Maaperän, koivun alkuperän ja genotyypin vaikutukset raudus- ja hieskoivun kasvuun ja fysiologiaan.

MAAPERÄN, KOIVUN ALKUPERÄN JA GENOTYYPIN

VAIKUTUKSET RAUDUS- JA HIESKOIVUN KASVUUN JA

FYSIOLOGIAAN

Helena Ruhanen

Pro Gradu -tutkielma

Bio- ja ympäristötiede

Itä-Suomen yliopisto,

Ympäristö- ja biotieteiden laitos

Huhtikuu 2018

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötieteen pääaine

Tekijän nimi: Helena Marjaana Ruhanen

Opinnäytetyön nimi: Maaperän ja genotyypin vaikutukset raudus- ja hieskoivun kasvuun ja fysiologiaan.

Pro Gradu -tutkielma 56 sivua, 0 liitettä

Tutkielman ohjaajat: Tarja Silfver, Elina Oksanen Huhtikuu 2018

________________________________________________________________________ avainsanat: rauduskoivu, hieskoivu, maaperän ravinteisuus, klorofylli, typpi

TIIVISTELMÄ

Siirtoistutuskokeilla voidaan tutkia lajien keinoja ja kykyä sopeutua erilaisiin elinympäristöihin ja niiden muutoksiin kuten ilmaston lämpenemiseen. Pohjoisten koivulajien selviämistä lämpenevässä ilmastossa tutkitaan BETUMICS-projektissa, jossa siirtoistutetaan mikrolisättyjä raudus- ja hieskoivugenotyyppejä pohjois-eteläsuunnassa niiden levinneisyysalueella. Istutukset on tehty niin kutsuttuihin ”common garden” kohteisiin Italian Toscanaan, Punkaharjulle ja Kolariin. Kenttäkokeessa ei kuitenkaan pystytä erottamaan maan ravinteisuuden tai päivänpituuden vaikutuksia ilmastotekijöiden vaikutuksesta. Siksi tässä pro-gradu tutkielmassa, nimeltään ”Maaperän, koivun alkuperän ja genotyypin vaikutukset raudus- ja hieskoivun kasvuun ja fysiologiaan”, testattiin maaperien vaikutuksia koivujen kasvuun ja fysiologiaan BETUMICS-projektin siirtoistutuskoetta varten. Erityisesti keskityttiin maaperän ravinteisuuteen, kuten typpipitoisuuteen.

Tutkitut maat kerättiin Toscanassa, Punkaharjulla ja Kolarissa sijaitsevista siirtoistutuskohteista. Kussakin kohteessa tutkitaan koivujen menestymistä kahdella koekentällä, joiden maaperät edustavat erilaisia ravinnetasoja, eli tutkittavia maita oli yhteensä kuusi. Tutkimukseen valitut koivugenotyypit ovat peräisin näiden siirtoistutuskohteiden läheltä. Jokaisesta koivualkuperästä tutkittiin sekä raudus- että hieskoivulta viittä eri mikrolisättyä genotyyppiä. Taimia oli yhteensä 180 ja tavoitteena oli tutkia jokaista genotyyppiä kussakin maassa (6 maata x 2 lajia x 3 alkuperää x 5 genotyyppiä = 180). Taimien kasvatus eri tutkimusmaaperissä tapahtui ajalla 9.5.2016 -22.6.2016, jonka aikana taimien klorofylli-, antosyaani, flavonoli- ja typpi-indeksit mitattiin kaksi kertaa optisesti Dualexilla. Kokeen lopussa mitattiin taimien biomassa, juuri-versosuhde, pituuskasvu, lehtialaindeksi ja lehtien typpipitoisuus.

Maaperän korkeampi typpipitoisuus nosti koivun lehtien typpipitoisuutta (% kuivapainosta) ja samalla typpi- ja klorofylli-indeksejä kokeen lopussa. Vastaavasti maaperän pienempi typpipitoisuus oli yhteydessä lehtien pienempään typpipitoisuuteen (% kuivapainosta) ja kohonneisiin flavonoli- ja antosyaani-indekseihin, jotka ovat ravinnepuutosstressin indikaattoreita. Taimien pituuskasvu oli sitä suurempaa, mitä enemmän maaperässä oli typpeä. Pohjoisinta, kittiläläistä alkuperää olevilla koivuilla oli molemmilla lajeilla 20-30 % enemmän typpeä lehdissään verrattuna italialaisiin tai punkaharjulaisiin alkuperiin. Tulokset osoittavat, että maaperän vaikutus on huomioitava tarkasteltaessa siirtoistutuskokeen tuloksia.

SISÄLLYSLUETTELO

1. JOHDANTO ... 1 2. KIRJALLISUUSKATSAUS ... 2 2.1. RAUDUS- JA HIESKOIVU ... 2 2.2 MAAPERÄ ... 3 2.2.1 Maaperän ominaisuuksia ... 3

2.2.2 Ravinteisuuteen vaikuttavia tekijöitä ... 4

2.3 RAVINTEET KOIVUN KASVUTEKIJÖINÄ ... 5

2.3.1 Yleistä ... 5

2.3.2 Ravinteet koivun fysiologiassa ja ravinteiden puutokset ... 6

2.4 ANTOSYAANIT JA FLAVONOLIT ... 8

2.4.1 Antosyaanit ja flavonolit yleisesti ... 8

2.4.2 Antosyaanien ja flavonolien rooli kasvin ravinnepuutoksissa ... 9

2.4.2 Antosyaanien muut tehtävät kasvin puolustusjärjestelmässä ... 10

2.5 TYÖN TAVOITTEET ... 11

3. AINEISTO JA MENETELMÄT ... 12

3.1 TAIMIMATERIAALI JA MAAPERÄT ... 12

3.2 KOEASETELMA ... 16

3.3 PITUUSKASVUN, BIOMASSOJEN JA SLA-INDEKSIN MÄÄRITYS... 17

3.4 PIGMENTTIEN MITTAUS ... 18 3.4.1 Dualexin toimintaperiaate ... 18 3.4.2 Dualex-mittausten toteutus ... 18 3.5 TYPPIANALYYSIT LECO-ANALYSAATTORILLA... 19 3.6 TILASTOLLISET MENETELMÄT ... 19 4. TULOKSET ... 20 4.1 PITUUSKASVU ... 20 4.2 BIOMASSA ... 24 4.2.1 Juuri- ja versobiomassa ... 24 4.2.2 Juurimassafraktio ... 26 4.3 LEHTIALAINDEKSI ... 26

4.4 LEHTIEN TYPPIPITOISUUS ... 30

4.5 LEHTIEN PIGMENTIT, TYPPI-INDEKSIT JA TYPPIPITOISUUDET ... 33

4.5.1 Klorofylli-indeksi ... 33

4.5.2 Flavonoli-indeksi ... 36

4.5.3 Antosyaani-indeksi ... 37

4.5.4 Typpi-indeksi ... 39

4.6. PITUUSKASVUN, LEHTIEN JA MAAN TYPPIPITOISUUKSIEN SEKÄ PIGMENTTIEN VÄLISET KORRELAATIOT ... 43

4.6.1 Pituuskasvun ja lehtien typpipitoisuuden suhteet lehtien pigmentteihin, typpipitoisuuteen ja typpi-indeksiin ... 43

5. TULOSTEN TARKASTELU ... 46

5.1 MAAPERÄN RAVINTEISUUS ... 46

5.2 ALKUPERÄ JA GENOTYYPPI ... 48

5.3 MAAPERÄN MUUT OMINAISUUDET ... 50

5.4 POHDINTAA KOKEESTA JA TULOSTEN SOVELTAMISESTA ... 50

6. YHTEENVETO ... 51

7. KIITOKSET ... 52

1. JOHDANTO

Metsäpuut ilmentävät maaperän ominaisuuksia ulkoasullaan ja kasvullaan. Maaperän ominaisuuksilla on oleellinen rooli myös kasvien levinneisyyden ja paikallisen esiintymisen kannalta, sillä tiettyyn ravinnetasoon parhaiten sopeutunut kasvilaji syrjäyttää muita lajeja kasvien välisessä kilpailussa (Reinikainen ym. 1998). Maaperän ravinteisuus on tärkeimpiä kasvin kasvuun vaikuttavia tekijöitä ja siinä on paljon alueellista vaihtelua muun muassa ilmaston, maaperän mineraaliaineksen ja maannostyypin myötä (Augusto ym. 2017).

Tässä gradussa tutkitut raudus- ja hieskoivu ovat ekologisesti tärkeitä metsäpuita Euroopassa ja erityisesti rauduskoivulla on metsätaloudellisesti merkittävä rooli (Hynynen ym. 2010). Suomen talousmetsissä koivujen määrän on arvioitu kasvavan ilmastonmuutoksen myötä 10 – 20 % vuosisadan loppuun mennessä kasvukauden pitenemisestä ja keskilämpötilan noususta johtuen (Kellomäki ym. 2008). Briceno-Alizondon ym. (2006) simulaatiossa ilmastonmuutos lisäsi kasvua harvennetussa rauduskoivumetsässä Etelä-Suomessa 21 % ja Pohjois-Suomessa 34 %, mikä on kuitenkin pienempi kasvunlisäys kuin männyllä tai kuusella. Levinneisyysalueensa eteläisellä rajalla eteläisessä ja itäisessä Euroopassa ilmastonmuutoksen aiheuttama kuivuus ja metsäpalot puolestaan heikentävät koivujen elinolosuhteita (Lindner ym. 2010).

Siirtoistutuskokeissa esimerkiksi mikrolisättyä kasvimateriaalia siirretään uuteen, siirrettäville genotyypeille yhteiseen, kasvupaikkaan (ns. ”common garden”) ja seurataan siirrettyjen genotyyppien kasvua ja elinvoimaisuutta. Näin voidaan selvittää, miten kasvi on sopeutunut alkuperäiseen ympäristöönsä ja miten mukautuva sen fenotyyppi eli ilmiasu on (Franks ym. 2014). Siirtoistutuskokeessa myös maaperän ominaisuudet vaihtelevat siirtoistutuskohteiden välillä ja kenttäkokeessa maaperien vaikutuksia tutkittaviin kasveihin ei pystytä erottamaan esimerkiksi muuttuvista ilmasto-olosuhteista ja erilaisesta kasvinsyöjähyönteisten määrästä. Siirtoistutuskokeessa maaperän ominaisuuksilla voi olla jopa ilmasto-olosuhteita suurempi merkitys puun kasvuun (Rousi ym. 2017). Lämpenevän ilmaston vaikutusta pohjoisiin kasvipopulaatioihin voidaan tutkia tehtäessä siirtoistutus kohti lajin eteläisempiä levinneisyysalueita. Näin tehdään BETUMICS-nimisessä tutkimusprojektissa raudus- ja hieskoivulle. Projektissa on perustettu ”common garden”-kenttäkokeet Pohjois-Suomeen Kolariin, Etelä-Suomeen Punkaharjulle ja Pohjois-Italiaan Firenzen lähelle Toscanaan. Kohteet kattavat raudus- ja hieskoivun luontaisen levinneisyysalueen pohjois-eteläsuunnassa.

Tässä gradussa toteutettiin BETUMICS-projektin siirtoistutuskokeen maaperäesikoe, jossa testattiin siirtoistutuskohteiden maaperien vaikutusta siirrettäviin koivugenotyyppeihin laboratorio-olosuhteissa. Kolmessa siirtoistutuskohteessa tutkitaan koivujen menestymistä kahdella koekentällä, joiden maaperät edustavat erilaisia ravinteisuustasoja. Gradussa tutkittiin siis yhteensä kuutta erilaista maaperää. Taimet oli mikrolisätty siirtoistutuskohteiden läheltä samoista raudus- ja hieskoivugenotyypeistä, joita siirtoistutuskokeessa käytetään. Myös päivän pituus muuttuu siirrettäessä taimigenotyyppejä etelästä pohjoiseen minkä vuoksi päivän pituuden vaikutuksia kokeen genotyyppeihin selvitettiin kahdessa muussa pro gradu -työssä (Nhad 2017, Simin 2017).

Tässä gradutyössä tarkastelen kuinka maaperän ominaisuudet vaikuttavat raudus- ja hieskoivuntaimien kasvuun ja fysiologiaan kasvattamalla taimia eri maaperissä ja mittaamalla niiden kasvua, lehtien klorofylli-, antosyaani- ja flavonoli-indeksejä sekä lehtien typpipitoisuutta. Tarkastelen myös riippuvatko maaperän vaikutukset tutkittaviin taimiin koivulajista tai -alkuperästä.

2. KIRJALLISUUSKATSAUS

2.1. RAUDUS- JA HIESKOIVU

Rauduskoivu (Betula pendula Roth) ja hieskoivu (Betula pubescens Ehrh.) kasvavat Euroopan ja Euraasian lauhkeissa ja boreaalisissa metsissä. Molemmat lajit viihtyvät runsaassa valossa ja ne ovatkin pioneerilajeja metsän sukkession alkuvaiheessa. Ne lisäävät pohjoisten havumetsien biodiversiteettiä myös metsän sukkession muissa vaiheissa esimerkiksi lahopuuna. Koivu on kaupallisesti tärkein kesävihanta puu Pohjois- ja Itä-Euroopassa, mutta Keski- ja Etelä-Euroopassa se on kaupallisesti pienessä roolissa. Rauduskoivua kasvatetaan Pohjois-Euroopassa metsätaloudessa puhtaissa koivumetsissä, mutta suurimmat koivuvarannot ovat havupuiden vallitsemissa sekametsissä. Koivun osuus kasvavan puuston tilavuudesta vaihtelee pohjoismaissa 11 ja 16 ja Baltian maissa 17 ja 28 prosentin välillä (Hynynen ym. 2010).

Raudus- ja hieskoivun levinneisyysalueet ulottuvat usean biomin alueelle (Hynynen ym. 2010). Ilmasto rajoittaa metsien kasvua eri tavoin eri biomeilla ja siksi ilmaston lämpenemisen

vaikutukset raudus- ja hieskoivuun riippuvat osittain maantieteellisestä sijainnista. Lyhyt kasvukausi ja alhainen typen saatavuus rajoittavat kasvua boreaalisilla alueilla, joten siellä metsien tuottavuus yleisesti kohoaa ilmastonmuutoksen myötä. Välimeren alueen metsät ovat herkimpiä ilmastonmuutokselle lisääntyvän kuivuuden ja metsäpaloriskin takia. Kuivuusriski kasvaa Euroopassa lännestä itään mentäessä ja se on uhka myös lauhkean vyöhykkeen mantereisille metsille. Metsät ovat herkkiä ilmastonmuutokselle sillä puiden pitkä elinikä heikentää niiden sopeutumista nopeisiin ympäristömuutoksiin (Lindner ym. 2010).

Rauduskoivu on hieskoivua vaateliaampi kasvupaikan maaperän ravinteisuuden ja ilmavuuden suhteen. Se menestyy parhaiten hiekka-, hiesu- ja hietamoreenisilla mailla ja hienossa hiekassa, mutta kärsii helposti ravinneköyhässä tai liian tiiviissä ja märässä maassa. Sen tyypillinen kasvupaikka on runsasravinteinen metsä tai metsittynyt pelto. Pohjoisimmassa Euroopassa rauduskoivu suosii samankaltaisia kasvupaikkoja männyn kanssa, eli kuivia ja löyhärakenteisia maita. Hieskoivu puolestaan menestyy parhaiten runsasravinteisilla hiesu- ja moreenimailla, mutta kasvaa toisaalta myös kuivilla kankailla. Se menestyy myös hienorakenteisissa ja huonosti ilmastetuissa maaperissä, kuten tulvaherkillä alueilla, monentyyppisillä soilla ja turvemailla. Syynä on juuriston hyvä syvyysjakauma, kyky kuljettaa happea juurille ilmasta ja runsas mykorritsojen määrä. (Helsingin yliopiston Virtuaaliarboretum, hieskoivu. Kirj. Mia Huopalainen, Luettu 10.3.2017). Ravinteiden kierto on koivumetsissä havumetsiä nopeampaa. Koivun lehdet hajoavat nopeammin kuin havupuiden neulaset ja koivukarike on vähemmän hapanta. Koivujen juuret ovat usein syvällä ja voimakkaat. Kuolleiden juurien lahotessa joutuisasti maan huokoisuus kasvaa. (Hynynen ym. 2010).

2.2 MAAPERÄ

2.2.1 Maaperän ominaisuuksia

Maaperä (tai yleensä maa) tarkoittaa kallioperää peittävää irtonaista maakerrosta, johon kuuluu metsässä kivennäismaa ja sitä peittävä orgaaninen maaperä (Kellomäki, 2005 s. 37). Kivennäismaa koostuu erilaisista maalajeista, jotka taas koostuvat raekoon perusteella määritetyistä maalajitteista, kuten sora, hiekka, hieta ja hiesu. Maaperä voi olla lajittunutta kuten esimerkiksi savimaat tai lajittumatonta, kuten Suomessa yleinen moreeni (Kellomäki, 2005 s. 30). Lajittuminen vaikuttaa maaperän vedenpidätyskykyyn, joka on hienojakoisilla mailla karkeajakoisia suurempi. Toisaalta

hienojakoinen maa sitoo vettä karkeajakoista tiukemmin, jolloin hienojakoisessa maassa kasvien saatavilla olevaa vettä on vähemmän verrattuna prosentuaalisesti samaan veden määrään karkeajakoisemmassa maassa (Kellomäki, 2005 s. 40). Hajoamisen ollessa riittävän nopeaa viljavalla kasvupaikalla kivennäismaata peittämään muodostuu mullas ja hajoamisen ollessa hitaampaa muodostuu kangashumuskerros. Ilmaston, maaperän ominaisuuksien, pinnanmuodostuksen, maankäsittelyn sekä kasvien ja eläinten vaikutuksesta syntyy ajan kuluessa olosuhteille tietyntyyppinen maannos (Kellomäki 2005, s. 38).

2.2.2 Ravinteisuuteen vaikuttavia tekijöitä

Maaperän fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet vaikuttavat siihen, miten paljon kasveilla on saatavilla vettä ja ravinteita. Lisäksi kaikkia ravinteita, erityisesti fosforia, kaliumia, kalsiumia ja magnesiumia tulee metsiin märkä- ja kuivalaskeumana, jonka voimakkuudessa on paljon alueellisia eroja (Kellomäki 2005, s. 264). Laskeuma lisää pieninä määrinä ravinteisuutta ja kasvua, mutta on suurina määrinä haitallista, sillä runsas typpi- ja rikkilaskeuma aiheuttavat maaperän happamoitumista. Happamoitumisen yhteydessä ravinnekationeja alkaa huuhtoutua pois maaperästä ja raskasmetalleja, kuten alumiinia, muuttuu liukoiseen muotoon (Reinikainen ym. 1998).

Typen saatavuus ei ole suoraan linkittynyt maan mineraaliaineen koostumukseen tai rapautumisasteeseen (Augusto ym. 2017). Eliöihin sidottu typpi on alun perin peräisin ilmakehästä, joten typpi ei ole muiden ravinteiden tapaan kallioperästä peräisin oleva kivennäisravinne (Kellomäki, 2005, s.43). Kylmissä ja kuivissa ilmastoissa typen kokonaismäärä maaperässä on alhainen, sillä typen biologinen sitoutuminen maaperään on niukkaa vähäisen kasvillisuuden tuottaessa niukasti kuollutta kasvimateriaalia. Lisäksi kylmä ilmasto vähentää maan mikrobien aktiivisuutta hajottaa orgaanista ainetta, eli typen mineralisaatioprosessia. Ilmaston lämpenemisen on ennustettu lisäävän ravinteiden saatavuutta maasta arktisilla alueilla. Kylmillä alueilla fosfori voi nousta typen rinnalle kasvua rajoittavaksi tekijäksi (Augusto ym. 2017). Pohjoisilla alueilla, kuten Suomessa, alle 10 % metsämaan typestä on kasveille käyttökelpoisessa, liukoisessa muodossa (Kellomäki, 2005, s. 264).

Fosforin pitoisuuteen maaperässä ja sen saatavuuteen vaikuttavat vahvasti kallioperän koostumus ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, kuten pH. Toisin kuin typen kohdalla, ilmasto ei suoraan määrää fosforin saatavuutta maasta (Augusto ym. 2017). Tosin runsas sateisuus voi huuhtoa fosforia pois maaperästä runsassateisissa ilmastoissa ja lisätä siten fosforinpuutoksen todennäköisyyttä kasveilla (Ordoñez ym. 2009). Maaperän ravinteisuus vaihtelee suuresti sekä biomien välillä että niiden sisällä, mutta yleisesti ottaen fosforinpuutos on tyypillistä alhaisilla leveysasteilla ja typen puutos puolestaan korkeilla leveysasteilla (Augusto ym. 2017).

Maaperän mineraalien kiderakenteesta vapautuu magnesiumia kasvien käyttöön fysikaalisessa ja kemiallisessa rapautumisessa, johon vaikuttavat ilmasto, mineraalin ominaisuudet ja magnesiumin saatavilla oleva määrä (Katzensteiner ja Glatzel, 1997). Rapautumisen myötä magnesiumia myös suotautuu pois maasta riippuen liikkuvien anionien ja orgaanisten kompleksien määrästä ja runsas suotautuminen voi aiheuttaa magnesiumin puutoksia. Magnesiuminpuutos on tyypillistä esimerkiksi graniittipitoisille maille, joilla sitä ei ole luonnostaan paljoa. Myös turvemailla on usein alhainen magnesiumpitoisuus, sillä ne ovat ”eristettyjä” kivennäismaasta. Happamissa maissa magnesiumia on tyypillisesti vähemmän kuin neutraaleissa (Katzensteiner ja Glatzel, 1997). Magnesiumia on tyypillisesti vähiten hiekkaisilla mailla (Mn pitoisuus noin 0,05 %) ja savimaat ovat magnesiumrikkaimpia (Mn pitoisuus noin 0,5 %) (Barker ja Pilbeam, 2007 s.165).

2.3 RAVINTEET KOIVUN KASVUTEKIJÖINÄ 2.3.1 Yleistä

Kasvien, kuten myös koivun, toiminnalle välttämättömiä alkuaineita on 17. Niistä pääravinteita ovat typpi, fosfori, kalium, kalsium, magnesium ja rikki, mutta pääravinteisiin voidaan lukea myös happi, vety ja hiili. Kasvit tarvitsevat pieniä määriä myös hivenravinteita, joita ovat boori, kloori, kupari, rauta, mangaani, molybdeeni, nikkeli ja sinkki (Barker ja Pilbeam, 2006 s. 4). Kasvit ottavat ravinteita maasta sekä passiivisesti että aktiivisesti. Passiivisessa ravinteidenotossa ne ottavat veden virtauksen mukana veteen liuenneina pienimolekyylisiä ja varauksettomia ravinneioneja. Aktiivisessa ravinteidenotossa kantajamolekyylit siirtävät kasvin ATP-energian avulla suurimolekyylisiä ja varauksellisia ioneja elektrokemiallista gradienttia vastaan (Kellomäki,

2005 s. 112-113). Ravinteidenotto on selektiivistä ja usein kasvit ottavat ravinteita solukoihinsa erilaisessa suhteessa, kuin mitä niitä on maassa (Reinikainen ym. 1998).

Kalium ja typpiyhdisteet ovat kasvin sisällä erittäin liikkuvia ravinteita, fosfori, rikki ja magnesium kohtalaisen liikkuvia ja kalsium huonosti liikkuva (Reinikainen ym. 1998). Liikkuvuus tarkoittaa ravinteen taipumusta siirtyä haihtumisvirtauksesta nilaan kuljetettavaksi muualle kasviin. Remobilisaatiossa kasvi siirtää ravinteita muun muassa vanhoista lehdistä nuoriin tai kuolevista lehdistä varastoon runkoon tai juuriin. Ravinteiden liikkuvuus vaikuttaa muun muassa ravinnepuutosoireiden ilmenemiseen. Liikkuvien ravinteiden puutokset näkyvät ensin vanhoissa lehdissä ja heikosti liikkuvien nuorissa lehdissä ja kasvupisteissä (Reinikainen ym. 1998).

Koivun juuristo muodostaa tyypillisesti symbioosin mykorritsasienen kanssa. Symbioosissa isäntäpuun kyky ottaa vettä ja kivennäisravinteita, erityisesti fosforia, paranee kasvaneen juuristopinta-alan takia ja samalla sieni hyötyy saadessaan hiilihydraatteja isäntäpuulta (Kellomäki 2005, s. 69). Mykorritsat myös parantavat puiden typpitaloutta muuttamalla maaperän olosuhteita suotuisiksi typensitojabakteereille (Kellomäki 2005, s. 115). Monipuolisen maaperän pieneliöstön (Setälä ja Huhta, 1991) ja pelkkien kastematojen (Haimi ym. 1992) on havaittu edistävän rauduskoivun taimen biomassan kasvua, kohottavan lehtien typpipitoisuutta jopa kolmekertaiseksi ja lehtien fosforipitoisuutta puolitoistakertaiseksi verrattuna tilanteeseen, jossa maaperässä on vain mikrobisto. Samalla juurien osuus biomassasta pieneni. Setälä ja Huhta (1991) päättelivät, että maaperän eläimet paransivat maan rakennetta sekä ravinteiden (erityisesti typen) liikkumista ja mineralisaatiota, jolloin ravinteet olivat paremmin kasvien käytettävissä. Molemmissa kammiokokeissa (Setälä ja Huhta, 1991; Haimi ym. 1992) tutkittiin havupuumetsän maaperää kahden kasvukauden ajan.

2.3.2 Ravinteet koivun fysiologiassa ja ravinteiden puutokset

Typen ja fosforin puutokset rajoittavat maailmanlaajuisesti kasvien kasvua ja niiden lisäys parantaa kasvien kasvua kaikkialla paitsi hyvin kuivissa ilmastoissa (Augusto ym. 2017). Kasvupaikkakohtaisesti myös muiden ravinteiden puutokset ovat mahdollisia. Maaperän ravinteisuus vaikuttaa yleisesti ottaen ilmastoa enemmän kasvien lehtialaindeksiin ja lehtien typpipitoisuuteen (Ordoñez ym. 2009). Ravinnepuutokset hidastavat koko rauduskoivun ja sen

lehtien kasvua sitä voimakkaammin, mitä voimakkaampi puutos on. Lisäksi ravinnepuutosten yhteydessä rauduskoivuun on havaittu kertyvän tärkkelystä ja juurien osuuden kokobiomassasta kasvavan (McDonald ym. 1986). Ravinnepuutokset voivat ilmetä myös antosyaanien ja flavonolien kertymisenä lehtiin (kts. kappale 2.5.2).

Käyttökelpoisen typen määrä on maaperän tärkein yksittäinen kasvin kasvua määräävä ominaisuus. Kasvit ottavat typpeä maasta ammoniummuodossa (NH4+) tai nitraattina (NO3-). Typpi on aminohappojen, proteiinien ja nukleiinihappojen valmistuksessa välttämätön ravinne ja viherhiukkasissa on 25 -75 % kasvin typestä (Barker ja Pilbeam, 2007 s. 27). Typen puutteessa koivun klorofyllipitoisuus laskee ja koivun kasvu hidastuu (Horgan ja Wareing, 1980). Typpi on kasvissa liikkuva ravinne, joten sen puutokset näkyvät ensin vanhoissa lehdissä typen siirtyessä nuoriin lehtiin (Barker ja Pilbeam, 2007 s.29). Kohonnut typen saatavuus puolestaan lisää rauduskoivun pituuskasvua, lehtien kokoa ja varren kuivapainoa. Se myös pienentää lehtialaindeksiä johtuen pylvästylppysolukon ohenemisesta ja soluvälitilan kasvusta. Lehtien typpipitoisuus (% tuorepainosta) kasvaa maaperän typen määrän kasvaessa (Pääkkönen ja Holopainen, 1995).

Fosfori on tärkeässä roolissa kasvin energiankuljetuksessa esimerkiksi ATP (adenosiinitrifosfaatti) -molekyyleissä. Sitä on myös nukleiinihapoissa ja fosfolipideissä. Fosforinpuutoksesta kärsivät kasvit ovat tyypillisesti lyhyt- ja heikkovartisia ja niiden lehdet ovat pieniä ja tummanvihreitä. Kasvi siirtää fosforia typen tavoin vanhoista lehdistä nuorempiin, joten fosforin puutos näkyy kloroottisina ja nekroottisina oireina ensin vanhoissa lehdissä (Barker ja Pilbeam, 2007). Fosforin puutteessa rauduskoivun kasvu hidastuu, lehdet tummenevat ja alimmat lehdet alkavat tippua. Lisäksi sivuversot tyypillisesti lopettavat kasvunsa (Horgan ja Wareing, 1980). Maaperän fosforipitoisuus vaikuttaa lehtien fosforipitoisuuteen ja lehtien N:P -suhteeseen (Ordoñez ym. 2009).

Magnesium toimii kofaktorina esimerkiksi useissa fosfaatinkuljetukseen ja hiilensidontaan osallistuvissa entsyymeissä Klorofyllimolekyylin keskusatomina se on tärkeä ravinne myös yhteyttämisen kannalta ja 15 - 30 % kasvin magnesiumista sijaitseekin klorofyllissä (Barker ja Pilbeam, 2007 s.146). Magnesiumin puute aiheuttaa leveälehtisillä kasveilla kloroottisia oireita ja kellastumista lehtisuonten välisellä alueella tai koko lehdessä (Ende ja Evers, 1997). Kloroottisia ja nekroottisia oireita sekä kasvun hidastumista on havaittu magnesiuminpuutoksessa myös

rauduskoivulla vesiviljelytutkimuksessa (Ericsson ja Kähr 1993). Puutosoireet olivat vanhoissa lehdissä ja ne olivat sitä voimakkaampia, mitä vähemmän magnesiumia kasvi sai. Lisäksi kasvin suhteellinen kasvunopeus asettui suhteessa samalle tasolle kasvatusliuoksen magnesiumtason kanssa. Magnesiumin puutosoireista kärsivien lehtien tärkkelyspitoisuus laski samalla, kun ulkoisesti oireettomien lehtien tärkkelyspitoisuus pysyi ennallaan. Ericsson ja Kähl (1993) päättelivät erityisesti magnesiuminpuutoksesta johtuneen hiilihydraattien puutoksen heikentäneen kasvin kasvua.

2.4 ANTOSYAANIT JA FLAVONOLIT 2.4.1 Antosyaanit ja flavonolit yleisesti

Kasvit tuottavat useita erilaisia pigmenttejä, jotka osallistuvat kasvien viestintään ja puolustukseen (Lev-Yadun ja Gould, 2008). Antosyaanit ja flavonolit kuuluvat flavonoideihin, joka on laaja ryhmä kaikkialla kasveissa esiintyviä sekundäärisiä aineenvaihduntatuotteita (Tanaka ym. 2008). Tässä pro gradussa tutkittiin raudus- ja hieskoivun lehdistä antosyaaneja ja flavonoleja, sillä niiden tiedetään olevan kasvien ravinnepuutosindikaattoreita (kts. kappale 2.4.2).

Flavonoidit ovat polyfenoleja alhaisella molekyylipainolla ja niiden kemiallinen perusrakenne on C6-C3-C6. Niihin kuuluu tuhansia yhdisteitä, jotka voidaan jakaa pääryhmiin runkoon liittyneiden metyyli-, hydroksyyli-, glykosyyli- ja asyyliryhmien perusteella. Flavonolien muita pääryhmiä ovat luokittelusta riippuen esimerkiksi khalkonit ja flavonit. Flavonolit (ja flavonit) ovat hyvin vaaleankeltaisia tai ihmissilmälle näkymättömiä. Ne absorboivat UV-valoa, jonka hyönteiset havaitsevat. Antosyaanien värikirjo vaihtelee punaoranssista sinisen ja violetin eri sävyihin. Väri on riippuvainen kasvin muista pigmenteistä, metalli-ioneista ja pH:sta. Antosyaanit syntetisoidaan solulimassa fenyylialaniinista ja ne sijaitsevat epidermisolujen vakuolissa. Niitä voi olla kasvin kaikissa solukoissa, mutta tyypillisimmin ne sijaitsevat lehdissä ja varsissa (Tanaka ym. 2008). Antosyaaneja on tutkittu paljon, mutta niiden toimintaa ei vielä tunneta täysin. Niillä on kasveissa useita erilaisia rooleja ja ne suojaavat kasvia fysiologisesti abioottisia ympäristön stressitekijöitä, kuten UV-valoa, kuivuutta ja kylmyyttä vastaan (Steyn ym. 2002, Close ja Beadle 2003).

Muita tärkeitä kasvien pigmenttiryhmiä ovat esimerkiksi terpenoideihin kuuluvat karotenoidit, sekä betalaanit, jotka korvaavat cryophyllates-lahkon kasveilla antosyaanit. Karotenoidien väri vaihtelee keltaisesta punaiseen. Niiden synteesi tapahtuu viherhiukkasissa ja ne osallistuvat tiiviisti yhteyttämiseen suojelemalla fotosynteesikoneistoa foto-oksidatiivisilta vaurioilta. Ruskan aikana niiden värit ovat hyvin näkyvissä, kun vihreän klorofyllin määrä vähenee lehdistä (Tanaka ym. 2008).

2.4.2 Antosyaanien ja flavonolien rooli kasvin ravinnepuutoksissa

Useilla kasvilajeilla ravinteiden, erityisesti typen ja fosforin, puutokset nostavat antosyaanien pitoisuutta lehdissä (esim. Close ym 2000, Gaume ym. 2001; Close ja Beadle 2003, Steyn ym. 2002). Stewartin ym. (2001) kokeessa fosforin puutos lisäsi lehtien flavonolipitoisuutta lituruoholla, ja typen puutos lisäsi lehtien flavonolipitoisuutta lituruoholla ja tomaatilla (Stewart ym. 2001). Lisäksi Cartelat ym. (2005) havaitsivat, että typen lisäys kasvualustaan lisäsi klorofyllin ja vähensi polyfenolien määrää vehnällä (Triticum aestivum). Tämä toistui kolmena mittausvuonna vehnän kaikilla kehitysasteilla. (Cartelat ym. 2005). Antosyaanien määrän nousu typen puutteessa on havaittu myös laboratoriokokeessa greippisolujen liuosviljelmässä (Dedaldechamp ym. 1995). Fenyylipropanoideilla ja niiden johdannaisilla, kuten antosyaaneilla ja flavonoleilla, on yhteinen esiaste, L-fenyylialaniini, kasvin kasvuun tarvittavien proteiinien kanssa. Antosyaanien ja flavonolien synteesi siis kilpailee kasvuun tarvittavien proteiinien kanssa samasta biosynteesireitistä ja siksi antosyaanien ja flavonolien määrä nousee kasvin kasvun vähetessä (Haukioja ym. 1998). Jones ja Hartley (1998) esittelivät kyseisen ilmiön ”proteiinikilpailumallina” (Protein competition model). Puuvartiset kasvit kuitenkin tuottavat ravinnepuutoksissa erilaisia sekundäärisiä hiiliyhdisteitä, kuten polyfenoleja, riippuen kunkin yhdisteen biosynteesireitistä, esimerkiksi terpenoidien ja hydrolysoituvien tanniinien biosynteesireitit eivät suoraan kilpaile samoista lähtöaineista proteiinien synteesin kanssa (Haukioja ym. 1998). Kohonnutta fenolisten yhdisteiden pitoisuutta lehdessä ravinnepuutosten yhteydessä selitetään myös hiiliravinne -tasapainon hypoteesilla (Carbon Nutrient Balance) (Koricheva ym. 1998) sekä kasvun erilaistumisen hypoteesilla (Growth Differentation Balance) (Koricheva ym. 1998). Näiden teorioiden mukaan typensaannin ollessa alhaista kasville jää ylimääräiseksi yhteyttämisessä

sidottua hiiltä jonka se käyttää (allokoi) fenolisten yhdisteiden synteesiin. Hiili-ravinne -tasapainon hypoteesia on kuitenkin kritisoitu voimakkaasti, sillä se ennustaa puolustuskemikaalien synteesiä liian suoraviivaisesti, eikä huomioi esimerkiksi genotyypin vaikutusta (Hamilton ym. 2001).

2.4.2 Antosyaanien muut tehtävät kasvin puolustusjärjestelmässä

Kasvien ja hyönteisten välisessä vuorovaikutuksessa antosyaanit ja flavonolit houkuttelevat pölyttäjiä kukkiin väreillään, mutta toisaalta ne voivat myös suojata kasvia sitä vahingoittavilta hyönteisiltä. Antosyaanien avulla kasvi voi naamioitua vanhoiksi, kuivuneiksi lehdiksi (mimicry) tai lehtien värikkyys viestittää kasvinsyöjähyönteisille, että lehdet ovat hyvin puolustettuja (Lev-Yadun ja Gould, 2008). Antosyaanien tuottaminen esimerkiksi ravinnepuutoksessa voi siis suojata kasvia herbivorialta. Tämä kompensoi ravinnepuutoksen takia heikentynyttä kykyä tuottaa klorofylliä, sillä vähäisemmän herbivorian takia kasville jää enemmän yhteyttävää lehtipinta-alaa (Menzies ym. 2016). Joillakin antosyaaneilla on antimikrobisia ominaisuuksia, joten ne suojaavat kasvia sienitaudeilta. (Close ja Beadle 2003).

Antosyaanien keräytyminen lehteen voimakkaassa valossa suojaa yhteyttämisen niin kutsuttuja valoreaktiota foto-oksidaatiolta ja vähentää siten epätasapainoa valon absorboinnin, hiilen sidonnan ja hiilihydraattien tuotannon välillä (Steyn ym. 2002). Jos auringon energiaa absorboituu enemmän kuin yhteyttämiseen tarvitaan, kasvi purkaa sitä lämpösäteilynä pigmenttien avulla yhteyttämiskoneiston suojelemiseksi (Demmig-Adams ja Adams, 2003). Nuorien, ei vielä täysikasvuisten, lehtien yhteyttämiskapasiteetti on vielä alhainen ja antosyaanit suojaavat niiden yhteyttämiskoneistoa liialta valolta (Close ja Beadle 2003). Myöhäiskesällä kehittyvät ja kylmissä syksyolosuhteissa kasvavat kesävihannat kasvit keräävät tyypillisesti antosyaaneja lehtiinsä syksyn seneskenssin aikana (Close ym. 2000, Close ja Beadle 2003). Erään teorian mukaan tämä suojelee yhteyttämiskoneistoa foto-oksidatiivisilta vaurioilta ja siten parantaa kasvin kykyä palauttaa ravinteita varastoon kuolevista lehdistä (Feild ym. 2001; Hoch ym. 2001 Hoch ym. 2003). Hoch ym. (2003) havaitsivat antosyaanien parantavan ravinteiden palautusta valostressin jälkeen rusoheidellä (Viburnum sargentii), pensasmustikalla (Vaccinium elliottii) ja lännenpensaskanukalla (Cornus sericea) verrattuna geenimuunneltuihin vastaavien lajien edustajiin, jotka eivät tuottaneet antosyaaneja. Toisaalta paperikoivu (Betula papyrifera) palauttaa

ravinteita tehokkaasti, vaikka se ei tuota antosyaaneja seneskenssin aikana. Paperikoivulla ja muilla lajeilla, jotka eivät tuota antosyaaneja syksyn seneskenssin aikana, on siis erilainen strategia suojata ravinteiden palautusprosessia (Hoch ym. 2003).

2.5 TYÖN TAVOITTEET

Tässä gradussa on taustalla BETUMICS-projektin siirtoistutuskokeen koeasetelma. Testattavat maat kerättiin projektin raudus- ja hieskoivun siirtoistutuskoekohteista Kolarista, Punkaharjulta ja Italian Toscanasta. Koivun taimet mikrolisättiin siirtoistutuskoekohteiden läheltä (Kuva 1). Siirtoistutuskokeen tavoitteena on tutkia pohjoisten koivulajien sopeutumista ilmastonmuutokseen. Tässä gradussa puolestaan tutkittiin siirtoistutuskohteiden maaperien vaikutusta siirrettäviin koivuihin, sillä kenttäkokeessa maaperän vaikutusta ei voida erottaa ilmaston ja muiden ympäristötekijöiden vaikutuksesta. Gradussa toteutetussa maaperäesikokeessa tutkittiin yhteensä kuutta eri maaperää, sillä kaikissa kolmessa siirtoistutuskohteessa koivujen menestymistä tutkitaan kahdella koekentällä, joiden maaperät edustavat erilaisia ravinnetasoja. Jokaisesta kolmesta koivualkuperästä tutkittiin sekä raudus- että hieskoivulta viittä eri mikrolisättyä genotyyppiä. Taimia oli yhteensä 180 ja tavoitteena oli tutkia jokaista genotyyppiä kussakin maassa (6 maata x 2 lajia x 3 alkuperää x 5 genotyyppiä = 180).

Oma työni gradun parissa sijoittui Itä-Suomen yliopiston Kuopion kampukselle, jossa tapahtuivat maaperäesikoe, mittaukset, aineiston käsittely ja tilastollinen testaus sekä kirjoitustyö. Lehtien typpipitoisuudet mitattiin Lahdessa ja en osallistunut niiden määrityksiin.

Tutkittavista raudus- ja hieskoivuista mitattiin seuraavat muuttujat: -Lehti-, varsi- ja juuribiomassa sekä taimen pituuskasvu

-Biomassan jakautuminen juurien ja verson välille eli juurimassafraktio -SLA (Spesific Leaf Area), eli lehtialaindeksi

-Pigmentit Dualex-laitteella kaksi kertaa kokeen aikana: klorofylli-, flavonoli-, antosyaani-indeksit sekä mittalaitteen niiden perusteella laskema typpi-indeksi -Lehtien typpipitoisuus kokeen lopussa

Tässä gradutyössä tavoitteena oli selvittää: (1) Miten erot maaperän ravinteisuudessa ja muissa ominaisuuksissa vaikuttavat taimien kasvuun ja fysiologiaan? (2) Riippuvatko maaperän ravinteisuuden tai muiden ominaisuuksien vaikutukset koivulajista tai niiden eri alkuperistä?

3. AINEISTO JA MENETELMÄT

3.1 TAIMIMATERIAALI JA MAAPERÄT

Kokeessa käytetyt taimet mikrolisättiin koivuista, jotka kasvoivat lähellä tulevia siirtoistutuskoepaikkoja. Kolmesta alkuperästä (Pohjois-Suomen Kittilästä, Etelä-Suomen Punkaharjulta ja Pohjois-Italiasta läntisiltä Alpeilta, Kuva 1)valittiin satunnaisesti viisi raudus- ja hieskoivua, joista mikrolisättiin taimet siirtoistutuskokeen sekä tämän gradun maaperäesikokeen tarpeisiin. Maaperäesikokeen tavoitteena oli istuttaa yksi taimi kustakin genotyypistä kuhunkin maahan eli 5 genotyyppiä kahdesta lajista kuuteen eri maahan, yhteensä 180 taimea. Osa taimista oli liian heikkokuntoisia kokeessa käytettäväksi ja joitakin oli kuollut agar-alustalle, joten kaikista genotyypeistä ei saatu jokaiseen maahan taimea. Näiden tilalla käytettiin niitä genotyyppejä, joiden taimia oli ylimäärin. Lopulliset genotyyppien määrät ovat näkyvillä tulososiossa (kts. kappale 4.3, taulukot 3 ja 4). Taimia esikasvatettiin agar-alustan jälkeen turpeella 7.4.2016 alkaen noin kuukauden ajan, sillä hyvin pienikokoisina ne eivät ehkä olisi selvinneet metsämaassa ja pienikokoisuus olisi vaikeuttanut analyysejä.

Testattavia maaperiä oli yhteensä kuusi. Kolarista, Punkaharjulta ja Italian Toscanasta oli kustakin valittu kaksi siirtoistutuskoealuetta, joista toisen maaperä oli runsasravinteisempi ja toisen vähäravinteisempi (Kuva 1). Lopulta eri sijainneista valittujen maiden välillä oli isompia eroja ravinteisuudessa kuin kunkin runsasravinteinen-vähäravinteinen -parin välillä. Esimerkiksi molemmat Toscanalaiset maaperät olivat huomattavasti ravinteisempia kuin kumpikaan Kolarin maaperistä (Taulukko 1). Silmämääräisesti Italian maat olivat savisimpia, Punkaharjun multaisimpia ja Kolarin hiekkaisimpia. Maat oli kerätty vuoden 2015 kasvukauden alussa ja säilytetty keräämisen jälkeen pakastimessa. Suomesta peräisin olevat maat valittiin aluksi kenttäkasvillisuuden perusteella, jonka jälkeen tulevaan kenttäkokeeseen soveltuvilta paikoilta tehtiin maanäytteiden ravinneanalyysit. Punkaharjulla ja Kolarissa viiden maan

ravinteisuustietojen perusteella molemmista valittiin vähä- ja runsasravinteiset koealueet. Maankäyttöoikeudet rajoittivat maiden valintaa Toscanassa ja paikat valittiin saatavilla olevista.

Kuva 1. Siirtoistutuskoepaikat, joista kokeen maat ovat peräisin, on merkitty punaisella pisteellä.

Raudus- ja hieskoivugenotyyppien alkuperät on merkitty mustalla nuolella. Kartan sininen alue osoittaa rauduskoivun levinneisyysalueen.

Molemmat italian maat olivat hyvin runsasravinteisia. Italian maista ravinteisempi (Italia 1) oli Firenzen Ugnanon kaupunginosasta, vanhalta puutarhaviljelyalueelta. Maasto on savista ja runsasheinäistä ja aluetta on lannoitettu runsaasti vuosien varrella. Vähempiravinteiseksi luokiteltu maa (Italia 2) oli läheltä Belagaioa, metsäistä ylänköä, jolla kasvaa luontaisesti pieni reliktipopulaatio rauduskoivua. Maaperä oli peräisin näiden metsiköiden ympäröimän entisen viljelysmaan ja nykyisen hevoslaitumen reunalta. Todennäköisesti tämän käyttötarkoituksensa vuoksi Belagaion typpipitoisuus on korkeampi kuin runsasravinteisemmaksi luokitellun Firenzen.

Kolari

Punkaharju

Punkaharjun runsasravinteisempi maa (Punkaharju 1) on multaisesta, vanhasta koivikosta ja Punkaharjun vähäravinteisempi maa (Punkaharju 2) hiekkaisemmasta sekametsästä. Kolarin runsasravinteisempi maa (Kolari 1) on peräisin melko hiekkaisesta, vanhasta männiköstä, ja Kolarin vähäravinteisempi maa (Kolari 2) on edellä mainittua kuivemmasta, jäkäläpeitteisestä maasta, jossa on normaalisateisena kesänä kuitenkin riittävästi kosteutta myös koivulle ja jossa kasvaa myös mäntyä.

Taulukko 1. Kokeessa käytettyjen maiden ominaisuuksia, ravinteisuustiedot sekä hiilen ja typen % -osuudet. Kunkin paikan maa 1 luokiteltiin runsasravinteisemmaksi ja 2 vähäravinteisemmaksi.

Maaperä Pintamaan maalaji

Multavuus Johtoluku pH Kalsium (Ca) Fosfori (P) Kalium (K) Magnesium (Mg) Rikki (S) Typpi (N) Hiili (C) 10xmS/cm mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l % % Italia 1 HtMr m 1,8 7,3 5100 250 210 240 8,6 0,14 45,5 Italia 2 HtMr m 2,6 7,5 21000 2,9 100 93 18,7 0,18 46,1 Punka-harju 1 HtMr rm 0,6 5,8 970 < 1,5 110 99 10,7 0,26 45,8 Punka-harju 2 HkMr rm 0,4 4,9 250 < 1,5 43 37 15 0,18 45,2 Kolari 1 HtMr vm 0,2 5,4 210 9 54 28 41,9 0,03 45,4 Kolari 2 HkMr vm 0,2 5,3 74 4,7 26 < 20 25,3 0,01 45,6 HkMr = hiekkamoreenimaa, HtMr = hietamoreenimaa, HHt = hienohieta,

3.2 KOEASETELMA

Kokeen aloituksessa esikasvatusturve huuhdottiin pois taimien juurista. Taimien varren ja pääjuuren pituus mitattiin, ja juurten tuuheus arvioitiin kolmiportaisella asteikolla. Lehtien lukumäärät laskettiin kolmessa eri kokoluokassa. Luokat määrättiin siten, että pienimpään luokkaan kuuluva lehti oli pienempi kuin mittaajan pikkusormenpää, isoimpaan luokkaan kuuluva suurempi kuin mittaajan peukalo ja keskikokoinen lehti oli kooltaan näiden kahden väliltä.

Taimet istutettiin kasvamaan koemaihin plantek-64-kennostoihin satunnaiseen järjestykseen. Jokaista maata punnittiin määrä, joka täytti kennon istutettaessa ja kuhunkin kennoon punnittiin tiettyä maata aina ennalta määritetyn painon verran. Kuvassa 2 on esimerkki plantek-kennostosta, kuva on otettu hetkeä ennen kokeen lopetusta. Kennostoja kasteltiin vesijohtovedellä lähes päivittäin. Kastelu tapahtui laittamalla laatikot noin 2 cm syvään vesiastiaan imemään vettä 1-2 tunniksi. Altakastelulla pyrittiin estämään ravinteiden huuhtoutumista ja valumista kasteluveden mukana maasta toiseen. Taimia pidettiin kokeen aluksi kasvatuskaapissa ja sitten kasvihuoneessa 13.5.2016 alkaen. Kennostoja käänneltiin ja niiden paikkoja vaihdettiin keskenään piirissä jokaisen kastelun yhteydessä. Koe oli toiminnassa 9.5. - 22.6.2016.

Kuva 2. Taimia plantek-kennostossa, Kuva otettu kokeen lopettamisen yhteydessä. Kuva: Helena

Kokeen lopussa erityisesti italialaista alkuperää olevissa taimissa havaittiin silminnähtävää lehtien kellastumista, joka saattoi olla merkki ravinteiden loppumisesta. Taimissa havaittiin myös kirvoja noin kaksi viikkoa ennen kokeen lopetusta.

3.3 PITUUSKASVUN, BIOMASSOJEN JA SLA-INDEKSIN MÄÄRITYS

Taimien pituuskasvua seurattiin kokeen aikana mittaamalla jokaisen taimen pituus viikoittain. Kokeen lopuksi mitattiin taimien loppupituus. Lehdet irrotettiin varsista ja lehtiruodit leikattiin irti. Verson osat kuivattiin paperipusseissa. Juuribiomassan määritystä varten pakastimessa säilytetyt juuripaakut pestiin ja sitten kuivatettiin. Juurien, varsien ja lehtien kuivapainot punnittiin analyysivaa´alla. Lehtien kuivapainot punnittiin sekä ilman lehtiruotia (SLA:n määritystä varten), että lehtiruotien kanssa (lehtien biomassan määritystä varten). Kokeen loppuvaiheessa, kun todennäköisesti ravinnepuutoksen takia kellastuneita lehtiä alkoi jo ilmaantua, kultakin taimelta kerättiin tippuneet lehdet erikseen talteen. Nämä lehdet kuivattiin ja niiden paino lisättiin taimien kokonaisbiomassoihin, mutta näitä lehtiä ei käytetty esimerkiksi lehtien typpipitoisuuden määrityksiin. Juurimassafraktio laskettiin jakamalla taimen kokonaisbiomassa juuribiomassalla. Taimikohtaista SLA-indeksiä (englannin kielen sanoista Spesific Leaf Area) varten lehtilavat skannattiin tuoreena ja niiden taimikohtainen pinta-ala määritettiin skannatuista kuvista LAMINA-ohjelmalla (Bylesjö ym. 2008). Taimikohtainen SLA-indeksi laskettiin jakamalla lehtien taimikohtainen yhteispinta-ala kyseisen taimen ruodittomien lehtien kuivapainolla.

Tilastollisia analyysejä varten laskettiin lehtien alkupinta-alan estimaatti kertomalla kokeen alkumittausten pienimmän, keskikokoisen ja isoimman kokoluokan lehtien lukumäärät kunkin kokoluokan lehden keskimääräisellä pinta-alalla. Kunkin kokoluokan keskimääräinen pinta-ala määritettiin loppumittausten jälkeen LAMINA-ohjelmalla (Bylesjö ym. 2008) määritetyistä lehtikohtaisista pinta-aloista. Tätä varten kaikista taimista valittiin systemaattisella otannalla 20 tainta, jotta tutkimukseen saatiin yksilöitä molemmista lajeista ja kaikista alkuperistä. Valittujen taimien lehtien pinta-alat jaoteltiin LAMINA-mittausta varten skannatuista kuvista kolmeen kokoluokkaan samoin kuin tehtiin kokeen aloituksessa ja kunkin luokan pinta-alalle laskettiin keskiarvo. Italialaisten taimien isot lehdet olivat kokeen lopussa keskimäärin selvästi isompia kuin

aloituksen suuret lehdet. Tämän virheen korjaamiseksi kaikista italialaisista taimista jätettiin isoin, suurimpaan luokkaan kuuluva lehti pois keskiarvoista.

3.4 PIGMENTTIEN MITTAUS 3.4.1 Dualexin toimintaperiaate

Dualex (Dualex scientific+TM _{Polyphenol & chlorophyll-meter) mittaa optisesti klorofyllin,} antosyaanien ja flavonolien määrää elävän kasvin lehdestä sekä laskee määrittämiensä klorofylli- ja flavonoli-indeksien suhteesta ns. typpi-indeksin. Menetelmän etuina ovat nopeus ja se, että kasvia ei tarvitse vahingoittaa mittauksen takia. Laite määrittää klorofyllin määrän mittaamalla punaisen valon transmissiota lehden läpi ja samalla määrittämällä lehden rakenteen mittaamalla lähi-infrapunavalon transmissiota (Dualex-ohjekirja, 2013).

Lehden epidermissä sijaitsevat antosyaanit absorboivat UV-A -valoa ja flavonolit vihreää valoa. Dualex määrittää antosyaanien ja flavonolien määrän mittaamalla lehden keskiosista, epidermien välistä, emittoituvaa klorofyllifluoresenssiä, jonka herätevalona käytetään antosyaanien määrityksessä vihreää valoa ja flavonolien määrityksessä UV-A-valoa. Klorofyllifluoresenssin määrä riippuu siitä, miten paljon lehden epidermissä sijaitsevat antosyaanit ovat absorboineet UV-A -valoa tai flavonolit vihreää valoa, sillä absorboidessaan UV-UV-A-valoa tai vihreää valoa flavonolit tai vastaavasti antosyaanit päästävät vain tietyn määrän valoa klorofyllin fluoresoitavaksi. Mittauksessa käytetään ensin referenssivalona punaista, jota polyfenolit eivät absorboi. Lopuksi punaisen refenssivalon aiheuttama klorofyllifuoresenssi jaetaan flavonolien määrittämiseksi UV-A- tai antosyaanien määrittämiseksi vihreän valon aiheuttamalla klorofyllifluoresenssillä (Dualex-ohjekirja, 2013).

3.4.2 Dualex-mittausten toteutus

Pigmentit mitattiin Dualex-laitteella kaksi kertaa kasvatuksen aikana: vajaan kolmen viikon kuluttua aloituksesta (27.5.–28.5.2016) ja kaksi päivää ennen lopetusta (20.6.2016). Ylintä lehteä ei mitattu (laskettiin lehdeksi, jos oli puhjennut silmusta) vaan mitattiin sen alapuolelta kolme seuraavaa lehteä. Jokaisesta lehdestä tehtiin kolme mittausta aina kun lehti oli riittävän suuri. Kaksi

mittausta tehtiin lehtilavan vasemmalta puolelta lehden ylä- ja alareunasta ja kolmas mittaus lehtilavan oikealta puolelta vasemman puolen mittausten välistä. Jos tämä ei ollut mahdollista lehden pienen koon takia, mittauksia tehtiin vain kaksi. Tällöin mittaukset olivat usein hyvin läheltä toisiaan. Jos mitattavia lehtiä oli muuten vähemmän kuin kolme, mitattiin myös ylin lehti ja 2 sitä seuraavaksi alempaa, tai mitattiin pelkästään taimen ainoa lehti. Joitakin kittiläläistä ja punkaharjulaista alkuperää olevia taimia ei pystytty mittaamaan niiden lehtien pienuuden takia. Kasvihuoneen kattoikkunoista oli levinnyt siitepölyä tutkittavien koivujen lehdille. Siitepölyn poistamiseksi lehtiä sumuteltiin vedellä ja niiden annettiin kuivua ennen mittausta. Tuloksissa ja tilastollisissa analyyseissä käytettiin koko taimelle laskettua pigmenttien keskiarvoa.

3.5 TYPPIANALYYSIT LECO-ANALYSAATTORILLA

Kokeen kuudessa eri maassa kasvaneiden raudus- ja hieskoivun lehtien typpipitoisuutta tutkittiin alkuperittäin, koivulajit erikseen. Tätä varten jokaiseen analysoitavaan typpinäytteeseen punnittiin saman verran kuivattua lehtimateriaalia jokaisen alkuperän eri genotyypeistä. Näytteet jauhettiin hienoksi morttelissa nestetypen avulla ja ne lähetettiin Lahteen analysoitavaksi LECO CNS-2000 analysaattorilla (LECO Corporation, USA).

3.6 TILASTOLLISET MENETELMÄT

Aineistojen tallennukseen käytettiin Microsoft Excel taulukkolaskentaohjelmaa ja tilastollisissa analyyseissä käytettiin IBM SPSS Statistics -ohjelmiston versiota 21. Kuva 6 piirrettiin GraphPad Prism -ohjelmistolla katkaistun y-akselin luomiseksi. Aineisto testattiin yleisellä lineaarisella mallilla (GLM). Jos muuttujat eivät olleet normaalijakautuneita, tehtiin tarvittavat muuttujamuunnokset (10-kantainen ja luonnollinen logaritmi, neliöjuuri, 1/datan arvot, 1/(k-datan arvot) (k=suurin arvo)). Varianssien homogeenisyys tarkistettiin Levenen testillä.

Genotyyppi toimi testissä satunnaisena tekijänä (random factor), kiinteinä tekijöinä (fixed factor) olivat maa, laji ja alkuperä. Riippuvina muuttujina (dependent variable) olivat kokeessa mitatut muuttujat, eli kasvumuuttujat, SLA-indeksi, pigmenttien määrät ja typpi-indeksi. Tilastomallissa

käytettiin sisäkkäisiä termejä, kuten ”Alkuperä (Laji)” ja ”Genotyyppi (Alkuperä (Laji))”. Genotyyppieroja tutkittiin alkuperän ja lajin sisällä, sillä muuten alkuperän ja lajin mahdollista vaikutusta ei pystyttäisi erottamaan genotyypin vaikutuksesta. Alkuperää tutkittiin lajin sisällä, sillä alkuperä voi vaikuttaa eri tavalla raudus- ja hieskoivuun. Alkuperän testaaminen yksinään saattaisi siis kertoa samalla lajieroista, joita ei päästäisi erottelemaan tai lajien erilaiset vaikutukset saattaisivat myös kumota toisensa ja alkuperän tilastollinen vaikutus jäisi havaitsematta.

Koetaimien koko vaihteli suuresti kokeen aloitushetkellä, minkä vuoksi kasvumuuttujia testattaessa tilastomallissa käytettiin kovariaatteina kokeen aloituksen yhteydessä mitattuja taimen koon estimaatteja. Kussakin testissä käytetyt kovariaatit valittiin laittamalla testiin ensin kaikki kovariaatit ja sitten testi tehtiin uudelleen tilastollisesti merkitsevillä kovariaateilla. Tilastollisesti ei-merkitsevät kovariaatit poistettiin tilastomallista, sillä ne eivät parantaneet sen tehokkuutta ja vähensivät vapausasteita. Tästä syystä käytetyt kovariaatit vaihtelevat testattavasta muuttujasta riippuen. SLA:ssa ja lehtien typpipitoisuuden testaamisessa ei käytetty kovariaatteja. Kovariaattien käyttö on esitetty tilastotestien tulosten yhteydessä (Taulukko 2).

4. TULOKSET

4.1 PITUUSKASVU

Kovarianssianalyysin mukaan maaperällä, alkuperällä (lajin sisällä) ja genotyypillä (lajin ja alkuperän sisällä) oli merkitsevä päävaikutus taimien pituuskasvuun (Taulukko 2). Pituuskasvu oli voimakkainta Punkaharjun runsasravinteiseksi luokitellussa maassa (Punkaharju 1), jossa kasvu oli 33 % suurempaa kuin Punkaharjun vähäravinteisessa maassa (Punkaharju 2) (Kuva 3). Pituuskasvu oli heikointa Kolarin maissa kasvaneilla taimilla ollen 42 - 47 % heikompaa kuin Punkaharjun runsasravinteisessa maassa.

Kuva 3. Kovariaattikorjatut taimien pituuskasvujen keskiarvot maaperän mukaan esitettynä (n=30). Kunkin alkuperän maa 1 luokiteltiin runsasravinteisemmaksi ja maa 2 vähäravinteisemmaksi. Eri kirjaimilla merkityt pylväät eroavat toisistaan tilastollisesti merkitsevästi Bonferronin parivertailutestin mukaan.

Molemmilla lajeilla pituuskasvu oli voimakkainta alkuperältään italialaisilla ja heikointa alkuperältään kittiläläisillä taimilla (Taulukot 3 ja 4). Rauduskoivulla alkuperältään italialaiset taimet kasvoivat 2,3 kertaa nopeammin kuin alkuperältään punkaharjulaiset taimet ja 3,6 kertaa nopeammin kuin alkuperältään kittiläläiset taimet (Taulukko 3). Hieskoivulla puolestaan alkuperältään italialaiset taimet kasvoivat 1,3 kertaa nopeammin kuin alkuperältään punkaharjulaiset ja 5 kertaa nopeammin kuin alkuperältään kittiläläiset taimet (Taulukko 4). Toisaalta pituuskasvu vaihteli hyvin voimakkaasti myös koivulajien ja alkuperien sisällä eri genotyyppien välillä (Taulukot 3 ja 4). Esimerkiksi alkuperältään italialaisten rauduskoivujen nopeakasvuisin genotyyppi ”23” kasvoi yli 2 kertaa nopeammin kuin hidaskasvuisin genotyyppi ”5”, alkuperältään punkaharjulaisten rauduskoivujen nopeakasvuisin genotyyppi ”23” kasvoi jopa 12 kertaa nopeammin kuin hidaskasvuisin genotyyppi ”25” ja alkuperältään kittiläläisten rauduskoivujen nopeakasvuisimmat genotyypit ”11 ja ”27” kasvoivat 6 kertaa nopeammin kuin genotyyppi ”7”, joka ei kasvanut yhtään (Taulukko 3). Alkuperältään italialaisten hieskoivujen nopeakasvuisin genotyyppi ”30” kasvoi 6 kertaa nopeammin kuin hidaskasvuisin genotyyppi ”27”,

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

Italia 1 Italia 2 Punkaharju 1Punkaharju 2 Kolari 1 Kolari 2

Kova ria att ikorja tt u pit uuska svu log + 1 muunnetust a da tasa ta Maaperä

a

b

_b

_b

ab

_ab

alkuperältään punkaharjulaisten hieskoivujen nopeakasvuisin genotyyppi ”18” kasvoi 3,8 kertaa nopeammin kuin hidaskasvuisin genotyyppi ”12” ja alkuperältään kittiläläisten hieskoivujen nopeakasvuisin genotyyppi ”14” kasvoi 0,4 cm samalla kun genotyyppi ”9” ei kasvanut yhtään kokeen aikana (Taulukko 4).

Taulukko 2. Kovarianssianalyysitaulukko maaperän, koivulajin, -alkuperän ja -genotyypin vaikutuksista koivuntaimien kasvumuuttujiin ja lehtien typpipitoisuuteen. Alkuperän vaikutus testattiin koivulajin sisällä ja genotyypin vaikutus sekä alkuperän että koivulajin sisällä. Lehtialaindeksiä ja lehtien typpipitoisuutta lukuun ottamatta kovariaatteina käytettiin kokeen alussa mitattuja kokoestimaatteja (kts. Menetelmät, kappale 3.6)

Kokonais- biomassa Juuribiomassa Versobiomassa (varsi+lehdet) Juurimassa- fraktio Lehtiala- indeksi Pituuskasvu Lehtien typpi- pitoisuus F P F P F P F P F P F P F P Maa 4,157 0,002 4,567 0,001 3,314 0,008 0,806 0,548 4,388 0,001 5,358 0,000 19,426 0,000 Laji 0,045 0,833 0,015 0,903 0,087 0,770 0,696 0,410 0,072 0,791 1,107 0,299 5,751 0,026 Alkuperä (Laji) 4,18 0,008 3,088 0,029 4,374 0,007 0,566 0,689 1,028 0,414 7,087 0,000 39,610 0,000 Genotyyppi (Alkuperä (Laji)) 2,191 0,004 1,953 0,011 3,331 0,000 3,626 0,000 7,974 0,000 2,926 0,000 - - Maa*Laji 0,622 0,683 0,678 0,641 0,824 0,535 0,455 0,809 0,263 0,932 1,658 0,151 0,996 0,445 Maa*Alkuperä (Laji) 0,906 0,580 0,960 0,514 1,025 0,440 1,459 0,110 1,082 0,377 1,390 0,144 - - KOVARIAATIT Verson pituus 7,367 0,008 - - 12,593 0,001 6,660 0,011 - - - - Lehtipinta-ala 68,32 0,000 93,798 0,000 60,062 0,000 - - - - 6,534 0,012 - - Juuren pituus 18,82 0,000 18,559 0,000 17,239 0,000 5,343 0,023 - - - - - - Juuren tuuheus 5,664 0,019 5,083 0,026 6,470 0,012 - - - - - -

4.2 BIOMASSA

4.2.1 Juuri- ja versobiomassa

Kovarianssianalyysin mukaan maaperällä, alkuperällä (lajin sisällä) ja genotyypillä (lajin ja alkuperän sisällä) oli tilastollisesti merkitsevä päävaikutus koivuntaimien kokonais-, verso-, ja juuribiomassoihin (Taulukko 2, Kuva 4). Yleisesti ottaen verso- ja juuribiomassakertymät olivat suurimpia Punkaharju 1 maassa ja pienimpiä Kolarin maissa kasvaneilla taimilla (Kuva 4). Alkuperittäin tarkasteltuna kokonaisbiomassakertymän keskiarvot olivat molemmilla lajeilla alkuperältään italialaisilla taimilla suuremmat kuin punkaharjulaisilla, joiden kokonaisbiomassakertymät olivat puolestaan suuremmat kuin kittiläläisillä taimilla (Taulukot 3 ja 4).

Taimien versobiomassakertymä oli suurinta Punkaharju 1 maassa kasvaneilla taimilla, joilla versobiomassaa kertyi 29 % enemmän kuin biomassakertymältään pienimmillä, Kolari 2 maassa kasvaneilla taimilla. Lisäksi Punkaharju 1 maassa kasvaneiden taimien versobiomassakertymä oli 17 - 18 % suurempi kuin Punkaharju 2 ja Kolari 1 maissa kasvaneiden taimien (Kuva 4). Myös juuribiomassakertymä oli suurinta Punkaharju 1 maassa, jossa se oli 10 % suurempaa kuin juuribiomassakertymältään heikoimmissa Kolari 1 ja Kolari 2 maissa. Punkaharju 2 maassa juuribiomassakertymä puolestaan oli 5 % vähäisempää kuin Punkaharju 1 maassa (Kuva 4).

Kuva 4. Kovariaattikorjatut juuri- ja versobiomassojen keskiarvot maaperän mukaan esitettynä (n=30). Virhepalkeissa keskiarvon keskivirhe. Versobiomassa=varren + lehtien biomassa. Kunkin alkuperän maa 1 luokiteltiin runsasravinteisemmaksi ja maa 2 vähäravinteisemmaksi. Eri kirjaimilla merkityt pylväät eroavat toisistaan tilastollisesti merkitsevästi Bonferronin parivertailutestin mukaan.

Alkuperältään italialaisten rauduskoivun taimien keskimääräinen kokonaisbiomassa oli 1,3 kertaa suurempi kuin punkaharjulaisten ja 2,6 kertaa suurempi kuin kittiläläisten rauduskoivun taimien (Taulukko 3). Hieskoivulla erot olivat samantyyppisiä: Alkuperältään italialaisten hieskoivun taimien kokonaisbiomassa oli 1,4 kertaa suurempi kuin punkaharjulaisten ja 2,1 kertaa suurempi kuin kittiläläisten hieskoivun taimien (Taulukko 4).

Biomassakertymissä oli eroja myös genotyyppien välillä (alkuperän ja lajin sisällä). Esimerkiksi alkuperältään italialaisilla rauduskoivuilla ero kokonaisbiomassakertymältään suurimman ja pienimmän genotyypin välillä oli 2,3-kertainen, punkaharjulaisilla 3-kertainen ja kittiläläisillä rauduskoivuilla 8,9-kertainen (Taulukko 3). Alkuperältään italialaisilla hieskoivuilla vastaava ero kokonaisbiomassakertymältään suurimman ja pienimmän genotyypin välillä oli 2,5-kertainen, punkaharjulaisilla 2-kertainen ja kittiläläisillä hieskoivuilla 16-kertainen (Taulukko 4).

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2

Italia 1 Italia 2 Punkaharju 1 Punkaharju 2 Kolari 1 Kolari 2

Kova ria att ikorja tt u biom assa log + 1 muunnetust a a ineist osta Maaperä Versobiomassa Juuribiomassa

a

b b

a

b

bc

bc

ab

ab

ab

abc

abc

4.2.2 Juurimassafraktio

Kovarianssianalyysin mukaan maaperä, koivulaji tai -alkuperä ei vaikuttanut taimien juurimassafraktioon eli biomassan jakautumiseen verson ja juurien välillä (Taulukko 2). Genotyypillä (koivulajin ja alkuperän sisällä) puolestaan oli päävaikutus juurimassafraktioon (Taulukko 2). Alkuperältään italialaisten rauduskoivujen ero genotyyppien pienimmän ja suurimman juurimassafraktion arvon välillä oli 1,3-kertainen, punkaharjulaisten 1,4-kertainen ja kittiläläisten 1,2-kertainen (Taulukko 3). Alkuperältään italialaisten hieskoivujen vastaava ero genotyyppien pienimmän ja suurimman juurimassafraktion arvon välillä oli 1,1-kertainen, punkaharjulaisten 1,1-kertainen ja kittiläläisten 1,2-kertainen (Taulukko 4).

4.3 LEHTIALAINDEKSI

Varianssianalyysin mukaan maaperällä oli päävaikutus taimien lehtialaindeksiin (SLA) (Taulukko 2). Päävaikutus johtui siitä, että Punkaharjun runsasravinteisessa maassa (Punkaharju 1) kasvaneiden taimien indeksi oli 5 % suurempi kuin Kolari 2-maan taimilla, joilla SLA-indeksi oli pienin (Kuva 5). Myös genotyypillä (koivulajin ja alkuperän sisällä) oli päävaikutus lehtialaindeksiin (Taulukko 2). Esimerkiksi ero alkuperältään italialaisten rauduskoivugenotyyppien pienimmän ja suurimman SLA-indeksin välilä oli 1,3-kertainen, punkaharjulaisten 1,1-kertainen ja kittiläläisten 1,2-kertainen (Taulukko 3). Alkuperältään italialaisten hieskoivujen vastaava ero genotyyppien pienimmän ja suurimman SLA-indeksi välillä oli 1,1-kertainen, punkaharjulaisten 1,1-kertainen ja kittiläläisten 1,2-kertainen (Taulukko 4).

Kuva 5. Koivun taimien SLA- indeksit keskiarvoina maaperän mukaan (n=30). Virhepalkeissa keskiarvon keskivirhe. Kunkin alkuperän maa 1 luokiteltiin runsasravinteisemmaksi ja maa 2 vähäravinteisemmaksi. Eri kirjaimilla merkityt pylväät eroavat toisistaan tilastollisesti merkitsevästi Bonferronin parivertailutestin mukaan.

ryhmiteltynä Alku- perä Genotyyppi N Kokonaisbiomassa (mg) Juuribiomassa (mg) Versobiomassa (mg) Juurimassafraktio Pituuskasvu (cm) SLA (cm2_/g) Italia 5 9 477,7 ± 46,7 221,6 ± 20,7 256,2 ± 27,0 0,47 ± 0,01 1,2 ± 0,2 136,2 ± 2,8 22 6 869,8 ± 88,4 425,9 ± 47,9 443,9 ± 43,7 0,49 ± 0,02 2,1 ± 0,3 132,0 ± 2,3 23 6 669 ± 103,9 299,6 ± 56,5 369,4 ± 48,1 0,44 ± 0,01 2,6 ± 0,2 145,0 ± 2,5 25 6 561,7 ± 72,9 255,3 ± 34,8 306,4 ± 41,7 0,46 ± 0,02 1,8 ± 0,2 140,3 ± 3,6 28 7 375,1 ± 49,4 177 ± 25,8 198,2 ± 24,4 0,47 ± 0,02 1,7 ± 0,3 171,8 ± 2,6 Keskiarvo 33 574,4 ±29,1 268,2 ±14,6 306,2 ± 14,7 0,46 ± 0,003 1,8 ± 0,1 145,1 ± 0,7 Punka- harju 14 5 198,4 ± 53,8 67,6 ± 16,5 130,7 ± 37,9 0,37 ± 0,03 0,9 ± 0,3 148,8 ± 6,4 17 7 401,3 ± 37,2 211,0 ± 16,9 190,3 ± 20,9 0,53 ± 0,01 0,6 ± 0,2 142,9 ± 3,9 18 7 416,3 ± 81,9 221,7 ± 47,4 194,6 ± 37,6 0,51 ± 0,03 0,9 ± 0,3 149,3 ± 2,8 25 6 517,1 ± 38,8 267,9 ± 21,0 249,3 ± 23,3 0,52 ± 0,02 0,1 ± 0,5 132,9 ± 1,2 30 9 599,8 ± 63,2 265,8 ± 31,7 334,1 ± 33,5 0,44 ± 0,01 1,2 ± 0,2 137,6 ± 1,8 Keskiarvo 34 447,5 ± 23,1 216,7 ± 12,6 230,9 ± 11,7 0,47 ± 0,01 0,8 ± 0,1 141,9 ±1,1 Kittilä 7 2 23,5 ± 1,5 11,7 ± 2,3 11,8 ± 0,8 0,49 ± 0,07 - 0,1 ± 0,1 8 6 175,7 ± 35,7 104,0 ± 22,2 71,8 ± 13,9 0,58 ± 0,02 0,5 ± 0,3 143,8 ± 4,1 11 7 281,3 ± 68,4 151,8 ± 40,0 129,5 ± 28,7 0,52 ± 0,02 0,6 ± 0,2 137,9 ± 3,2 12 1 31,8 15,3 16,5 0,48 0,1 147,8 27 7 277,6 ± 49,6 163,5 ± 31,1 114,1 ± 20,8 0,58 ± 0,02 0,6 ± 0,2 162,5 ± 6,4 Keskiarvo 23 219,4 ± 24,1 124,8 ± 13,9 94,6 ± 10,3 0,55 ± 0,02 0,5 ± 0,06 148,3 ±1,9

Taulukko 4. Hieskoivun taimien eri genotyyppien kasvumuuttujien keskiarvot ja keskiarvon keskivirheet koivualkuperien mukaan ryhmiteltynä Alku-perä Genotyyppi N Kokonaisbiomassa (mg) Juuribiomassa (mg) Versobiomassa (mg) Juurimassafraktio Pituuskasvu (cm) SLA (cm2_/g) Italia 15 8 1077,5 ± 82,9 471,4 ± 39,5 606,1 ± 45,4 0,44 ± 0,01 1,1 ± 0,1 142,4 ± 1,9 27 7 423,9 ± 65,1 223,2 ± 32,0 200,7 ± 33,9 0,53 ± 0,01 0,3 ± 0,1 148,5 ± 3,8 28 7 871,7 ± 72,9 468,7 ± 41,5 403,1 ± 38,1 0,54 ± 0,02 0,7 ± 0,1 151,7 ± 2,0 29 6 699,1 ± 77,9 322,8 ± 35,7 376,2 ± 43,0 0,46 ± 0,01 1,6 ± 0,5 151,3 ± 2,9 30 6 658,6 ± 24,6 306,2 ± 11,8 352,4 ± 16,6 0,47 ± 0,01 1,8 ± 0,5 148,8 ± 2,1 Keskiarvo 34 759,9 ± 37,5 364,4 ± 16,6 395,5 ± 22,2 0,49 ± 0,01 1,0 ± 0,09 148,3 ± 0,6 Punka- harju 12 7 437,8 ± 67,0 211,9 ± 30,3 225,9 ± 40,8 0,49 ± 0,03 0,4 ± 0,2 150,1 ± 2,0 16 7 703,8 ± 56,4 341,6 ± 32,4 362,2 ± 25,8 0,48 ± 0,01 0,9 ± 0,2 159,0 ± 2,3 18 6 614,2 ± 60,2 308,7 ± 43,4 305,5 ± 18,0 0,49 ± 0,02 1,5 ± 0,2 151,7 ± 1,4 29 7 535,0 ± 102,5 241,6 ± 44,0 293,4 ± 59,1 0,46 ± 0,01 0,8 ± 0,3 147,7 ± 2,0 30 6 352,4 ± 82,2 160,6 ± 33,3 191,8 ± 49,3 0,47 ± 0,02 0,7 ± 0,3 153,7 ± 4,8 Keskiarvo 33 531,4 ± 21,7 254,0 ± 11,4 277,4 ± 10,5 0,48 ± 0,002 0,8 ± 0,1 152,4 ± 0,7 Kittilä 1 9 502,4 ± 57,6 228,8 ± 26,2 273,6 ± 33,2 0,46 ± 0,01 0,3 ± 0,1 147,4 ± 2,0 9 1 31,4 18,5 12,9 0,59 0,0 14 1 49,2 22,5 26,7 0,46 0,4 119,1 18 11 302,7 ± 54,5 178,5 ± 30,5 124,2 ± 24,6 0,61 ± 0,02 0,2 ± 0,1 131,4 ± 3,5 Keskiarvo 22 360,5 ± 43,5 184,7 ± 20,9 175,8 ± 23,3 0,54 ± 0,02 0,2 ± 0,03 137,7 ± 2,6

4.4 LEHTIEN TYPPIPITOISUUS

Maaperällä, koivulajilla ja alkuperällä (koivulajin sisällä) oli varianssianalyysin mukaan päävaikutus kokeen lopussa kuivatuista lehtinäytteistä analysoituihin typpipitoisuuksiin, mutta maalla ja lajilla ei havaittu yhdysvaikutusta (Taulukko 2). Genotyyppieroja ei tarkasteltu, sillä genotyypit oli yhdistetty näytteisiin lajeittain ja alkuperittäin. Yleisesti ottaen lehden typpipitoisuus oli korkein Italia 2 maassa kasvaneilla ja matalin Kolarin maissa kasvaneilla taimilla (Kuva 6). Alkuperittäin tarkasteltuna lehtien typpipitoisuuden keskiarvo oli molemmilla lajeilla alkuperältään kittiläläisillä taimilla suurempi kuin punkaharjulaisilla ja italialaisilla (Taulukot 3 ja 4) ja lajeittain tarkasteltuna rauduskoivun lehden typpipitoisuus oli hieman suurempi kuin hieskoivun punkaharjulaisilla ja kittiläläisillä taimilla (Kuva 7).

Italia 2 maassa kasvaneiden koivujen lehtien typpipitoisuus oli suurin: 0,98 % kuivapainosta (Kuva 6). Italia 2 maan typpipitoisuus oli kaikista korkein, vaikka se luokiteltiin muiden ravinteiden perusteella Italian maista vähäravinteisemmaksi (Taulukko 1). Lehtien typpipitoisuus oli seuraavaksi korkein Punkaharjun maissa 1 ja 2 kasvaneilla taimilla, eli noin 0,80 % lehtien kuiva-aineesta. Matalimmat N-pitoisuudet olivat Kolarin maissa kasvaneilla taimilla, eli 0,66 % lehtien kuiva-aineesta. Kolarin 1 ja 2 sekä Italia 1 maissa lehtien typpipitoisuus oli merkitsevästi pienempi kuin Punkaharju 1 ja 2 sekä Italia 2 maissa (Kuva 6).

Kuva 6. Raudus- ja hieskoivun taimien lehtien typpipitoisuuksien keskiarvot maaperän mukaan jaoteltuna (n=6). Arvot ovat keskiarvoja ± keskivirhe. Kunkin alkuperän maa 1 luokiteltiin runsasravinteisemmaksi ja maa 2 vähäravinteisemmaksi. Eri kirjaimilla merkityt pylväät eroavat toisistaan tilastollisesti merkitsevästi Bonferronin parivertailutestin mukaan.

Lajin tilastollinen merkitys lehtien typpipitoisuuteen varianssianalyysin mukaan ilmeni siten, että punkaharjulaisten ja kittiläläisten rauduskoivun lehtien typpipitoisuus 7 - 12 % korkeampi kuin vastaavien alkuperien hieskoivun lehtien (Kuva 7, Taulukko 2). Myös alkuperällä oli päävaikutus lehtien typpipitoisuuksiin. Esimerkiksi alkuperältään kittiläläisten rauduskoivujen lehtien typpipitoisuus oli 30 % suurempi kuin Italialaisten tai punkaharjulaisten. Rauduskoivun tavoin hieskoivulla lehtien typpipitoisuus oli suurin kittiläläisillä koivualkuperillä, joiden typpipitoisuus oli 26 % suurempi kuin punkaharjulaisten ja 20 % suurempi kuin italialaisten (Taulukko 2, Kuva 7). Alkuperä- ja lajieroja ei tutkittu erikseen post hoc- testeillä.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Italia 1 Italia 2 Punkaharju 1 Punkaharju 2 Kolari 1 Kolari 2

L ehti en ku iv a-ainee n ty ppipi toi suus (%) Maaperä

b

a

b

c

c

c

Kuva 7. Italialaisten, Punkaharjulaisten ja Kittiläläisten alkuperien raudus- ja hieskoivun taimien lehtien typpipitoisuuden keskiarvot (n=6). Virhepalkeissa keskiarvon keskivirhe.

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

Italia Punkaharju Kittilä

L ehtien kui va -a ine en ty ppipitoisuus ( % ) Koivun alkuperä Raudus Hies

4.5 LEHTIEN PIGMENTIT, TYPPI-INDEKSIT JA TYPPIPITOISUUDET 4.5.1 Klorofylli-indeksi

Varianssianalyysin mukaan maa ja genotyyppi (alkuperän ja lajin sisällä) vaikuttivat klorofylli-indeksiin molemmilla mittauskerroilla (Taulukko 5). Toisella mittauskerralla myös alkuperällä (lajin sisällä) oli tilastollisesti merkitsevä päävaikutus (Taulukko 5). Alkuperän vaikutus näkyy erityisen korkeina klorofylli-indekseinä joillakin kittiläläisillä raudus- ja hieskoivugenotyypeillä (Kuva 9).

Klorofylli-indeksien keskiarvo oli ensimmäisellä mittauskerralla 14,67 (Kuva 8 a) ja toisella mittauskerralla 11,68 (Kuva 8 b). Molemmilla mittauskerroilla klorofylli-indeksi oli pienin Kolari 1 maassa kasvaneilla taimilla (Kuva 8 a ja b). Bonferronin parivertailutestin mukaan tämä on ensimmäisellä mittauskerralla ainoana syynä maan päävaikutukseen, jolloin Kolari 1 maassa kasvaneilla taimilla oli 12 - 19 % vähemmän klorofylliä lehdissään kuin muissa maissa kasvaneilla taimilla (Kuva 8 a). Toisella mittauskerralla klorofylli-indeksi oli korkein Italia 2 maassa kasvaneilla taimilla ollen samalla 24 - 28 % korkeampi kuin pienimmät, Kolari 1 ja Kolari 2 maissa kasvaneiden taimien klorofylli-indeksit (Kuva 8 b).

Kuva 8. Raudus- ja hieskoivun taimien klorofylli-indeksien keskiarvot a) Ensimmäinen mittaus = M1 (vajaa 3 viikkoa kokeen aloituksesta). b) Toinen mittaus = M2 (6 viikkoa kokeen aloituksesta). Virhepalkeissa keskiarvon keskivirheet. n=27-18. Eri kirjaimilla merkityt pylväät eroavat toisistaan tilastollisesti merkitsevästi Bonferronin parivertailutestin mukaan.

Alkuperältään kittiläläisten rauduskoivun taimien keskimääräinen klorofylli-indeksi oli 1,61 kertaa suurempi kuin italialaisten ja 1,51 kertaa suurempi kuin punkaharjulaisten (Taulukko 6). Alkuperältään kittiläläisten hieskoivun taimien keskimääräinen klorofylli-indeksi oli 1,60 kertaa suurempi kuin punkaharjulaisten ja 1,41 kertaa suurempi kuin italialaisten (Taulukko 7). Klorofylli-indekseissä oli eroja myös genotyyppien välillä (alkuperän ja lajin sisällä) (Taulukko 5). Joillakin kittiläläisillä raudus- ja hieskoivugenotyypeillä oli erityisen korkeita klorofylli-indeksejä (Kuva 9 a ja b). Esimerkiksi toisella mittauskerralla alkuperältään kittiläläisten rauduskoivujen suurin klorofylli-indeksi genotyypillä ”8” oli 1,57 kertaa suurempi kuin pienin Kittilän rauduskoivujen klorofylli-indeksi genotyypillä ”11” (Taulukko 6). Alkuperältään kittiläläisten hieskoivujen klorofylli-indeksi genotyypillä ”18” oli noin kaksi kertaa suurempi kuin genotyypillä ”1” (Taulukko 7). Toisella mittauskerralla ero alkuperältään italialaisten genotyyppien pienimmän ja suurimman klorofylli-indeksin välillä oli 1,26 kertainen ja punkaharjulaisten 1,14 kertainen (Taulukko 6). Alkuperältään italialaisten hieskoivujen vastaava ero genotyyppien pienimmän ja suurimman klorofylli-indeksin välillä oli 1,35 kertainen ja punkaharjulaisten 1,07 kertainen (Taulukko 7). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Kloro fy ll i-indeksi M 1 Maaperä

a)

a a a a b a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Kloro fy ll i-indeksi M2 Maaperä

b)

a b ab ab c c

Kuva 9. a) Rauduskoivun b) Hieskoivun klorofylli-indeksit toisella mittauskerralla (6 viikkoa

kokeen aloituksesta) alkuperän ja genotyypin mukaan (n = 2-9). Arvot ovat keskiarvoja, virhepalkeissa keskiarvon keskivirhe.

0 5 10 15 20 25 30 5 22 23 25 28 14 17 18 25 30 8 11 27

Italia Punkaharju Kittilä

Kloro fy ll i-indeksi Alkuperä ja genotyyppi

a)

0 5 10 15 20 25 30 15 27 28 29 30 12 16 18 29 30 1 18

Italia Punkaharju Kittilä

Klo rof yll i-indeksi Alkuperä ja genotyyppi

b)

4.5.2 Flavonoli-indeksi

Varianssianalyysin mukaan maaperällä ei ollut flavonoli-indeksiin tilastollisesti merkitsevää päävaikutusta kummallakaan mittauskerralla, mutta toisella mittauskerralla havaittiin maan ja alkuperän yhdysvaikutus. Tämä tarkoittaa, että maaperän vaikutus flavonoli-indekseihin vaihteli eri alkuperien välillä (Taulukko 5). Ensimmäisellä mittauskerralla vain koivun genotyyppi (lajin ja alkuperän sisällä) vaikutti flavonoli-indekseihin, mutta toisella mittauskerralla myös koivualkuperien väliset erot olivat tilastollisesti merkitseviä (Taulukko 5). Toisella mittauskerralla Italian alkuperän rauduskoivun taimien keskimääräinen flavonoli-indeksi oli 1,22 kertaa suurempi kuin Kittilän alkuperän ja 1,04 kertaa suurempi kuin Punkaharjun alkuperän (Taulukko 6). Hieskoivulla puolestaan Italian alkuperän taimien

Taulukko 5. Varianssianalyysitaulukko maaperän, koivulajin, -alkuperän ja -genotyypin vaikutuksista koivuntaimien lehtien pigmentteihin ja typpi-indeksiin kahdella eri mittauskerralla (3 ja 6 viikkoa kokeen aloituksesta). Alkuperän vaikutus testattiin koivulajin sisällä ja genotyypin vaikutus sekä alkuperän että koivulajin sisällä.

Klorofylli Flavonoli Antosyaani NBI F P F P F P F P

1. Mittauskerta

Maa 7,151 0,000 0,763 0,578 1,297 0,271 2,225 0,057 Laji 2,508 0,127 0,59 0,447 3,992 0,056 0,663 0,421 Alkuperä (Laji) 2,044 0,123 1,65 0,188 2,333 0,086 1,458 0,244 Genotyyppi (Alkuperä (Laji)) 6,604 0,000 1,909 0,019 4,37 0,000 2,890 0,000

Maa*Laji 1,171 0,328 0,148 0,980 1,43 0,220 0,644 0,667 Maa*Alkuperä (Laji) 1,015 0,451 0,965 0,510 0,394 0,990 1,039 0,426 2. Mittauskerta Maa 24,084 0,000 0,396 0,850 11,393 0,000 9,797 0,000 Laji 0,647 0,430 1,897 0,182 0,110 0,743 0,044 0,835 Alkuperä (Laji) 7,066 0,001 2,852 0,049 3,400 0,027 4,020 0,014

Genotyyppi (Alkuperä (Laji)) 7,578 0,000 5,862 0,000 11,038 0,000 9,170 0,000

Maa*Laji 0,739 0,596 1,603 0,166 1,526 0,187 0,958 0,447 Maa*Alkuperä (Laji) 0,946 0,532 2,056 0,010 0,772 0,742 1,269 0,216