BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tanaman Kunyit
Kunyit (Gambar 2.1.) dikenal dengan nama latin Curcuma domestica val. Nama daerah untuk kunyit yaitu kunir, koneng, koneng temen (Sunda), kunyit (Aceh), kuning (Gayo), kuning, unik (Batak), kunyit (Melayu), cahang (Dayak), kunyit, janar (Banjar), kunir, kunir betis, temu kuning (Jawa), konye, temu
koneng (Madura), kunyik (Sasak), huni (Bima), unyi (Bugis), kumino, unin, unine, uninum (Ambon), rame, kandeifu, nikwai, mingguai, jaw (Irian), kunyir
(Lampung), kunidi (Sulawesi Utara) (Rukmana, 1994). Taksonomi tanaman ini dapat dilihat pada tabel 2.1.
Gambar 2.1. Akar dan Serbuk Akar Kunyit
Tabel 2.1. Taksonomi Tanaman Kunyit (Backer, 1968)
Kerajaan Plantae
Divisi Spermatophyta
Sub Divisi Angiospermae
Kelas Monocotyledoneae
Ordo Zingiberales
Familia Zingiberaceae
Genus Curcuma
a. Morfologi Tanaman
Tanaman kunyit adalah tanaman berumur panjang dengan daun besar berbentuk elips, 3-8 buah, panjang sampai 85 cm, lebar sampai 25 cm, pangkal daun meruncing, berwarna hijau seragam. Batang semu berwarna hijau atau agak keunguan, tinggi sampai 1,60 meter. Perbungaan muncul langsung dari rimpang, terletak di tengah-tengah batang, ibu tangkai bunga berambut kasar dan rapat, saat kering tebalnya 2-5 mm, panjang 16-40 cm, daun kelopak berambut berbentuk lanset panjang 4-8 cm, lebar 2-3,5 cm, yang paling bawah berwarna hijau, berbentuk bulat telur, makin ke atas makin menyempit dan memanjang, warna putih atau putih keunguan, bagian ujung berbelah-belah, warna putih atau merah jambu (Sudarsono dkk., 1996).
Bentuk bunga majemuk bulir silindris. Mahkota bunga berwarna putih. Bagian di dalam tanah berupa rimpang yang mempunyai struktur berbeda dengan Zingiber (yaitu berupa induk rimpang tebal berdaging, yang membentuk anakan, rimpang lebih panjang dan langsing) warna bagian dalam kuning jingga atau pusatnya lebih pucat (Sudarsono dkk., 1996).
b. Ekologi dan Penyebaran
Tanaman kunyit tumbuh dan ditanam di Asia Selatan, Cina Selatan, Taiwan, Indonesia, dan Filipina. Tanaman kunyit tumbuh dengan baik di tanah yang baik tata pengairannya, curah hujan yang cukup banyak dan di tempat yang sedikit kenaungan, tetapi untuk menghasilkan rimpang yang lebih besar dan baik ditanam di tempat yang terbuka (Prawiro, 1977).
c. Khasiat
Secara tradisional rimpang kunyit digunakan untuk penambah nafsu makan, peluruh empedu, obat luka dan gatal, anti radang, sesak nafas, antidiare, dan merangsang keluarnya angin perut. Sebagai obat luar digunakan sebagai lulur kecantikan dan kosmetika. Secara umum akar kunyit digunakan untuk stimulansia,
pemberi warna masakan, dan minuman serta digunakan sebagai bumbu dapur (Sudarsono dkk., 1996).
Akar kunyit (Curcuma domestica) berkhasiat melancarkan peredaran darah, antiinflamasi, antibakteri, melancarkan pengeluaran empedu, antipiretik dan ikterik hepatitis (Syukur, 2005).
d. Kandungan kimia akar kunyit
Zat warna curcuminoid suatu senyawa diarylheptanoide 3-4% terdiri dari
curcumin, dihydrocurcumin, desmethoxy curcumin dan bisdesmethoxy-curcumin
(Sudarsono dkk., 1996).
e. Sifat
Akar kunyit mempunyai bau khas aromatik, rasa agak pahit, agak pedas dan dapat bertindak sebagai astringensia (Prawiro, 1977). Astringensia merupakan zat yang bekerja lokal yaitu dengan mengkoagulasi protein tetapi demikian kecil daya penetrasinya sehingga hanya permukaan sel yang dipengaruhi. Serbuk akar kunyit menberikan zat warna yang berwarna kuning jika dilarutkan didalam air. Serbuk akar kunyit juga telah lama digunakan secara tradisional terutama oleh kaum India sebagai zat warna di kulit. Selain itu, akar kunyit telah digunakan berabad-abad sebagai pewarna dan sebagai komponen pewarna makanan seperti bubuk kari dan lain-lain (Sudarsono dkk., 1996).
2.2. Teknik Pewarnaan
Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali/diamati dengan mikroskop. Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau lampu mikroskop yang dipaparkan pada
sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap). Zat warna yang terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Dengan beberapa pengecualian, kebanyakan jaringan tidak berwarna, sehingga sulit untuk memeriksa jaringan yang tidak diwarnai di bawah mikroskop cahaya. Oleh karena itu, telah ditemukan metode-metode pewarnaan jaringan, yang tidak hanya membuat berbagai jaringan menjadi menyolok, tetapi memungkinkan pula diadakan perbedaan di antara komponen-komponen tersebut. Ini dilakukan dengan menggunakan campuran zat warna yang mewarnai komponen jaringan lebih kurang secara selektif.
Kebanyakan zat warna yang digunakan dalam pemeriksaan histologi bersifat seperti senyawa asam atau basa dan mempunyai kecenderungan untuk membentuk ikatan elektrostatik (garam) dengan gugus-gugus jaringan yang dapat berionisasi. Komponen jaringan yang lebih mudah diwarnai dengan zat warna basa disebut basofilik; yang menpunyai afinitas terhadap zat warna asam disebut asidofilik.
Contoh zat warna basa adalah biru toluidin dan biru metilen. Hematoksilin berkelakuan seperti zat warna basa, yaitu mewarnai jaringan basofilik. Komponen ringan utama yang berionisasi dan bereaksi dengan zat warna basa melakukan hal itu karena asam dalam komposisi mereka (nukleoprotein dan mukopolisakarida asam). Zat warna asam misalnya orange G, eosin dan fuchsin asam kebanyakan mewarnai komponen basa yang ada di dalam protein sitoplasma. Sifat basa atau asam suatu zat biasanya menjelaskan reaksi pewarnaan secara kimia, tetapi juga ada dasar-dasar fisika.
Dari semua zat warna, yang paling sering digunakan adalah gabungan hematoksilin dan eosin (H&E). Banyak warna lain yang digunakan dalam berbagai prosedur histologik. Meskipun zat warna berguna dalam menggambarkan berbagai komponen jaringan, tetapi biasanya tidak memberikan keterangan mengenai sifat kimia jaringan yang sedang dipelajari.
Didasarkan pada metoda produksi, ada dua jenis zat warna, yaitu yang alami dan sintetis (Carleton, 1976). Hematoksilin diperoleh dari pohon logwood yaitu Haematoxylum Campachianum adalah contoh pewarnaan alami (Baker & Silverton, 1976). Hematoksilin adalah zat warna mitra untuk eosin di teknik pewarnaan hematoksilin dan eosin. Ia akan membuat nukleus berwarna biru-violet atau coklat. Sedangkan eosin adalah pewarna sintetis yang mewarnai sel darah merah, sitoplasma, membran sel, kalogen dan struktur di luar sel dengan memberikan warna merah muda atau warna merah.
Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades. 2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat.
3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol dulu sebelum ditambahkan bahan lain.
4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik.
5. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan dengan menyaringnya menggunakan kertas saring.
6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan tuangkan dalam wadah yang sesuai.
7. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan. 8. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol
Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsentrasi alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%.
Pulasan (Pewarnaan) Hematoksilin-Eosin
Pulasan (pewarnaan) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu pulasan hematoksilin-eosin (H&E). Pada pulasan H&E digunakan dua macam zat warna yaitu hematoksilin yang berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik) serta eosin yang merupakan
counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan
penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda. Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863. Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini dikenal sebagai ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin untuk mewarnai inti sel akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yang sering dipakai adalah mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer sedangkan counterstaining yang dipakai adalah eosin, safranin, dan phloxine.
Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah ( Jusuf, 2009) : 1. Hematoksilin Erlich
Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut:
- Hematoksilin ………. 6 gram - Alkohol absolut ………. 300 ml - Akuades ..……….. 300 ml - Glycerol ……… 300 ml - Glacial acetic acid ……… 30 ml - Potassium alum ……… berlebihan Cara pembuatannya adalah sebagai berikut:
1. Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol
2. Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya secara berurutan sambil digerus
3. Akhirnya tambahkan kristal potassium alum (Aluminium potassium sulfate) sambil menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar botol.
4. Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai pematangan.
2. Hematoksilin Delafield
Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa
larutan eosin dalam air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah sebagai berikut:
- Hematoksilin kristal ………... 6 gram - Alkohol absolut ………. 50 ml - Ammonium alum ……….... 55 gram - Akuades ………. 600ml - Glycerol ………. 150ml
Cara pembuatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut: 1. Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut
2. Larutkan ammonium alum dengan akuades hingga jenuh (saturated) 3. Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari 4. Saring dan tambahkan glycerol
5. Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya
6. Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya
3. Hematoksilin Mayer
Larutan Hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah sebagai berikut:
- Hematoksilin kristal ……….. 1gram - Aquades ……… 1000ml - Sodium iodate ………0.2 gram - Ammonium/potassium alum ………. 50gram - Citric acid ……… 1gram - Chloral hydrate ……… 50gram Cara pembuatannya adalah sebagai berikut:
1. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades 2. Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik
4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik 5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya
4. Hematoksilin Harris
Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat,
counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20
menit. Formulanya adalah sebagai berikut:
- Kristal hematoksilin ……… 5.0 gram - Alkohol 100% ………. 50 ml - Ammonium/potassium alum ……… 100 gram - Distilled water ……… 1000 ml - Merkuri oksida ……… 2.5 gram
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut (Jusuf, 2009) : 1. Larutkan hematoksilin di dalam alkohol
2. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan 3. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut
4. Panaskan dengan cepat sambil diaduk
5. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida ke dalamnya perlahan-lahan
6. Panaskan kembali hingga larutan bewarna ungu gelap
7. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah berisi air dingin hingga larutan hematoksilin menjadi dingin
8. Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan
9. Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml larutan untuk meningkatkan ketajaman warna inti
Larutan Counterstaining
Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah eosin, safranin dan phloxine.
1. Larutan Eosin
Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut:
- Eosin Y, water soluble ……….. 1.0 gram 1% Stock Alkohol-Eosin
- Distilled water ……… 20 ml - Larutkan dan tambahkan
- Alkohol 95% ……….. 80 ml
- Eosin stock solution ……… 1 bagian
Working Eosin Solution
- Alkohol 80% ………. 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik
2. Larutan Phloxine
Larutan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working
solution dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut:
- Eosin Y water soluble ……… 1 gram
Stock Eosin - Distilled water ……… 100ml - Phloxine B ……….. 1.5 gram Stock Phloxine - Distilled water ……… 100ml - Stock Eosin ………. 100ml Working Solution - Stock Phloxine ……… 10ml - Alkohol 95% ……….. 780ml
- Asam asetat glasial ………. 4ml 2% Alkohol Safran
- Safran du Gatinais ……….. 2 gram - Alkohol 100% ……… 100ml
Pulasan rutin yang banyak dipakai adalah: Pulasan Hematoxylin Mayer-Eosin
Pulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan 1. Differensiasi warna sangat jelas
2. Mewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan latar belakang yang tidak bewarna
3. Hasil konsisten
4. Prosedurnya sederhana
5. Dapat mewarnai preparat yang difiksasi dengan fiksasi apapun juga
Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut a. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min)
b. Hidrasi dengan serial alkohol 100% (2x2 min) – 95% (2min) – 90% (2 min) – 80% (2 min) - 70% (2min) – Distilled water (3min) c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin mayers selama 15 min d. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit
e. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah selanjutnya
f. Counterstaining dalam larutan eosin working solution selama 15 detik hingga 2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan
g. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70% hingga 100% masing-masing 2 menit.
h. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min i. Tutup dengan balsem kanada
Hasil/ Interpretasi adalah
- Inti sel bewarna biru
- Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu
Gambar 2.2. Hasil pewarnaan HE Gambar 2.3. Hasil pewarnaan HE pada ginjal pada kulit tebal
Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin
Protokol pulasan hematoksilin Harris – eosin adalah sebagai berikut: a. Deparafinisasi dalam xylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-90%-80%-70%
c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat
e. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi warna di bawah mikroskop
f. Bilas dalam air mengalir secara singkat
g. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga potongan bewarna biru cerah
h. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal jaringan sulit terwarna oleh eosin
i. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit
j. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan, masing-masing selama 2 menit
k. Inkubasi dalam xylol 2x2menit l. Tutup dengan kaca penutup
Hasil/Interpretasi hasil pulasan - Inti sel bewarna biru
- Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu
Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dalam xylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-90%-80%-70%
c. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit d. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang e. Inkubasi dalam larutan hematoksilin mayer selama 15 menit f. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit
g. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit h. Basuh dengan air selama 5 menit
i. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali
j. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit k. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali
l. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada
Hasil/interpretasi
- Inti bewarna biru
- Sel darah merah bewarna vermillion pink - Tulang bewarna kuning
- Tulang rawan bewarna hijau kekuningan - Otot bewarna merah
