing Kintamani Bali, adalah plasma nutfah Indonesia, yang sangat
berpotensi dikembangkan untuk tujuan komersial. Habitat aslinya di daerah
sekitar desa Sukawana, Kecamatan Kintamani, Bangli. Anjing Kintamani Bali
yang dahulu dikenal dengan sebutan anjing Gembrong (bulu panjang dan lebat)
Karena keistimewaanya, anjing Kintamani Bali digunakan sebagai maskot fauna
Kabupaten Bangli, Bali. Suatu penghargaan yang tinggi dari Pemerintah Bangli
untuk anjing Kintamani. Hal ini dapat dimaklumi mengingat anjing Kintamani
Bali merupakan satu – satunya anjing kuno (ancient dog) yang ada di Bali
terutama di Kintamani. Ada anggapan bahwa anjing Kintamani berasal dari
persilangan anjing Chow-Chow dengan anjing lokal yang ada di Bali. Namun,
hasil penelitian menyebutkan bahwa anjing Kintamani berasal dari anjing lokal
bali yang mengalami kehilangan keragaman genetik ( Puja et al., 2005). Anjing
Kintamani Bali merupakan satu – satunya anjing asli Indonesia yang mempunyai
penampilan yang menarik yang telah ditetapkan sebagai anjing ras pertama
Indonesia oleh PERKIN (Perkumpulan Kinologi Indonesia) pada tahun 2006.
Anjing Kintamani berpenampilan indah dengan ukuran kecil sampai
ukuran sedang . Ukuran tinggi anjing Kintamani jantan rata – rata 51,25 cm
dengan berat badan rata – rata 15,90 kg. Ukuran tinggi anjing betina rata – rata
6
panjang terutama pada daerah punduk, ekor dan kaki belakang bagian belakang.
Warna bulu anjing Kintamani adalah putih, hitam, coklat atau campuran. Telinga
berdiri tegak dan berbentuk segitiga. Ukuran kepala anjing Kintamani sangat
proporsional dengan ukuran tubuhnya dengan dahi lebar tanpa kerutan. Badan
lurus dan kuat. Bulu ekor tebal dan berbetuk bulan sabit (Puja, 2007a).
2.2 Alat reproduksi Anjing Jantan
Sistem reproduksi jantan terdiri dari : (1) Testis yang dikelilingi tunika
vaginalis dan selubung testis, (2) epididimis, (3) Duktus deferens, (4) kelenjar
prostat, (5) urethra dan (6) penis yang dilindungi oleh preputium (Dellmann dan
Brown, 1992; Junaidi, 2006)
2.2.1 Testis
Testis merupakan organ reproduksi yang utama pada hewan jantan. Testis
mempunyai dua fungsi utama yaitu sebagai penghasil spermatozoa dan hormon
sex jantan (Androgen). Spermatozoa dihasilkan oleh testis melalui serangkaian
pembelahan sel spermatogonia pada tubulus semeniferus menjadi spermatozoa
(Evans, 1993)
Setiap hewan mamalia domestik memiliki sepasang testis yang berbentuk
bulat atau lonjong dan terletak di dalam skrotum. Testis anjing memiliki ukuran
yang bervariasi tergantung dari ukuran tubuh anjing, ada korelasi yang positif
diantara berat badan dan berat testikuler, volume testikuler, berat total epididimal
dan total lebar skrotal pada anjing jantan normal. Sehingga pengukuran berat
7
Ukuran testis anjing berkisar antara panjang, lebar dan tebal adalah 3x2x1.5 cm
(Junaidi , 2006).
Testis dibungkus oleh jaringan yang bersifat serosa yang disebut dengan
tunika vaginalis. Tunika vaginalis memiliki lapis yang terdiri atas mesotel dan
jaringan ikat yang melekat pada tunika albugenia. Tunika albugenia merupakan
lapisan pembungkus testis paling luar yang merupakan suatu membrana putih dan
disusun oleh jaringan ikat elastis (Puja, 2007b).
Parenkim testis terdiri atas tubulus semeniferus, dan dikelilingi oleh
jaringan interstitial yang mengandung sel leydig, pembuluh darah, limfe dan
jaringan saraf. Sel leydig menghasilkan hormon testoteron, progesteron, dan
kemungkinan hormon estrogen (Puja, 2007b). Sel Leydig berbentuk polihedral
dan tidak teratur berinti bulat dibagian tengah dengan kromatin yang tersebar di
luar membran inti (Peter et al., 2001).
2.2.2 Epididimis
Epididimis mamalia merupakan alat kelamin aksesori dinamik, tergantung
pada androgen testikularis untuk menjaga status deferensiasi epitel. Terdiri dari
sejumlah (8-25) duktus eferentis dan duktus epididimis yang panjang berliku liku.
Secara makroskopis epididimis terdiri dari kepala (caput), badan (corpus), dan
ekor (cauda) muncul secara medial dan berlokasi di permukaan dorsolateral testis
dan terbungkus oleh tunika albugenia yang terdiri dari jaringan ikat padat tidak
teratur, dibalut oleh selaput visceral (Dellman dan Brown, 1992; Junaidi, 2006).
Lebih lanjut Junaedi (2006) menyatakan kepala epididimis berada pada
8
epididimis berada pada dorsomedial sepanjang testikel dan berlanjut dengan ekor
epididimis yang berada pada caudal ekstremitas dari testis, corda spermatikus
keluar dari ekor epididimis pada aspek caudomedial dari testis dan memperluas ke
medial testis sampai pada saluran inguinal ke cincin inguinal. Ligamentum dari
ekor epididimis melekat ke testis dan epididimis ke tunika vaginalis.
Duktuli eferentes merupakan penghubung rete testis dengan duktus
epididimis. Epitel duktuli eferentes berbentuk epitel sebaris yang mengandung
silia. Sel yang bersilia itu membantu pergerakan spermatozoa ke duktus
epididimis. Duktuli eferentes dan bagian awal dari duktus epididimis mengandung
kepala epididimis (Evans, 1993).
Lebih lanjut Evans (1993) menyatakan duktus epididimis sangat berkelok
kelok dan mengulir. Panjang duktus epididimis sangat bervariasi tergantung pada
spesies hewan. Bagian badan epididimis merupakan bagian yang paling sempit
diantara kepala dan ekor epididimis. Duktus epididimis dibalut oleh epitel banyak
lapis, dikelilingi oleh jaringan ikat longgar dan otot polos dengan susunan
melingkar. Dua tipe sel terdapat pada epitel, yaitu sel utama berbentuk silinder
dan sel basal berbentuk poligonal
2.2.3 Duktus Deferent
Duktus deferens merupakan kelanjutan dari duktus epididimis yang setelah
membuat lengkung tajam pada ujung ekor, kemudian berlanjut lurus membentuk
duktus deferens dengan ciri histologinya. Bagian awal duktus deferens terdapat
dalam funikulus spermatikus. Dalam rongga perut, berlanjut membentuk lipatan
9
ampula (pada kuda, ruminansia, anjing). Pada anjing dan kambing, kelenjar
dikelilingi oleh jaringan ikat periglanduler tanpa sel otot polos (Dellmann dan
Brown,1992).
2.2.4 Kelenjar – Kelenjar Aksesoris
Kelenjar aksesori pada hewan jantan terdiri atas kelenjar ampula,
vesikularis, kelenjar prostat dan kelenjar bulbouretralis. Kelenjar aksesoris
kelamin tersebut berperan sebagai organ penghasil plasma semen (Hafez, 2000).
Sekreta kelenjar aksesori menghasilkan volume terbesar (60-90%) dari volume
total plasma semen. Plasma semen yang disekresikan ke lumen uretra merupakan
medium yang sesuai bagi spermatozoa ketika diejakulasi menuju organ reproduksi
betina (Aughey dan Frye, 2001). Motilitas dan aktivitas metabolik spermatozoa
dapat berlangsung dengan adanya sekreta kelenjar aksesori yang bercampur
dengan sekreta yang berasal dari testis dan ductus epididimis (Pineda, 2003).
Keberadaan setiap kelenjar aksesori kelamin pada beberapa hewan
bervariasi. Domba memiliki keempat kelenjar (ampula, kelenjar vesikularis,
kelenjar prostat yang berbentuk pars diseminata, dan kelenjar bulbouretralis),
sedangkan anjing hanya memiliki kelenjar prostat berbentuk korpus (Colville dan
Bassert, 2002).Kelenjar prostat tidak dilaporkan keberadaanya pada rusa pampas
(Ungerfeld et al, 2008), sedangkan rusa timor memiliki kelenjar prostat berbentuk
korpus tetapi tidak dijumpai adanya kelenjar bulbouretralis (Nalley, 2006). Selain
terdapat variasi keberadaan kelenjar aksesori, morfologi dan histologi kelenjar
aksesori kelamin juga bervariasi pada mamalia jantan (Chugtai et al, 2005;
10
oleh septum fibrosa medial. Kelenjar ini terletak di bagian tengah pelvis atau 1 cm
di belakang leher kantung kencing, berbentuk globular dan simetris. Ukuran
kelenjar ini bervariasi dengan volume kira kira 6-15 ml dan berat 1,7-14,5 gram
(Puja, 2007b).
Prostat memegang peranan penting terhadap volume dari ejakulat anjing.
Cairan prostat berwarna bening, cairan ini dieksresikan pada fraksi pertama dan
terakhir dari ejakulat. Sekresi cairan ini mengandung laktat, kholesterol, enzim
dan sedikit gula. Cairan ini secara konstan disekresikan ke dalam duktus
sekretorius prostatik (Junaidi, 2006). Menurut Puja (2007b) cairan prostat dapat
menetralisasi plasma semen dan membuatnya asam dengan akumulasi
karbondioksida dan asam laktat, serta untuk merangsang gerak spermatozoa
ejakulat.
2.2.5 Urethra
Urethra merupakan saluran yang berfungsi untuk menyalurkan urine dan
semen. Urethra anjing dibagi menjadi segmen prostat, membranosa dan
spongiosa. Segmen prostat menjulur dari kandung kemih ke pinggir caudal
kelenjar prostat. Segmen membranosa berawal dari daerah pinggir kaudal kelenjar
prostat dan berakhir di urethra yang memasuki bulbus glandis.
Seluruh mukosa urethra membentuk lipatan memanjang yang memipih
dan lenyap selama berlangsung proses ereksi dan urinasi. Pada anjing jantan,
duktus deferent bermuara pada urethra. Sel mukosa urethra dibalut oleh epitel
pipih peralihan. Perototan urethra terdiri dari lapisan otot polos di daerah kantung
11
2.2.6 Penis
Penis merupakan organ untuk kopulasi pada anjing jantan. Penis anjing
diklasifikasikan antara tipe vaskuler dan tipe fibroelastik. Tipe vaskuler banyak
ditemukan pada penis kuda jantan. Pada tipe vaskuler banyak ditemukan adanya
pembuluh darah pada korpus cavernosa. Tetapi pada tipe fibroelastis mengandung
sedikit pembuluh darah dan banyak jaringan ikat (Evans, 1993).
Penis anjing terdiri dari tiga bagian utama yaitu radix, corpus, dan gland
penis. Pada akhir proksimal dari ekor penis terdapat dua badan erektil kavernosa
vaskularis, korpora kavernosa diletakkan oleh jaringan konektif yang tebal ke sisi
kiri dan kanan dari arkus ischiadikus diantara tuberositas ischialis (Johnston et al,
2001).
2.3 Spermatogenesis dan spermatozoa.
Spermatogenesis terjadi didalam tubulus seminiferus testis. Proses ini
mulai saat hewan mencapai puncak pubertas dan terus berlanjut selama umur
reproduktif hewan. Pada anjing waktu yang diperlukan dalam proses
spermatogenesis diperkirakan 61 hari. Pada umur 4 bulan anjing sudah mengalami
proses spermatogenesis, tetapi spermatozoanya tidak nampak pada ejakulat
sampai umur 10-12 bulan (Allen, 1992).
Spermatogenesis dimulai dari proses diferensiasi sel-sel germinal pre
mordial menjadi spermatogonium. Spermatogonium ini mempunyai jumlah
kromosom diploid (2n). Spermatogonia ini menempati membran basal atau bagian
terluar dari tubulus seminiferus. Spermatogonia ini akan mendapatkan nutrisi dari
12
bermitosis berkali-kali mebentuk spermatosit primer. Spermatosit primer
mengandung kromosom diploid (2n) pada inti selnya dan mengalami meiosis.
Satu spermatosit akan menghasilkan dua sel anak, yaitu spermatosit sekunder
(Hewitt,1997)
Proses pembentukan spermatosit sekunder, dimulai saat spermatosit
primer menjauhi dari lamina basalis, sitoplasma makin banyak, dan terjadilah
meiosis pertama membentuk dua spermatosit sekunder yang masing-masing
memiliki kromososm haploid (n). Proses meiosis pertama ini langsung diikuti
dengan pembelahan meiosis kedua yang membentuk empat spermatid
masing-masing dengan kromosom haploid. Akhirnya spermatid akan bertransformasi
membentuk spermatozoa. Proses spermatogenesis ini terjadi pada suhu normal
tetapi lebih rendah dari pada suhu tubuh, dan proses ini juga dipengaruhi oleh sel
sertoli (Hewitt, 1997).
Spermatozoa secara struktural terdiri dari kepala sperma yang
mengandung nukleus dan akrosom, middle piece yang mengandung mitokondria
untuk metabolisme spermatozoon, dan ekor sperma (Junaidi, 2006). Akrosomal
yang terbentuk dari badan golgi dan mengandung enzim hyaluronidase yang
berfungsi untuk melisiskan cumulus ooforus dan zona pelucida dari ovum. Pada
bagian ini juga terdapat inti sperma yang menyimpan sejumlah kode/informasi
genetik yang akan diwariskan kepada keturunannya. Bagian ekor merupakan alat
gerak sperma menuju ovum (Puja, 2007b).
Volume ejakulat dapat bervariasi sesuai dengan tingkat kedewasaan dan
13
semen. Untuk memperkirakan konsentrasi spermatozoa di dalam ejakulat,
digunakan alat penghitung sel darah merah (haemocytometer). Prinsip kerja alat
ini sama dengan penghitungan sel darah merah. Rata-rata konsentrasi spermatozoa
dari berbagai ras adalah 125 x 106 spermatozoa/ml dengan kisaran 4 – 540 x 106
spermatozoa/ ml (Puja, 2007b), sedangkan menurut Junaidi (2006) jumlah total
spermatozoa anjing normal antara 300 x 106– 2 x 109.
2.4DNA Spermatozoa
Kerusakan spermatozoa dapat disebabkan oleh beberapa hal diantaranya
faktor hormonal, faktor umur, infeksi, tingginya kadar reactive oxygen species
(ROS), pemaparan zat kimia/pemaparan racun, rokok, obat-obatan, hipertermia
testis, apoptosis dan kekurangan protamin saat spermatogenesis (Purwaningsih
dan Siswanto, 2011) kerusakan spermatozoa jika melebihi 30-40% akan
menyebabkan infertilisasi dan tidak disarankan untuk dijadikan semen beku
(Evenson et al, 1999; Spano et al, 2000).
Protamin adalah suatu protein utama di dalam inti spermatozoa yang
mengikat DNA (Aulanni’am et al, 2011). Pada manusia dan tikus terdapat dua
jenis protamin P1 dan protamin P2 (Corzett et al, 2002), dan pada sapi hanya satu
tipe yaitu protamin P1 (Beletti et al, 2005). Protamin berperan penting untuk
pembentukan kromatin yang diperlukan pada fungsi normal spermatozoa.
Ekspresi abnormal protamin menyebabkan terjadinya penurunan jumlah
spermatozoa, motilitas, morfologi, dan peningkatan kerusakan kromatin
spermatozoa (Mangual et al, 2003), penurunan viabilitas dan meningkatnya
14
spermiogenesis sekitar 85% inti spermatozoa histon akan diganti oleh protamin
(Aulanni’am et al, 2011).
Keseluruhan genom spermatozoa terdapat di dalam pilinan DNA dengan
panjang rata-rata 27 kilobite. Pilinan DNA ini berikatan dengan elemen struktural
inti yang disebut matriks inti. Beberapa faktor yang menyebabkan terganggunya
proses spermatogenesis seperti stress lingkungan, mutasi gen, dan abnormalitas
kromosom berpotensi merusak struktural kromatin yang berhubungan dengan
kejadian infertilisasi. Abnormalitas kromatin inti dapat juga disebabkan oleh
radikal bebas (Lewis dan Aitken, 2005). Atau akibat apoptosis. Salah satu agen
oksidasi adalah reactive oxygen species (ROS) yang dalam kadar tinggi dapat
bersifat toksik terhadap spermatozoa (Saleh et al, 2002). Seperti halnya agen
oksidasi yang lain (hidrogen piroksida, superoksidasi dan radikal bebas), ROS
sangat reaktif. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki satu atau
lebih elektron bebas yang tidak berpasangan (Warren et al, 1987)
Kantor (1995) menyatakan bahwa kerusakan DNA dapat diartikan sebagai
semua bentuk perubahan polimer DNA. Secara alamiah DNA terus menerus
terpapar pada lingkungan fisik dan kimia yang sangat bervariasi dan berpotensi
mengubah struktur alamiah DNA tersebut. Perubahan ini dapat memengaruhi
proses replikasi dan traskripsi DNA yang mengarah pada kerusakan DNA.
Konsekuensi biologisnya dapat mengubah kejadian mutasi atau kematian sel
bahkan kanker, kemunduran mental dan terkait pertumbuhan dan perkembangan.
Lebih lanjut dikatakan bahwa kerusakan modifikasi struktur DNA diinduksi oleh
15
kerusakan yang lain adalah terputusnya struktur polimer DNA. Pemanasan yang
melebihi 37oC menyebabkan terputusnya ikatan glikosida yang menghubungkan
antara basa nitrogen dan struktur gula fosfat sehingga basa nitrogen akan hilang.
Pemeriksaan kerusakan DNA spermatozoa telah banyak dilakukan dengan
berbagai metode analisis antara lain Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA)
(Evenson et al, 2002), Acridine Orange Test (AO) (Tejada et al, 1984) Terminal
Deoxynucleotidyl Transferase Nick and Labelling (TUNEL) (Gorcyza et al,
1993), Toluidine Blue (TB) Test (Erenpreisa et al, 2003), Comet Assay (Fraser dan
Strzezek, 2004), dan Kit Halomax® (Langdon, 2012).
2.5Semen Cair
Semen cair adalah semen segar yang telah ditambahkan suatu bahan
pengencer yang dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa lebih lama dari
pada ketahanan aslinya (Junaidi 2006). Preservasi semen cair umumnya
dilakukan pada suhu 3 – 5oC. Menurut Mc. Kinnon (1999), setiap penurunan
suhu 10oC akan menurunkan metabolisme spermatozoa sampai 50%.
Terhambatnya metabolisme spermatozoa, maka akan dapat mempertahankan
viabilitas beberapa hari sampai saat digunakan untuk IB. Selama penyimpanan,
spermatozoa harus ditambahkan media berupa bahan pengencer yang harus
mengandung sumber energi, buffer atau larutan penyangga, komponen isotonis
dan pelindung terhadap kejutan dingin (cold shock) yang terjadi selama
16
Semen yang diperoleh dari pejantan harus diencerkan dengan pengencer
tertentu agar dapat didistribusikan ke beberapa betina dalam rangkaian program
IB. Selain untuk memperbanyak volume, pengencer tersebut harus memenuhi
beberapa kriteria yaitu, 1) mengandung sumber energi untuk kelangsungan hidup
spermatozoa antara lain : fruktosa, glukosa, dan laktosa. 2) mengandung anti
kejutan dingin (cold shock) antara lain : lipoprotein dan lesitin. 3) mempunyai
kemampuan sebagai larutan penyangga antara lain : sitrat, Tris, dan phosphate.
4) memiliki keseimbangan elektrolit. 5) mengandung antibiotika yang
melindungi semen dari kontaminasi mikroba (Herdis et al. 2003).
2.6 Penampungan Semen
Penampungan semen menurut Konrad (2007) adalah sebagai berikut:
mula-mula penis digenggam dan preputium ditarik ke belakang di belakang
bulbus glandis. Setelah itu, ibu jari dan keempat jari menggenggam penis dengan
pijatan yang cukup dibelakang bulbus glandis sehingga menghasilkan ereksi
penuh. Biasanya ereksi diikuti secara spontan dan dengan tetap memberikan
rangsangan pada preputium. Hal ini memang diperlukan pada beberapa anjing,
demikian halnya dengan stimulasi pada daerah perineal ataupun pada gland penis.
Karena ejakulasi berfraksi, pemisahan koleksi dari setiap fraksi dapat dilakukan
dengan mengganti tabung koleksi. Sesudah fraksi kedua, maka penampung semen
harus dihentikan untuk menghindari sekresi dari glandula prostat atau fraksi
ketiga yang jernih dan transparan
Metode lain yang sering digunakan dengan vagina buatan. Vagina buatan
17
karet. Ukuran dan bentuknya disesuaikan dengan jenis hewan yang akan diambil
semennya. Pada anjing biasanya digunakan tipe harrop. Vagina buatan sebaiknya
diberi pelumas sebelum digunakan, biasanya dengan vaselin. Apabila penis telah
nampak ereksi masukkan penis ke vagina buatan. Dengan adanya rangsangan
pijatan oleh vagina buatan anjing dapat mengalami ejakulasi. Semen yang keluar
ditampung dengan tabung gelas (Puja, 2007b).
Produksi semen sangat berkaitan dengan berat testis, sedangkan berat
testis berkolerasi dengan berat badan. Dengan demikian berat badan berkolerasi
dengan produksi semen. Karena itu produksi semen harian akan lebih banyak
pada anjing ras besar jika dibandingkan dengan anjing ras kecil. Disamping
ukuran tubuh, umur dapat pula mempengaruhi ukuran testis dan mempengaruhi
produksi semen (Puja, 2007b).
2.7 Bahan Pengencer Semen
Salah satu media pengencer yang umum digunakan adalah Tris. Tris
memiliki toksisitas rendah dan sistem penyanggah yang baik dengan
mempertahankan pH, tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (Affandhy et
al. 1999). Sebagai pengencer semen cair, Tris sering dicampur dengan karbohidrat
yang berfungsi sebagai sumber energi bagi spermatozoa. Beberapa penelitian
buffer spermatozoa yang dilakukan oleh Baran et al. (2004) menggunakan
campuran Tris dengan fruktosa, sedangkan Axnér et al. (2004) menggunakan
campuran Tris dengan glukosa serta Tris dengan laktosa yang dilakukan oleh
18
2.7.1 Pengencer Sari Kacang Kedelai
Menurut Aboagla dan Terada (2004), anti cold shock perlu ditambahkan
dalam bahan pengencer agar dapat melindungi spermatozoa pada saat perubahan
suhu dari suhu ruang (28oC) pada saat pengolahan ke suhu ekulibrasi (5oC). Anti
cold shock yang umum ditambahkan adalah kuning telur ataupun kacang kedelai
yang dapat melindungi membran spermatozoa pada saat pendinginan atau
pembekuan. Khasiat utama kuning telur ataupun kacang kedelai adalah
kandungan lesitin (phosphatidylcholine) yang bersifat membran coating untuk
tetap mempertahankan konfigurasi normal phospholipid bilayer yang merupakan
susunan utama membran spermatozoa. Kedelai memiliki kecenderungan
terkontaminasi bakterial lebih kecil daripada kuning telur. Lesitin dari kacang
kedelai merupakan pilihan yang tepat sebagai sumber lesitin bahan pengencer
semen dimasa yang akan datang (Aires et al., 2003). Kacang kedelai juga mampu
menekan stres oksidatif (Ogbuewu et al., 2010). Kacang kedelai yang belum
maupun yang sudah mengalami penyulingan memiliki kandungan phospholipid
antara lain phosphatidylcholine 17.50% dan 23.00%, phosphatidylethanolamine
15.00% dan 20.00%, glikolipid 13-16%, phospholipid lainnya 14-18% dan
trigliserida 2-4% (Shurtleff dan Aoyagi 2004).
Lesitin kacang kedelai memiliki bahan-bahan yang mirip dengan lesitin
pada kuning telur yang digunakan untuk perlindungan terhadap cold shock pada
saat kriopreservasi (Thun et al. 2002; Aires et al. 2003 ). Meskipun lesitin dari
19
dari kuning telur masih banyak digunakan untuk pembekuan semen (Aires et al.,
2003).
2.7.2 Pengencer Kuning telur
Kuning telur merupakan komponen yang paling umum digunakan pada
bahan pengencer untuk kriopreservasi karena terbukti memiliki efek yang
menguntungkan sebagai pelindung dari membran plasma dan akrosom terhadap
cold shock (Amirat et al. 2004). Kandungan phospholipid, kolesterol dan
low-density lipoprotein pada kuning telur berfungsi melindungi spermatozoa dari
kejutan dingin selama proses pembekuan.
Kuning telur mempunyai sifat sebagai penyangga tekanan osmotik
sehingga spermatozoa lebih toleran terhadap lingkungan yang hipotonik atau
hipertonik (Khalifa dan El-Saidy, 2006). Komposisi phospholipid kuning telur
menurut Juneja et al. (1994) terdiri atas phosphatidylcholine (lesitin) 80.8%,
phosphatidylethanolamine 11.7%, lysophosphatidylcholine 1.9%, sphingomyelin
1.9%, serta lemak netral (nonpolar) dan bahan lain 3.7%. Menurut Dong et al.
(2006), komposisi phospholipid kuning telur terdiri atas 77% phosphatidylcholine
