Pemisahan Pigmen dalam Daun dan Penetapan Kandungan Klorofil
LAPORAN PRAKTIKUM
Oleh :
Kelompok 1
1. Helti Anggiana Pratiwi (131510501064)
2. Rani Eka P (101510501121)
3. Luppy Ritma Sinthya (131510501072) 4. Wahyu Sulistyorini (131510501056)
5. Dini Fidyandini (131510501082)
6. Hendro Yuli Aziz (131510501015) 7. M. Hisyam Nasrullah (131510501061)
8. Suhendri (131510501053)
9. Ahmad Khairus Aufar (131510501077) 10.Novantara Sunu Pamungkas (131510501094) 11.Fitria Wulandari (131510501095) 12.Intan Dwi Ambarwati (131510501124)
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS JEMBER
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Proses biokimia yang tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri lakukan
untuk memproduksi energi terpakai dengan memanfaatkan energi cahaya
matahari. Daun merupakan organ terpenting pada tumbuhan yang berfungsi untuk
melakukan proses fotosintesis. Tumbuhan menangkap cahaya menggunakan
pigmen yang dinamakan klorofil. Klorofil ialah katalisator yang membantu proses
fotosintesis, yang sangat penting bagi seluruh jaringan tumbuhan yang
berfotosintesis.
Di dalam tumbuhan paling sedikit terdapat lima jenis klorofil, seluruh jenis
klorofil mengandung satu inti porifin dengan satu atom Mg terikat di tengah.
Perbedaan setiap jenis klorofil diakibatkan perbedaan dalam rantai alifatik yang
terikat pada inti porifin. Selain klorofil di dalam daun juga terdapat pigmen yang
lain seperti karotenoid dan antosianin, yang juga membantu penangkapan cahaya
dalam fotosintesis.
Untuk memisahkan pigmen yang ada dalam suatu tumbuhan dapat dilakukan
dengan beberapa cara salah satunya dengan teknik kromatografi. Kromatografi
merupakan suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan distribusi dari
penyusunan cuplikan antar dua fasa, serta perbedaan mobilitas yang disebabkan
adanya perbedaan absorpsi, partisi, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion,
kelarutan, tekanan uap. Prinsip dasar dari teknik kromatografi kertas ialah partisi
multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur.
Dengan melakukan pemisahan pigmen pada daun maka dapat mengetahui pigmen
apa yang terdapat dalam daun beserta mengetahui perbedaan warna setiap pigmen
pada daun.
Penetapan kandungan klorofil dilakukan dengan metode spektrofotometri.
Spektrofotometri ini merupakan metode penetapan jumlah klorofil dengan
menggunakan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang tertentu.
Pentingnya mengetahui jumlah klorofil yang ada dalam suatu daun adalah untuk
semakin tinggi. Selain itu, dengan mengatahuinya jumlah klorofil maka dapat
membandingkan kecepatan fotosintesis antara daun yang berklorofil sedikit
dengan daun yang berklorofil banyak.
1.2 Tujuan
1. Melihat macam pigmen yang terdapat dalam daun serta mempelajari
sifat-sifatnya.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Kumari et al. (2012) menyatakan bahwa fotosintesis merupakan
metabolisme utama tumbuhan untuk bertahan hidup. Fotosintesis adalah proses
pengubahan energi cahaya dari matahari menjadi energi kimia untuk tanaman,
mekanisme ini dilakukan oleh pigmen pada tumbuhan. Pigmen ini menyerap
panjang gelombang tertentu dari cahaya untuk melangsungkan proses fotosintesis.
Setiap tanaman mengandung pigmen yang berbeda-beda, beberapa pigmen
tersebut meliputi klorofil (berwarna hijau), karotenoid (berwarna kuning, oren
kemerahan), antosianin (merah sampai biru, tergantung pH), betalain (merah atau
kuning).
Klorofil yang digunakan untuk fotosintesis dibedakan menjadi dua. Ai dan
Banyo (2011) menyatakan bahwa tanaman tingkat tinggi mempunyai 2 macam
klorifil yaitu klorofil a yang berwana hijau tua (C55H72O5N4Mg) dan klorofil b
yang berwarna hijau muda (C55H70O6N4Mg). Klorofil a dan klorofil b serta
karotein ditemukan lebih banyak pada musim panas dibandingkan musim dingin
(Kadam et al, 2014).
Harborne (1987) menyatakan bahwa pemisahan dan pemurnian kandungan
tumbuhan seperti lipid, steroid, karotenoid, kuonin sederhana, dan klorofil dapat
menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis). Selain menggunakan
metode KLT pemisahan dapat pula dilakukan dengan metode kromatografi. Day
dan Underwood (1998) menyatakan jika suatu larutan petroleumeter dari klorofil
disaring mealui suatu kolom penyerapan, kemudian pigmen-pigmen tersebut
dipisahkan dari atas ke bawah sehingga menjadi berbagai daerah warna menurut
rangkaian adsorpsi, yang mana pigmen yang diadsorpsi lebih kuat menggantikan
yang lemah sehingga memaksanya turun ke bawah. Pemisahan selesai jika larutan
pigmen itu suatu aliran pelarut murni dilewatkan melalui kolom. Seperti suatu
spektrum sinar komponen campuran pigmen yang berbeda secara sistematis dapat
dipisahkan secara kuantitatif.
Pigmen pada daun dipengaruhi oleh beberapa faktor. Kestabilan warna dari
hilangnya glikosil pada antosianin akibat hidrolisis ikatan glikosidik. Seiring
meningkatnya derajad pemanasan maka aglikon yang dihasilkan kurang stabil dan
menyebabkan berkurangnya intensitas warna dari antosianin (Hardiyanti dkk,
2013).
Kurniawan dkk (2010) menyatakan bahwa kandungan klorofil total diukur
dengan menggunakan metode spektrofotometri dengan alat spektrofotometer pada
panjang gelombang 646 nm, dan 663 nm. Setelah didapat nilai absorbansi maka
kandungan klorofil dapat dihitung menggunakan rumus :
Klorofil a = 12,21 A663 + 2,81 A646 mg/l
Klorofil b = 20,13 A646 + 5,03 A633 mg/l
Klorofil total = 17,3 A646 + 7,18 A663 mg/l (Harborne, 1987)
Setelah penetapan kandungan klorofil dapat disimpulkan (Setiari dan
Nurchayati, 2009) semakin tinggi kandungan klorofil maka dapat dikatakan
semakin tua umur tanaman. Selain umur tanaman, umur daun, tahapan fisiologis,
morfologi daun serta faktor genetik juga mempengaruhi jumlah klorofil. Sevik et
al. (2012) menyatakan bahwa jenis tanaman dan posisi daun akan mempengaruhi
jumlah klorofil yang ada dalam daun. Daun yang mendapatkan cahaya matahari
secara langsung dan daun yang tidak mendapatkan cahaya langsung (ternaung)
memiliki struktur internal dan eksternal yang berbeda, pada keadaan cahaya yang
lebih luas jaringan daun akan memberikan kekuatan pada tanaman agar tumbuh
subur dan jumlah klorofilnya sedikit tetapi jika daun berukuran besar maka jumlah
klorofil terlalu banyak. Penurunan kadar klorofil dipengaruhi oleh beberapa
faktor. Zhani et al. (2012) menyatakan bahwa penurunan kandungan klorofil yang
disebabkan stress garam adalah fenomena yang umum terjadi, hal ini
BAB 3. METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Pemisahan Pigmen dalam Daun dan Penetapan Kandungan
Klorofil dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Jurusan Agronomi Fakultas
Pertanian Universitas Jember pada hari Kamis tanggal 25 September 2014.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
1. Mortir dan stamper
2. Neraca Analitis
3. Kuvet
4. Corong Pemisah
5. Gelas Ukur
6. Labu Ukur
7. Spektrofotometer
3.2.2 Bahan
1. Daun tanaman
2. CaCO3
3. Aseton
4. Aquadest
5. Petroleum eter
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Pemisahan Pigmen
1. Menimbang 1 gram daun tanaman yang telah ditentukan
2. Menumbuk/menghaluskan daun dengan mortar dan stamper serta diberi
sedikit CaCO3
3. Menambahkan 20 cc aseton. Menyaring larutan aseton yang berwarna hijau
4. Menyiapkan corong pemisah dan mengisi dengan 10-25 cc petroleum eter
dan meletakkan berdiri
5. Mengisikan 10-15 cc larutan aseton dalam corong pemisah dan mencampur
secara perlahan-lahan. Menunggu hingga terjadi perubahan warna.
6. Memisahkan kedua warna yang terbentuk ke dalam tabung yang berbeda.
3.3.2 Penentuan Kadar Klorofil
1. Memotong daun segar menjadi potongan kecil-kecil dan memasukkan 0,5
gram jaringan segar tersebut ke dalam mortar.
2. Menghancurkan menggunakan stamper sampai halus. Menambahkan aseton
80% secukupnya sehingga jaringan dapat menjadi homogen.
3. Mengaduk-aduk jaringan itu, kemudian mendekantasikan supernatant
(pindahkan ekstraknya), dengan menyaring terlebih dahulu menggunakan
kertas saring ke dalam labu ukur 100 ml.
4. Menambahkan aseton 80% ke dalam labu ukur sampai volume 50 ml.
5. Mengambil 5 ml larutan tersebut ke dalam labu ukur 50 ml dan
mengencerkan dengan aseton 80% sampai volume 50 ml.
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Kel. Daun Pigmen
Antosianin Klorofil A Klorofil B Xantophyt Karoten
1. Acalipa
Hijau - + + - -
2. Acalipa
Hijau - + + - -
3. Acalipa
Merah + - + - -
4. Acalipa
Merah + - + - -
4.2 Pembahasan
Dari data yang diperoleh pada daun Acapila hijau mempunyai pigmen
klorofil a dan klorofil b. Sementara daun Acapila merah selain memiliki pigmen
klorofil b juga memiliki pigmen antosianin. Perbedaan kandungan pigmen ini
disebabkan warna pada daun yang berbeda. Acalipa merah memiliki pigmen yang
lebih kompleks daripada Acapila hijau, hal ini disebabkan warna daun pada
Acalipa merah yang lebih beragam. Keberagaman warna pada Acalipa merah ini
menunjukkan Acapila merah lebih memiliki daya tangkap cahaya lebih baik dan
memiliki perlindungan yang lebih baik terhadap kondisi lingkungan jika
dibandingkan dengan Acapila hijau. Kisman dkk (2007) menyatakan bahwa selain
berfungsi sebagai pembantu dalam proses fotosintesis, pigmen antosianin pada
Acapila merah juga memiliki fungsi untuk mempertahankan dan melindungi
tanaman terhadap kondisi lingkungan yang kurang baik seperti cekaman dingin,
kekeringan, dan intensitas cahaya yang rendah.
Pada daun Acapila hijau cenderung berwarna hijau tua, yang mengandung
antena periperal kloroplas, yang memiliki respon terhadap kondisi cahaya yang
diterima sebagai bentuk dan mekanisasi adaptasi tanaman. Klorofil a dan b pada
daun Acapila hijau berperan dalam proses fotosintesis. Klorofil b berfungsi
sebagai antena yang mengumpulkan cahaya untuk yang akan ditransfer ke pusat
reaksi, yang mana pusat reaksi adalah klorofil a untuk digunakan pada proses
fotosintesis.
Pada tanaman tingkat tinggi pigmen atau zat warna pada umumnya terdapat
di dalam sel-sel jaringan meristem yang dalam perkembangannya akan
membentuk kloroplas ataupun kromoplas. Pigmen pada tumbuhan meliputi
klorofil, antosianin, dan karotenoid, karotenoid sendiri masih dibedakan menjadi
dua yakni karoten dan xantofil. Klorofil merupakan zat warna utama pada
tumbuhan. Klorofil memiliki sifat tidak larut dalam air tetapi larut dalam etanol,
methanol, eter, aseton, bensol dan kloroform. Selain itu klorofil bersifat
fluorescence, fluorescense yakni apabila mendapatkan penyinaran dengan
spektrum cahaya tertentu maka cahaya yang diteruskannya adalah cahaya pada
spektrum yang berlainan. Sebuah warna dihasilkan karena kemampuan ikatan
kimia suatu pigmen untuk menyeleksi gelombang cahaya yang diserap dan
dipantulkan. Pada klorofil a berwarna hijau kebiruan namun cahaya yang diserap
adalah biru, violet dan merah sedangkan pada klorofil b berwarna hijau
cerah/kekuningan sebenarnya cahaya yang diserap adalah biru dan oranye.
Antosianin merupakan suatu glikosida bersifat larut dalam air, dihasilkan
melalui lintasan flavonoid di dalam sitoplasma. Antosianin berfungsi memikat
serangga untuk penyerbukan, penyebaran biji, anti oksidan dan melindungi dari
kondisi yang tidak menguntungkan. Antosianin akan berwarna merah jika berada
di lingkungan asam, berwarna biru di lingkungan basa dan jika berada di
lingkungan netral akan berwarna ungu.
Pigmen karotenoid terdiri atas dua golongan, yakni karoten dan xantofil.
Karoten merupakan suatu persenyawaan hidrokarbon yang mempunyai rumus
kimia C40H56, umumnya karoten menyebabkan warna jingga pada tanaman serta
dengan rumus kimia C40H56(OH)2. Pada pematangan buah jumlah xantofil akan
menurun sebaliknya karoten akan meningkat.
Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi pembentukan klorofil pada
tanaman, diantaranya faktor pembawa, cahaya, oksigen, karbohidrat, air,
temperatur, dan juga unsur-unsur Mn, Cu, dan Zn. Pigmen dibawa oleh gen
tertentu di dalam kromosom, jika gen ini tidak terdapat pada tumbuhan maka
tumbuhan akan mengalami albino. Cahaya mempengaruhi pembentukan klorofil,
jika cahaya yang diterima terlalu banyak ataupun terlalu sedikit akan berpengaruh
buruk pada klorofil. Kecambah yang ditumbuhkan pada kondisi gelap kemudian
ditempatkan pada kondisi terang tidak akan membentuk klorofil jika oksigen tidak
tersedia. Pada tumbuhan yang beretiolasi karbohidrat sangat membantu proses
pembentukan klorofil, daun tidak akan menghasilkan klorofil jika tidak adanya
karbohidrat meskipun faktor yang lain tercukupi. Air merupakan faktor yang
penting, kekurangan air akan mengakibatkan desintegrasi dari klorofil. Suhu yang
optimal sekitar 26-30°C merupakan kondisi yang baik pada pembentukan klorofil.
Unsur-unsur hara seperti Mn, Cu, dan Zn hanya dalam jumlah yang sedikit,
namun sangat membantu pada pembentukan klorofil. Jika unsur-unsur tersebut
tidak tersedia maka daun akan mengalami klorosis.
Pigmen dipengaruhi oleh beberapa aspek diantaranya struktur atau rumus
kimia, gugus pengikat, cahaya yang diserap dan absorbansi maksimum. Hal ini
ditunjukkan pada tabel 1. Dengan perbedaan rumus kimia, gugus pengikat, cahaya
yang diserap dan absorbansi maksimum maka pigmen yang dihasilkan juga akan
berbeda pula.
Tabel 1. Perbandingan pigmen klorofil a dan klorofil b
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Tanaman Acalipa hijau mengandung klorofil a dan klorofil b sedangkan
pada Acapila merah mengandung klorofil b dan antioksidan.
2. Pigmen yang ada pada tumbuhan meliputi klorofil, antosianin, karotenoid
(terdiri dari karoten dan xantofil).
3. Faktor-faktor yang mempengaruhi pembentukan klorofil faktor pembawa,
cahaya, oksigen, karbohidrat, air, temperatur, dan juga unsur-unsur Mn, Cu,
dan Zn. Sedangkan faktor yang mempengaruhi pigmen adalah struktur atau
rumus kimia, gugus pengikat, cahaya yang diserap dan absorbansi
maksimum.
5.2 Saran
Sebaiknya pengamatan dilakukan tidak hanya pada daun Acapila merah dan
hijau saja, melainkan juga pada daun-daun tanaman lain yang memiliki warna
DAFTAR PUSTAKA
Ai, N. S. dan Y. Banyo. 2011. Konsentrasi Klorofil Daun Sebagai Indikator Kekurangan Air pada Tanaman. Ilmiah Sains, 11(2) : 166-173.
Day, R. A. and A. L. Underwood. 1998. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Terjemahan oleh Sopyan, I. 2002. Jakarta : Erlangga.
Harborne, J. B. 1973. Metode Fitokimia. Terjemahan oleh Padmawinata, K. dan S. Niksolihin. 1987. Bandung : ITB.
Hardiyanti, Y., D. Darwis, dan A. Santoni. 2013. Ekstraksi dan Uji ANtioksidan Senyawa Antosianin dari Daun Miana (Coleus scutellarioides L (Benth).) serta Aplikasi pada Minuman. Kimia Unand, 2(2) : 44-50.
Kadam, V. B., S. B. Salve, M. D. Sonawane, and P. P. Ahire. 2014. Estimation of Chlorophyll Content of Some Medicinal Plants of Genus Terminalia of Marathwada region in Maharashtra. Current Trends in Pharmacentical Research, 2(5) : 634-637.
Kisman, N. Khumaida, Trikoesoemaningtyas, Sobir, dan D. Sopandie. 2011. Karakter Morfo-Fisiologi Daun, Penciri Adaptasi Kedelai terhadap Intensitas Cahaya Rendah. Bul. Agron., 35(2) : 96-102.
Kumari, S. P. K., Y. S. Vani, V. Sridevi, and M. V. V. C. Lakshmi. 2012. Separation and Observation of Plant Pigments in Fertilizer Effected Medicinal Plants Using Paper Chromatography. Engineering Science and Advanced Technology, 2(2) : 317-326.
Kurniawan, M., M. Izzati, dan Y. Nurchayati. 2010. Kandungan Klorofil, Karotenoid, dan Vitamin C pada Beberapa Spesies Tumbuhan Akuatik. Buletin Anatomi dan Fisiologi, 18(1) : 28-40.
Setiari, N. dan Y. Nurchayati. 2009. Eksplorasi Kandungan Klorofil pada Beberapa Sayuran Hijau sebagai Alternatif Bahan Dasar Food Supplement. Bioma, 11(1) : 6-10.
Sevik, H., D. Guney, H. Karakas, and G. Aktar. 2012. Change to Amount of Chlorophyll on Leaves Depend on Insolation in Some Landscape Plants. Environmental Sciences, 3(3) : 1057-1064.
