ANALISIS KUALITAS SPERMA IKAN NILEM ANALISIS KUALITAS SPERMA IKAN NILEM
(( OsteOsteochiochi ll us us hasshasseell ti ti ) )
Oleh : Oleh : Nama
Nama : : Harris Harris HermawanHermawan NIM NIM : : B1J012172B1J012172 Rombongan Rombongan : : VV Kelompok Kelompok : : 11 Asisten
Asisten : : Ilham Ilham AmrullohAmrulloh
LAPORAN PRAKTIKUM STRUKTUR DAN PERKEMBANGAN HEWAN II LAPORAN PRAKTIKUM STRUKTUR DAN PERKEMBANGAN HEWAN II
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO PURWOKERTO 2013 2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Spermatozoid atau sel sperma atau spermatozoa adalah sel dari sistem reproduksi jantan. Sel sperma akan membentuk zigot. Zigot adalah sebuah sel dengan kromosom lengkap yang akan berkembang menjadi embrio. Peran aktif spermatozoon sebagai gamet jantan sehingga penting pada keberhasilan munculnya individu baru oleh karena itu di dalam reproduksi sering diperlukan adanya standar kualitas spermatozoa. Spermatozoa adalah sel gamet jantan yang merupakan sel yang sangat terdeferensiasi, satu-satunya sel yang memilki jumlah sitoplasma yang terperas dan nyaris habis. Strukturnya sangat khusus untuk mengakomodasikan fungsinya (Sistina, 2000).
Analisis sperma yang dimaksud meliputi pemeriksaan jumlah milt yang dapat distriping dari seekor ikan jantan masak kelamin, kekentalan sperma, warna, bau, jumlah spermatozoa, motilitas (bila mungkin kemampuan gerak per menit) dan morfologi (ukuran dan bentuk kepala, ukuran ekor, berbagai penyimpangan, ada tidaknya akrosoma). Analisis sperma juga dilakukan untuk mengetahui bagaimana tahapan proses pembuahan, pewaktuan setiap tahapan pembuahan, dan dapat menentukan rasio spermatozoa dan ovum dalam pembuahan (Sistina, 2000).
Analisis sperma dilakukan untuk mengetahui bagaimana tahapan proses pembuahan, pewaktuan setiap tahapan pembuahan, dan dapat menentukan rasio spermatozoa dan ovum dalam pembuahan. Ikan nilem adalah ikan yang memenuhi persyaratan. Persyaratannya adalah :
1. Proses pembuahan yang terjadi di luar tubuh ikan nilem betina. 2. Terdapat pada ikan atau katak.
3. Hewan yang mudah disadap telur maupun sperma masaknya. 4. Mudah dibedakan antara jantan dan betina.
5. Telurnya bersifat transparan. 6. Mudah dioviposisikan.
7. Siklus hidup ikan nilem pendek
8. Telur maupun sperma yang dihasilkan setiap siklus reproduksi cukup banyak. Penggunaan ikan nilem sebagai preparat pada praktikum kali ini karena ikan nilem mudah didapatkan, ukuran tidak terlalu besar, murah, sehat dan produk telurnya relatif tinggi, serta dapat menggunakan pewarna standar seperti larutan giemsa. Analisis sperma yang dimaksud meliputi pemeriksaan jumlah milt yang dapat distriping dari seekor ikan jantan masak kelamin, kekentalan sperma, warna, bau, jumlah spermatozoa hidup, jumlah spermatozoa mati, motilitas, morfologi
(ukuran dan bentuk kepala, ukuran ekor, berbagai penyimpangan).
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum analisis sperma ini adalah untuk melakukan analisis sperma dan menentukan kualitas spermatozoa ikan nilem jantan (Osteochillus hasselti).
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikroskop cahaya, bilik hitung (haemositometer), gelas obyek, cover glass, kertas pH indikator universal, pipet tetes, tissue, bak preparat, cavity slide, tusuk gigi, pengukur waktu (hand
counter), macrometer, spuit 1 ml, beaker glass 50ml, well plate dan kamera.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sperma / milt segar ikan nilem, larutan ringer atau larutan NaCL fisiologis, pewarna giemsa atau eosin, dan akuades.
B. Metode
1. Cara Stripping :
a) Ikan dipegang dengan bagian ventral ada di bawah dan bagian dorsal menghadap ke atas,
b) Tangan kanan menutupi kepala, sedangkan tangan kiri menyangga ekor.
c) Bagian lubang urogenitalia dilap dengan tisu agar sperma tidak menempel dengan air
d) Abdomen ikan diurut dari anterior ke arah posterior menuju lubang urogenital hingga pada lubang tersebut keluar cairan berwarna putih susu (milt)
e) Milt yang keluar langsung disedot dengan menggunakan spuit injeksi tanpa jarum.
2. Volume
a) Milt ikan nilem yang tertampung pada spuit injeksi diukur volumenya dengan langsung membaca skalanya.
b) Volume sperma ikan nilem juga dapat diukur dengan menggunakan gelas ukur volume 5 atau 10 ml.
3. Warna
Diamati secara visual dengan latar belakang warna putih 4. Bau
Dibaui dengan cara dikipas-kipaskan dengan tangan, jangan dihirup langsung. 5. pH
Derajat keasaman (pH) diukur dengan menggunakan kertas pH, dengan cara mencelupkan kertas pH kedalam sampel sperma, diamkan beberapa saat, kemudian cocokkan perubahan warna yang terjadi dengan tube.
6. Cara pengenceran milt :
a) Sampel sperma diambil 1 ml dimasukkan di dalam cawan
b) Larutan ringer sebanyak 9 ml dicampurkan ke dalam cawan (perbandingan antara sampel dengan larutan pengenceran harus selalu 1:9).
c) Diaduk-aduk dengan menggunakan batang pengaduk sampai benar-benar homogen.
d) Sperma yang sudah diencerkan ini merupakan sperma dengan pengenceran 10 X
e) Sperma pengenceran 10x diambil dengan menggunakan spuit yang lain sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam cawan yang berbeda
g) Sperma dengan pengenceran dua kali ini, merupakan sperma dengan pengenceran 100x.
h) Pengenceran dilakukan lagi untuk mendapatkan sperma dengan pengenceran 1000x dan 10.000x.
7. Motilitas Spermatozoa
a) Milt yang sudah diencerkan 1000x diambil dengan menggunakan pipet tetes b) Milt diteteskan di atas objek glass
c) Ditetesi dengan aquades, kemudian di homogenkan
d) Ditutup dengan cover glass dan diamati dengan menggunakan mikroskop e) Bergerak atau tidak bergerak, ditentukan presentase motilitasnya.
8. Menghitung jumlah total spermatozoa
a) Milt yang sudah diencerkan 1000x diambil dengan menggunakan pipet tetes b) Diteteskan di bilik hitung Haemocytometer yang sudah ditutup dengan cover
glass melalui sela-sela paritnya.
c) Hitung jumlah sperma menggunakan lima kotak sedang di dalam kotak besar yang di bagian tengah.
d) Jumlah total spermatozoa dihitung dengan Rumus :
Σ total spermatozoa = (Rata-rata 5 kotak sedang x pengenceran x 2,5.105) sel/ml.
9. Viskositas sperma
a) Sperma ikan nilem diletakkan pada mangkuk kecil
b) Sperma diambil kemudian ditaruh lagi menggunakan tusuk gigi tetapi dengan kecepatan pelan dan dilakukan berulang-ulang sampai mendapatkan kekentalan sperma
c) Dihitung berapa lama waktu yang dibutuhkan untuk sperma benar-benar mengental.
III. Hasil dan Pembahasan A. Hasil
LEMBAR PENGAMATAN PRAKTIKUM ANALISIS SPERMA Rombongan V / Kelompok 1
1. Volume milt : 0,4 ml
2. pH : 8,5
3. Warna milt : Putih susu
4. Bau milt : Amis
5. Jumlah Spermatozoa/ml : 3,55 x 1010 sel/mm
6. Motilitas : Pengenceran 100x (60%) 7. Morfologi spermatozoa : Perbesaran 40x10
8. Viskositas : 11 Menit 6 Detik
Tabel 1. Akumulasi Data Pengamatan ∑Total Spermatozoa Rombongan V
K1 K2 K3 K4 Rata-rata ∑ Total Spermatozoa 3,55 X 1010 3,4 x 1010 3,25 x 1010 4,8 x 1010 3,75 x 1010 Keterangan : K = Kelompok Perhitungan :
∑ Total Spermatozoa = ∑rata-rata 5 kotak x pengenceran x 2,5 x 105 x fp (sel/ml) = (71:5) x 2,5 x 105 x 10.000
= 14,2 x 10.000 x 2,5.105 = 3,55 x 1010 sel/mm
2 3
Gambar 1 Gambar 2
Gambar 1 : Mikroskopik Morfologi Spermatozoa Perbesaran 400 kali Gambar 2 : Skematis Morfologi Spermatoza
Keterangan Gambar : 1. Ekor
2. Leher 3. Kepala
B. Pembahasan
Gamet jantan pada umumnya berukuran relatif kecil, tanpa atau sedikit sekali cadangan makanan, aktif bergerak (motil) dan dibentuk dalam jumlah besar. Spermatozoa dihasilkan terus menerus tiap hari. Gerakan spermatozoa ketika masih dalam tubulus seminiferus spermatozoa tak bergerak. Secara berangsur dalam ductus epididimis mengalami pengaktifan. Kecepatan spermatozoa saat keluar dari tubuh dalam medium cairan saluran kelamin betina sekitar 2,5 mm/menit (Sistina, 2000).
Bau semen yang khas tajam dan amis, berasal dari oksidasi sperma yang dihasilkan prostate. Jika tak ada bau khas mani, prostate tak aktif atau ada gangguan. Mungkin gangguan itu pada saluran atau kelenjar sendiri. Semen yang berbau busuk diduga disebabkan oleh suatu infeksi (Yatim, 1984). Keadaan fisik semen yang baru diejakulasi adalah kental. Sekitar 15 menit kemudian akan mengalami pengenceran, disebut likuifikasi, oleh seminin (enzim lysis) yang dihasilkan prostate. Pengenceran yang tidak wajar berarti ada ketidakberesan pada kelenjar itu. Warna semen waktu baru diejakulasi yaitu putih susu. Makin gelap warna ini jika makin banyak terkandung spermatozoa di dalam. Jika spermatozoa sedikit sekali atau tidak ada di dalam, semen itu bening jernih.
Bila berwarna coklat atau kecoklat-coklatan menandakan bahwa semen itu mengandung darah yang telah rusak atau busuk. Adakalanya semen itu berwarna kream tua sampai kuning, warna ini disebabkan oleh banyaknya jumlah pigmen riflavin yang menurut banyak pendapat tidak mempunyai peranan apa-apa terhadap spermatozoa maupun terhadap kesuburan semen itu (Partodiharjo, 1990).
Morfologi spermatozoa pada ikan berbeda dengan manusia. Manusia memiliki spermatozoa yang berkepala lonjong (dilihat dari atas) dan piriform (dilihat dari samping). Lebih tebal dekat leher dan menggepeng ke ujung. Kepala 4-5 mikro
meter panjang dan 2,5-3,5 mikro meter lebar. Panjang ekor seluruhnya sekitar 55 mikro meter dan tebalnya berbeda, dari 1 mikro meter dekat pangkal ke 0,1 mikro meter dekat ujung. Sedangkan ikan memiliki spermatozoa yang berflagelata dan tak berakrosoma. Spermatozoa hasil suspensi testis keadaanya sama dengan spermatozoa hasil striping. Kepala berbentuk bulat, dengan diameter sekitar 2,86-0,16 mikro meter, panjang sekitar 25,86 mikro meter. Pada pangkal flagella ada bangunan seperti cincin, annulus (Jamieson, 1991)
Praktikum analisis sperma yang di lakukan pada tiga ekor ikan nilem menunjukan bahwa setiap ikan menghasilkan jumlah semen yang berbeda. Jumlah semen yang diambil dari ketiga sampel ikan nilem didapatkan volume sebanyak 0,4 ml, jika diambil rata-rata maka tiap ikan hanya menghasilkan semem sebanyak 0,13 ml. Hal ini tidak menunjukan volume semen tidak dalam keadaan normal,dikarenakan berdasarkan pernyataan (Yatim, 1984) bahwa volume normal semen sekali diejakulasi sekitar 2,0 sampai 3,0 ml, ada juga yang sampai 4,5 ml. Jika volume kurang dari 1 ml, ada kemungkinan tak beresnya prostate dan vesicula seminalis yang merupakan penghasil utama plasma semen. Konsentrasi atau jumlah spermatozoa/ml semen, dihitung dengan hemocytometer Neubauer. Dihitung dengan melihatnya di bawah mikroskop perbesaran 40 x 10. Hasil yang didapat pada praktikum menunjukan jumlah sel sperma sebanyak 3,55 x 1010sel/ml dengan motil 60%. Hal ini tidak seperti pendapat (Yatim, 1984) yang menyatakan bahwa konsentrasi 70-65 juta/ml, dengan range 0,1-600 juta/ml. Jumlah yang bergerak maju ialah jumlah spermatozoa semua dikurangi jumlah mati. Dianggap normal jika motil maju > 40%. Lebih lanjut. Viskositas yang didapatkan pada praktikum yaitu pada waktu 11 menit 6 detik.
PH yang didapat berdasarkan pengukuran kadar keasaman pada semen preparat uji adalah 8,5, sedangkan kadar keasaman sperma normal adalah 7,2-7,8.
PH lebih dari 8 menunjukkan adanya radang akut kelenjar kelamin atau epididimitis. Kadar keasaman kurang dari 7,2 menunjukkan adanya penyakit kronis pada kelenjar, jika pH rendah sekali menunjukkan ada gangguan pada organ genital.
Faktor-faktor yang mempengaruhi kualitas dan kuantitas spermatozoa yaitu: 1. Temperatur
Aktivitas metabolisme dan gerakan spermatozoa akan normal pada temperatur tubuh dan akan meningkat kecepatannya di luar tubuh apabila temperaturnya di atas normal menyatakan bahwa temperatur yang optimal untuk metabolisme spermatozoa adalah pada temperatur tubuh bahkan temperatur lebih rendah memberikan motilitas spermatozoa yang lebih panjang (Hidayaturrahmah, 2007).
2. Kandungan zat makanan (karbohidrat)
Kandungan zat makanan (karbohidrat) misalnya fruktosa merupakan substrat energi utama di dalam plasma semen yang diproduksi oleh kelenjar vesikularis. Fruktosa dapat dijadikan sumber energi untuk mendukung pergerakan dan ketahanan spermatozoa karena fruktosa meningkatkan aktivitas protein yang terdapat pada ekor spermatozoa, sebab ekor spermatozoa disusun oleh mikrotubulus yang mengandung substansi fiber yang disusun oleh protein dinein. Protein dinein penting karena mempunyai aktivitas ATP-ase. ATP-ase akan lancar dan menyebabkan peningkatan motilitas spermatozoa (Hidayaturrahmah, 2007).
3. Penggunaan larutan fisiologis
Menurut Hidayaturrahmah (2007), fertilisasi dapat didukung oleh kualitas spermatozoa yang baik. Larutan fisiologis dapat menambah daya viabilitas dan
motilitas spermatozoa. Penggunaan larutan fisiologis yang mengandung NaCl dan urea dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa antara 20-25 menit.
Pewarnaan sperma untuk keperluan pengamatan morfologi tidak terikat hidup matinya sperma, seperti pada pewarnaan hidup matinya sperma. Sel spermatozoa yang normal dengan dimensi umum, seekor spermatozoa secara sitologi terbagi atas kepala dan ekor. Ekor terbagi menjadi bagian tengah atau leher, bagian utama dan bagian ujung. Ciri-ciri sel spermatozoa yang normal adalah :
1. Kepala.
Bentuk : bulat lonjong, gepeng.
Dimensi : tebal : 1-2 mikron; panjang : 9 mikron. 1. Leher
Bentuk : bulat, pendek.
Dimensi : garis tengah 1 mikron; panjang 13 mikron. 1. Ekor.
Bentuk : bulat, panjang.
Dimensi : garis tengah 0.25-0.5 mikron. Bagian ujung mungkin bergaris tengah kurang dari 0.25 mikron, panjang 44-50 mikron (Partodiharjo,1990).
Banyak macam bentuk spermatozoa yang abnormal yang mungkin dapat dilihat. Bentuk abnormal dapat dibedakan antara bentuk abnormal yang primer dan bentuk abnormal yang sekunder. Bentuk abnormal primer berasal pada gangguan
testes, mungkin karena memang cacat. Bentuk abnormal sekunder biasanya berasal dari perlakuan setelah semen itu meninggalkan testes, misalnya mendapat kocokan yang keras dalam tabung penampung, dikeringkan terlalu cepat, dipanaskan dengan temperature terlalu tinggi, pengesekan yang tidak berhati-hati ketika membuat sedian (Partodihajo, 1990).
Spermatozoa abnormal merupakan spermatozoa berbentuk lain dari biasa, terdapat baik pada individu fertil maupun infertil. Hanya saja pada individu fertil kadarnya lebih sedikit. Bentuk abnormal terjadi karena berbagai gangguan dalam spermatogenesis. Gangguan itu mungkin karena faktor hormonal, nutrisi, obat, akibat radiasi, atau oleh penyakit (Yatim, 1992). Bentuk sperma dibawah ini adalah bentuk sperma yang abnormal menurut Jauhari (2005):
1. Makro : Ukuran kepalanya lebih besar dari ukuran kepala normal. 2. Mikro : Ukuran kepala lebih kecil dari ukuran kepala normal.
3. Taper : Spermanya kurus, lebar kepalanya setengah dari kepala normal, tidak jelas batas akrosom
4. Piri : tidak jelas adanya kepala nyata, tampak midpiece dan ekor saja. 5. Amorf : Bentuk kepala ganjil, permukaan tidak rata, tidak jelas batas
akrosom.
6. Round : Bentuk kepala seperti lingkaran, tidak menunjukkan akrosom. 7. Cytoplasmic droplet : menempel pada kepala, warna lebih erah.
8. Ekor abnormal : ekornya pendek/ spiral/ permukaan tidak halus/ ganda.
Kepala spermatozoa bentuknya bervariasi. Isinya adalah inti (di dalamnya terkandung material genetik) haploid yang berupa kantong berisi sekresi-sekresi enzim hidrolitik. Spermatozoa yang kontak dengan telur, isi akrosomnya dikeluarkan secara eksositosis yang disebut dengan reaksi akrosom (Sist ina, 2000).
Jumlah spermatozoa 20 – 250 juta/ml sudah dianggap masuk dalam batas- batas yang normal. Menurut Maria et al. (2006), proses lingkungan yang dingin dan bahan-bahan kimia juga mempengaruhi motilitas spermatozoa. Sperma pada ikan kemungkinan tidak hidup pada plasma. Sperma dilepaskan pada lingkungan akuatik,
osmosis menurun (pada spesies air tawar) dan motilitas sperma dimulai (Maria et al., 2006).
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini meliputi mikroskop untuk membantu dalam penglihatan sperma, object glass + cover glass berfungsi mengetahui berapa lama terjadinya benang pada milt ikan (sperma ikan) dengan menggunakan tusuk gigi di aduk secara perlahan, well plate digunakan untuk pengeceran dan dihomogenkan dengan menggunakan pipet tetes, spuit 1ml
digunakan untuk striping/pengambilan sperma pada ikan nilem.
Larutan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain larutan ringer atau larutan NaCL fisiologis digunakan untuk pengenceran. Larutan giemsa untuk mewarnai sediaan apus spermatozoa. Kesulitan-kesulitan yang dialami pada saat praktikum analisis sperma yaitu kesulitan dalam menghitung jumlah total spermatozoa menggunakan bilik hitung haemocytometer, kesulitan dalam pengamatan motilitas spermatozoa dan kesulitan dalam mengamati morfologi
spermatozoa.
Penggunaan haemositometer untuk menentukan jumlah spermatozoa dalam semen menurut pendapat terbaru dianggap kurang praktis, karena kecuali memerlukan sedikit keahlian dalam menghisab juga memerlukan waktu dalam menghitung dengan mikroskop. Sperma yang diteteskan di atas kotak hemocytometer ditutup dan dihitung, hasilnya dicatat misalnya y. Y ini adalah jumlah sel-sel spermatozoa yang mati dan yang terlihat tidak bergerak dalam
kotak-kotak. Spermatozoa yang tidak bergerak belum tentu mati (Partodiharjo, 1990).
Pemeriksaan sperma ikan nilem ini dapat diaplikasikan terhadap spesies lain, misal pada ikan mas, ikan paus, atau pada clasiss lain. Spermatozoa juga berfungsi untuk mengantarkan material genetis jantan ke betina dan mengaktifkan program
perkembangan telur, serta dapat melatih ketelitian kita dalam menggunakan mikroskop dan haemositometer.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan di atas dapat disimpulkan bahwa :
1. Sperma ikan nilem yang berkualitas berwarna putih susu, apabila warnanya berbeda kemungkinan ikan nilem tersebut mengalami infeksi.
2. Ikan Nilem memiliki bau yang khas yaitu amis.
3. Sperma Nilem dalam keadaan basa, karena memiliki pH 8,5
4. Struktur sperma normal terdiri dari tiga bagian yaitu kepala, leher dan ekor. 5. Gangguan pada sperma dikarenakan faktor hormonal, nutrisi, obat, akibat
radiasi, atau oleh penyakit
6. Kualitas dan kuantitas spermatozoa kurang baik sebab berdasarkan pengamatan terdapat beberapa hasil yang tidak sesuai dengan pustaka diantaranya yaitu volume, jumlah, morfologi sperma normal dan abnormal, serta persentase spermatozoa motil dan non motil sehingga tingkat keberhasilan spermatozoa untuk membuahi sel telurnya adalah kecil.
A. Saran
Praktikum analisis sperma kali ini sebaiknya dilakukan secara teliti dan cermat, karena pada pengamatan di mikroskop sering terjadi ketidakjelasan perhitungan sperma pada bilik hitung hymocitometer dan sebaiknya setiap kelompok mendapatkan sampel (Ikan nilem jantan) masing-masing agar praktikan dapat melakukan striping secara langsung.
DAFTAR REFERENSI
Anonim. 2006. Mesin Canggih Berbahan Bakar Gula. Dikutip dari www.harunyahya.com. Diakses pada tanggal 29 September 2013.
Christopher . P Jones , Maria . B. R, Martin . R, et al,.2011. Variation in male reproductive traits among three bitterling fishes (Acheilognathinae: Cyprinidae) in relation to the mating system. 622 – 632.
Hidayaturrahmah. 2007. Waktu motilitas dan Viabilitas Spermatozoa Ikan Mas(Cyprinus carpio L) pada Beberapa Konsentrasi Larutan Fruktosa. Studi Biologi Universitas Lambung Mangkurat, Kalimantan Selatan.
Jamieson, Barrie GM. 1991. Fish Evolution and Sistematics : Evidence from Spermatozoa. Cambridge University Press, Cambridge.
Jauhari, M.A. 2005. Penyediaan Induk dan Benih Bermutu ser ta Teknik Pembesaran
Ikan. Direktorat Jendral Perikanan Budidaya Balai Budidaya Air Tawar, Sukabumi. Maria et al., 2006. Effects of cooling and freezing on sperm motility of the
endangered fish piracanjuba Brycon orbignyanus (Characiformes, Characidae). Brazil.
Nelsen, O. C. 1953. Comparative Embryology of the Vertebrates. The Blankiston Company, New York. Toronto.
Partodiharjo, Soebadi. 1990. Ilmu Reproduksi Hewan. Mutiara Sumber Widya, Surabaya.
Rugh, R. 1962 Experimental Emrbryology. Burger Publishing Company, Minnesota. Shu S.Zhang, Jian H.H, et al,.2009. The cryoprotective effects of soybean lecithin on
boar spermatozoa quality. Vol. 8 (22).6476-6480
Sistina, yulia. 2000. Biologi Reproduksi. Fakultas Bioogi, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.
Sunarma, A, D. W. B. Hastuti, Yulia Sistina, 2007. Penggunaan Ektender Madu yang Dikombinasikan dengan Krioprotektan Berbeda pada PengawetanSperma Ikan Nilem (Indonesian Sharkminnow, Osteochillus hasselti Valanciennes, 1842) :
1-9.
Yatim, Wildan. 1984. Embriologi untuk Mahasiswa Biologi dan Kedokteran. Tarsito Press, Bandung.
