Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase

LAPORAN TERBAIK

PRAKTIKUM BIOKIMIA

AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE

Disusun Oleh :

1 Istiana Sulisminawati 24030110120011

2 Zasrie Putri Oktaviani 24030110141009

3 Nor Sri Inayati 24030110141020

4 Galih Purbo Utomo 24030110141026

5 Fitria Kusumawati 24030110141034

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG 2013

ABSTRAK

Telah dilakukan percobaan “Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase” yang bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal. Prinsip percobaan ini adalah kemampuan enzim α-amilase untuk membentuk 1 mg glukosa/satuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan pH tertentu, dan penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase yang berdasarkan pada unit aktivitas enzim α-amilase/mg protein. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah nelson-soumogyi, lowry, dan spektrofotometri. Hasil yang diperoleh adalah Hasil yang diperoleh adalah enzim yang lebih murni. Kadar glukosa pada sampel adalah 6,032unit pada ekstrak kasar, 0,1257unit pada fraksi I dan 0,0851unit pada fraksi II. Dengan nilai absorbansi pada ekstark kasar 0,207, pada fraksi I 0,055,dan pada fraksi II 0,0851. Kadar protein pada sampel yaitu pada ekstrak kasar sebesar 2,57075mg/mL, pada fraksi I 5,0995mg/mL,dan pada fraksi II sebesar 4,767mg/mL. Dengan nilai absorbansinya adalah 0,293 pada ekstrak kasar, 0,582 pada fraksi I dan 0,544pada fraksi II. Sedangkan aktivitas spesifik enzim alpha amilase yaitu pada ekstrak kasar sebesar 2,346unit/mg protein, pada fraksi I sebesar 0,0246unit/mg protein dan fraksi II sebesar 0,0178unit/mg protein.

PERCOBAAN X

AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE

I. TUJUAN PERCOBAAN

Menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim

Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah : dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu.

K₁ K₂

K₃

Enzim + substrat Kompleks Enzim + Produk

Kesetimbangan untuk pembentuk adalah :

Km =

Dengan Es adalah kompleks enzim substrat, E adalah enzim, S adalah substrat , dan Km adalah tetapan kesetimbangan.

(Azmi, 2006) 2.2 Komponen Enzim substrat

Enzim merupakan senyawa organik berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam metabolisme tubuh, sehingga disebut juga biokatalisator.

Komponen penyusun enzim terdiri dari :

1. Apoenzim, yaitu bagian enzim aktif yang tersusun atas protein yang bersifat labil (mudah berubah) terhadap faktor lingkungan, dan

2. Kofaktor,yaitu komponen non protein yang berupa : a. Ion-ion anorganik (aktivator)

Berupa logam yang berikatan lemah dengan enzim, Fe, Ca, Mn, Zn, K, Co. Ion klorida, ion kalsium merupakan contoh ion anorganik yang membantu enzim amilase mencerna karbohidrat (amilum) b. Gugus prostetik

Berupa senyawa organik yang berikatan kuat dengan enzim, FAD (Flavin Adenin Dinucleotide), biotin, dan heme merupakan gugus prostetik yang mengandung zat besi berperan memberi kekuatan ekstra pada enzim terutama katalase, peroksidae, sitokrom oksidase. c. Koenzim

Berupa molekul organik non protein kompleks, seperti NAD (Nicotineamide Adenine Dinucleotide), koenzim-A, ATP, dan vitamin yang berperan dalam memindahkan gugus kimia, atom, atau elektron dari satu enzim ke enzim lain.

(Herliyana, 2008) 2.3 Sifat-sifat Enzim

1. Enzim adalah Protein

Sebagai protein enzim memiliki sifat seperti protein, yaitu sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, seperti suhu, pH, konsentrasi substrat). Jika lingkungannya tidak sesuai, maka enzim akan rusak atau tidak dapat bekerja dengan baik.

2. Bekerja secara khusus/spesifik

Setiap enzim memiliki sisi aktif yang sesuai hanya dengan satu jenis substrat, artinya setiap enzim hanya dapat bekerja pada satu substrat yang cocok dengan sisi aktifnya.

Meningkatkan kecepatan reaksi kimia tanpa merubah produk yang diharapkan tanpa ikut bereaksi dengan substratnya, dengan

demikian energi yang dibutuhkan untuk menguraikan suatu substrat menjadi lebih sedikit.

4. Diperlukan dalam jumlah sedikit

Reaksi enzimatis dalam metabolisme hanya membutuhkan sedikit sekali enzim untuk setiap kali reaksi.

5. Bekerja bolak-balik

Enzim tidak mempengaruhi arah reaksi, sehingga dapat bekerja dua arah (bolak-balik). Artinya enzim dapat menguraikan substrat menjadi senyawa sederhana, dan sebaliknya enzim juga dapat menyusun senyawa-senyawa menjadi senyawa tertentu.

6. Enzim bersifat khusus terhadap suatu substrat tertentu yang dapat diikat dan jenis reaksinya.

7. Kerja enzim dipengaruhi oleh lingkungan, seperti oleh suhu, pH, konsentrasi, dan lain-lain

(Deswita, 2006) 2.4 Enzim amilase

Enzim amilase dapat memecah ikatan-ikatan pada amilum hingga terbentuk maltosa. Ada tiga macam enzim amilase yaitu α-amilase, β-amilase, dan γ-amilase. Α-amilase terdapat dalam saliva (ludah) dan pancreas. Enzim ini memecah ikatan 1,4 yang terdapat dalam amilum dan disebut endo amilase sebab enzim ini memecah bagian dalam atau bagian tengah molekul amilum. Β-amilase terutama terdapat pada tumbuhan dan dinamakan ekso amilase sebab memecah dua unit glukosayang terdapat pada ujung molekul amilum secara berurutan sehingga pada akhirnya terbentuk maltose. γ-amilase telah diketahui terdapat dalam hati. Enzim ini dapat memecah ikatan 1,4 dan 1,6 pada glikogen dan menghasilkan glukosa.

Amilsse merupakan enzim yang berfungsi memecah pati atau glikogen. Senyawa ini banyak terdapat dalam hasil tanaman dan hewan. Amilase dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan enzim, yaitu :

a. α-amilase, yang memecah pati secara acak dari tengah atau dari bagian dalam molekul dan karenanya disebut endoamilase.

b. β-amilase, yang menghidrolisis unit-unit gula dari ujung molekul pati, karenanya disebut eksoamilase.

c. γ-amilase, yang dapat memisahkan glukosa dari terminal gula non pereduksi substrat pati.

(Deswita, 2006) 2.5 Enzim α-amilase

Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan atau berfungsi menghidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati. Enzim enzim alfa amilase bekerja optimum pada pH sekitar 6 dan pada suhu 60o_{C. Jika suhu ditingkatkan, pH optimum juga meningkat sampai sekitar} 7. Jika α-amilase berasal dari Bacillus licheniformis maka akan menghidrolisis pati dengan hasil utama maltoheksosa, malopentosa dengan jumlah glukosa yang lebih tinggi (8 – 10%). enzim alfa amilase mampu meningkatkan rasa manis pada ekstrak sari buah karena aktivitas enzim alfa amilase yang mampu menghidrolisis pati pada pisang menjadi gula lain yang lebih sederhana.

(Darmajana and Agustina, 2008) 2.6 Aktivitas Spesifik Enzim

Aktivitas spesifik hanya dapat digunakan untuk preparat enzim yang murni, yaitu jumlah satuan enzim per miligram enzim protein, tetapi aktivitas spesifik dapat pula ditentukan pada enzim tidak murni. Aktivitas spesifik enzim murni menunjukkan derajat kemurnian enzim dalam suatu sampel.

Bila berat molekul enzim diketahui, maka aktivitasnya dapat dinyatakan dalam bentuk aktivitas molekular adalah jumlah satuan substrat permikromol enzim. Atau dapat pula diartikan sebagai jumlah molekul substrat di ubah setiap menit oleh setiap molekul enzim. Aktivitas molekuler merupakan sifat enzim individu, jadi dapat dgunakan untuk menentukan kemurnian enzim seperti halnya aktivitas enzim.

(Azmi, 2006) 2.7 Aktivitas α-amilase

Aktivitasnya diukur dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan pengukuran derajat pewarnaan iodium terhadap substrat. Seperti telah diketahui, pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan iodium menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bila bereaksi dengan iodium akan berwarna coklat. Disamping itu, keaktifan α-amilase dapat juga dinyatakan dalam berbagai cara, misalnya dengan pegukuran viskositas dan jumlah pereduksi yang terbentuk.

Kinetika reaksi α-amilase memang agak sulit, sebab sifat hidrolisisnya beranekaragam terhadap berbagai substrat, apalagi bila hasil hidrolisis pertama ternyata menjadi substrat baru lagi enzim yang sama sampai menghasilkan maltose dan triosa. Laju hidrolisis akan meningkat bila tingkat polimerisasi menurun dan laju hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus. Hidolisa amilosa akan lebih cepat dari pada hidrolisis rantai yang bercabang. Seperti amilopektin atau glikogen.

(Bahagiawati, 2005) 2.8 Penentuan Aktivitas Enzim α-amilase

Metode yang digunakan dalam mengukur aktivitas enzim α-amilase yaitu metode spektrometri. Prosedurnya berupa penentuan produk (glukosa) dengan bantuan sinar, sesuai hukum lambert-Beer :

Dimana : T = transmitansi A = absorbansi

Є = koefisien ekstingsi molar b = tebal kuve

c = konsentrasi

Untuk menentukan banyaknya produk glukosa yang terbentuk dari reaksi enzimatis maka digunakan kurva standar glukosa. Produk dinyatakan dalam satuan unit aktivitas yang didefinisikan banyaknya mol glukosa dan reaksi enzimatis pada kondisi optimum.

(Rochima, 2005) 2.9 Klasifikasi dan struktur protein

Secara umum protein dapat dikategorikan menurut tipe tugas yang dilaksanakan yaitu :

1. Protein struktural : Terdiri atas molekul panjang, liat dan tidak larut 2. Protein globular : Bentuknya bulat dan larut dalam air.

3. Protein konfigurasi : Merupakan protein yang bersenyawa dengan zat lainL

Protein mempunyai struktur sebagai berikut:

a) Struktur primer : Struktur kerangka kovalen dan deret residu asam amino.

b) Struktur sekunder : Struktur konformasi residu asam amino dekat polipeptida.

c) Struktur tersier : Struktur protein yang rantai keeseluruhannya 3 dimensi

d) Struktur kuertener : Struktur antaraksi antara sub unit protein (Biogen,2008) 2.10 Spektrofotometer UV-VIS

Secara umum semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-VIS karena mereka mengandung elektron yang dapat tereksitasi ke tingkat energinya yang lebih tinggi. Panjang gelombang yang terjadi tergantung pada beberapa kuat elektron ini terikat pada molekul. Absorbansi larutan bertambah dengan penguraian kekuatan sinar, bila konsentrasi materi yang dilewati cahaya bertambah maka cahaya lebih banyak diserap. Jadi absorbansi berbanding lurus dengan ketebalan b dan dengan konsenttrasi c.

(Sari,2006) 2.11 Tekhnik Sentrifugasi

Tekhnik sentrifugasi adalah suatu tekhnik pemisahan berdasarkan sifat partikel dalam medan gaya sentrifugal. Partikel yang berbeda berat jenis, ukuran dan bentuknya mengendap searah dengan gaya sentrifugal dengan kecepatan berbeda. Partikel yang akan dipisahkan biasanya disuspensi dalam medium cair yang dimasukan dalam tabung sentrifugal yang dapat ditempatkan dalam rotasi yang berputar, rotor terletak pada pusat sumbu simetri.

(Bahagiawati, 2005) 2.12 Metode Nelson-Soumogyi

Penentuan aktivitas enzim α-amilase dilakukan dengan metode spektrofotometri di mana dilakukan penentuan terhadapproduk enzimnya yaitu glukosa dengan metodeNelson-Soumagyi yang prinsipnya adalah pemanasan gula dengan larutan alkali dari tembaga tartrat dan terbentuk cupri oksida.

(Azmi, 2006) 2.13 Metode Lowry

Protein dengan asam fosfotungstien-fosfomolibdat pada suasana alkali akan memberi warna biruyang intensitasnya tergantung pada konsentrasi protein. Larutan A terdiri atas fosfotungstein, fosfomolibdat. Larutan B (2% Na2CO3 dalam NH4OH 0,1 N, CuSO4 dan Na-K tartrat 2%). Cara penentuannya adalah sebagai berikut, 1 ml larutan protein ditambah

0,5 ml lowry B, digojog dan biarkan 20 menit. Selanjutnya diamati OD nya pada λ yang terpilih. Cara lowry 20 kali lebih sensitif pada cara UV atau buret.

(Azmi, 2006) Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ _{kemudian akan mereduksi} reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.

(Arie S, 2009) 2.14 Penentuan Kadar Protein

Pengukuran konsentrasi protein secara akurat menjadi sangat penting peranannya mengingat hasil penetapan ini digunakan dalam perhitungan lain, seperti penentuan aktivitas enzim. Kesalahan dalam penetapan kadar protein akan berbuntut pada kesalahan-kesalahan di perhitungan selanjutnya. Berbagai metode analisis kuantitatif telah ditawarkan dengan kelebihan maupun kelemahan masing-masing. Secara umum, metode analisis kuantitatif protein digolongkan dalam:

• Spektrofotometri: -SpektrofotometriUV - Kolorimetri

• Volumetri:

- Metode Kjeldahl (didasarkan pada analisis Nitrogen) - Titrasi formol

Kuantifikasi protein secara kolorimetrik pada dasarnya terbagi dalam 2 golongan, yaitu berdasarkan pengikatan dengan zat warna (dye-binding) dan pembentukan kompleks dengan tembaga (copper-chelating).

Metode-metode berdasarkan pengikatan dengan zat warna meliputi:  Metode Bradford (Coomassie Blue)

 Metode Ninhydrin

 Metode Bromocresol Green  Metode Erythrosin-B

 Metode 3′,3″,5′,5″-tetrabromophenolphtalein ethyl ester (TBPEE)  Metode Woodward’s Reagent K

Metode-metode berdasarkan pembentukan kompleks dengan tembaga meliputi:

 Metode Biuret

 Metode Lowry (Folin-Ciocalteu)  Metode Bicinchoninic Acid (BCA)  Metode FeCl3

(Arie S, 2009) 2.15 Standar Protein

Pemilihan standard protein merupakan penentu keberhasilan analisis kuantitatif. Bovine Serum Albumin (BSA) adalah protein yang umum digunakan sebagai standard dalam penetapan kadar protein. BSA banyak dipilih karena tingkat kemurniannya yang tinggi dan harganya relatif murah. Standard protein lain yang bisa digunakan adalah Bovine Gamma Globulin (BCG), terutama untuk keperluan kuantifikasi antibodi karena BCG menghasilkan warna yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (IgG).

Larutan induk (stok) standard protein biasanya dibuat dalam konsentrasi 1 - 5 mg/mL, namun tidak menutup kemungkinan dibuat larutan stok dengan konsentrasi yang lebih besar. Misalkan larutan stok standard protein yang ingin dibuat adalah 1 mg/mL sebanyak 100 mL, maka ditimbang 100 mg BSA kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades (sebaiknya bebas CO2). Perlu dicatat, ketika larutan stok dibuat, jangan dikocok, karena akan berakibat denaturasi protein (teramati sebagai buih di permukaan larutan). Untuk membantu pelarutan protein, cukup diaduk perlahan. Simpan larutan stok ini (bila belum digunakan) dalam freezer (atau lebih baik pada suhu -20o_C).

(Arie S, 2009) 2.16 Suhu optimum Enzim α-amylse

Aktivitas enzim alfa-amilase dari isolat Bacillus sp. MII-10 memerlukan pH optimum 7,0 dan suhu optimum 50-60o_{C. Enzim} alfa-amilase tersebut stabil pada pH 7,0 selama 24 jam pada suhu 40o_{C dan} pada suhu 70o_{C selama 5 menit. Sifat kinetika enzim yang ditunjukkan} oleh nilai Km adalah 0,169% terhadap substrat soluble starch setara dengan 1,69 mg/ml. Enzim tersebut memiliki afinitas cukup baik terhadap substrat dan mampu mencapai kecepatan katalitik maksimum pada konsentrasi substrat yang rendah (1,5% berat/volume).

(Richana, M.D, 2001) 2.17 Waktu inkubasi optimum enzim α-amylase

Waktu inkubasi selama 30 menit yang memberikan aktivitas a -amylase tertinggi sebesar 1,14 unit/mL.

(Gunawan, Indra. 2008) 2.18Analisa Bahan

2.18.1 Amilum

Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan, dalam bahasa sehari-hari disebut pati, terdapat pada umbi, daun, batang, dan biji-bijian. Terdiri atas dua macam polisakarida yaitu amilosa dan amilopektin.

(Poedjiadi, 1994) 2.18.2 Glukosa

BM :60,16, larut dalam larutan fehling, tollens dan eter, sulit larut dalam alkohol, memiliki dua jenis yaitu D-glukosa dan L-glukosa.

(Daintith, 1994) 2.18.3 ZnSO4

Senyawa kristalis larut air, berwarna putih, dibuat lewat pemanasan bijih zink sulfida diudara dan melarutkan dan mengkristalisasi sulfatnya.

(Daintith, 1994)

2.18.4 Ba(OH)2

Padatan putih, secdikit larut dalam air, bentuk yang umum adalah oktahidrat, monoklinik, titik leleh 780_C.

(Daintith, 1994) 2.18.5 Akuades

Cairan tak berwarna, titik leleh 00_{C, titik didih100}0_{C, tidak} berbau dan tidakberasa, terdiri dari satu molekul H2O dengan ikatan HOH 1050

(Daintith, 1994) 2.18.6 Reagen Lowry

- Reagen lowry A

Larutan asam phospo-fungatic-phospo-molybdic. - Reagen lowry B

100 ml 2% Na2CO3 dalam larutan NaOH 0,1 N dengan 1 ml CuSO4. 5H2O1% dan 1 ml natrium-kalium tartat 2%.

(Daintith, 1994) 2.18.7 Buffer Phosfat

- Larutan A = 0,2 M larutan Na-Phospat monobasis (27,8 g dalam 1000 ml)

- Larutan B = 0,2 M larutan Na-phosphat dibasis (52,65 g)

(Daintith, 1994) 2.18.8 Reagen Nelson-Somougyi

- Reagen A

12 g K.Na tartat : 1,6 g Na-bikarbonat, 14,4 g Na-sulfat anhidrat, 2,4 g Na-karbonat anhidrat dilarutkan dengan akuades.

- Reagen B

2 g CuSO4.5H2O ditambah 18 g Na2SO4 anhidrat dilarutkan sampai 100 ml (Reagen Nelson Soumogyi : 1 bagian Nelson A + 1 bagian Nelson A)

III. METODE PERCOBAAN 3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

1. Tabung reaksi 5. Gelas ukur

2. Sentrifuge 6. Gelas bekker

3. Inkubator 7. Spektrofotometer UV-VIS

4. Pipet tetes 3.1.2 Bahan

1. Sampel enzim 6. CuSO4

2. amilum 7. Buffer fosfat

3. larutan glukosa 8. Reagen Nelson-Soumogyi

4. akuades 9. Reagen Lowry

5. Ba(OH)2 3.2 Cara kerja

3.2.1 Penentuan aktivitas enzim α-amilase

Penambahan 0,1 ml larutan enzim Penambahan 3,9 ml buffer fosfat

Penikubasian pada T 400_{C selama 30 menit.} 1 ml larutan amilum

Tabung reaksi

3.2.2 Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Somougyi

Penambahan akuades 1,5 ml

Penambahan 0,2 ml larutan Ba(OH)2 0,01M Penambahan larutan ZnSO4 0,2 ml 0,01 M Penggojogan dan sentrifugasi

Penambahan 1 ml reagen Nelson-Somougyi Pemanasan selama 15 menit

Pendinginan

Penambahan 1 ml reagen arsenomolibdat Pengenceran dengan air hingga

volumemenjadi 10 ml

Penentuan konsentrasi dengan

spektrofotometer UV-VIS pada λ = 520 nm Pengulangan terhadap larutan standar glukosa

0,1 ml larutan inkubasi Tabung reaksi

1 ml supernatan Tabung reaksi

3.2.3 Penentuan kadar protein dengan metode lowry

Penambahan 1 ml reagen C Penambahan 0,1 ml reagen D Pendiaman 30 menit

Pengukuran absorbansi pada λ = 750 nm Pengulangan terhadap blanko

IV DATA PENGAMATAN

No Perlakuan Hasil

1

2

Penentuan aktivitas enzim α-amilase

1 ml larutan amilum 1% + 0,1 ml enzim + 3,9 ml buffer fosfat, inkubasi

Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Soumogyi

-0,1 ml larutan inkubasi + 1,5 ml akuades + 0,2 ml Ba(OH)2 0,01 M + ZnSO4 0,2 ml 0,01 M,

penggojogan sentrifugasi 10 menit a. ekstrak kasar

b. fraksi I c. fraksi II

-1 ml larutan supernatan + 1 ml reagen Nelson-soumogyi, dipanaskan dalam larutan mendidih selama 15 menit, didinginkan

a. ekstrak kasar b. fraksi I Larutan keruh Larutan keruh Larutan keruh Larutan biru Larutan biru Larutan biru Hasil 0,2 ml larutan enzim Tabung reaksi Hasil

3

c. fraksi II

-Penambahan 1 ml larutan molibdat, pengenceran a. ekstrak kasar

b. fraksi I c. fraksi II

-Penentuan konsensentrasi dengan spektra UV a. ekstrak kasar

b. fraksi I c. fraksi II

Penentuan kadar Protein metode Lowry

-Penambahan larutan sampel dengan 1 ml reagen C, kocok

.

a. ekstrak kasar b. fraksi I c. fraksi II

-Penambahan 0,1 ml reagen D, kocok a. ekstrak kasar b. fraksi I c. fraksi II -Pengukuran absorbansi a. ekstrak kasar b. fraksi I c. fraksi II Larutan biru Larutan biru Larutan biru Absorbansi 0,207 Absorbansi 0,055 Absorbansi 0,056 Larutan bening Larutan bening Larutan bening Larutan biru Larutan biru pekat Larutan biru

Absorbansi 0.293 Absorbansi 0,582 Absorbansi 0,544

IV. HIPOTESIS

Percobaan “Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase” bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal. Prinsip percobaan ini adalah kemampuan enzim α-amilase untuk membentuk 1 mg glukosa/satuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan pH tertentu, dan penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase yang berdasarkan pada unit aktivitas enzim α-amilase/mg protein. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah nelson-soumogyi, lowry, dan spektrofotometri. Hasil yang diperoleh adalah enzim alpha amilase yang lebih murni dengan aktivitas spesifik enzim alpha amilase tertentu.

VI. PEMBAHASAN

Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal. Prinsip percobaan ini adalah kemampuan enzim α-amilase untuk membentuk 1 mg glukosa/satuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan pH tertentu, dan penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase yang berdasarkan pada unit aktivitas enzim α-amilase/mg protein. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah nelson-soumogyi, lowry, dan spektrofotometri. Metode nelson-somougyi didasarkan pada pemanasan gula dengan larutan alkali dari tembaga tartarat dan terbentuk cupri oksida. Metode lowry adalah pengukuran kadar protein yang didasarkan pada pembentukan kompleks yang disebabkan adanya reaksi antara basa tembaga dengan protein.sedangkan metode spektrofotometri adalah penyerapan cahaya pada panjang gelombang tertentu yang diukur dalam bentuk absorbansi. Sampel yang digunakan adalah ubi jalar yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin.

fraksinasi dalam amilum 1%. Digunakan amilum karena enzim α-amilase dapat menghidrolisis amilum. Kemudian dilakukan penambahan buffer fosfat dalam campuran tersebut. Fungsi penambahan buffer PO4 adalah

sebagai larutan penyangga agar pH-nya tidak berubah. Di mana aktivitas α-amilase berada pada range pH 5,4-6,4, maka digunakan buffer PO4

dengan pH 6,1 (buffer asam), di mana pH ini merupakan pH optimum aktivitas α-amilase. Jika pH-nya di atas pH optimum maka enzim akan mengalami deprotonasi atau perubahan pH. Bila pH berada di atas maupun di bawah pH optimum maka dapat menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim menurun.

Setalah penambahan buffer fosfat, campuran diinkubasi pada suhu 400_{C karena suhu tersebut merupakan suhu optimum aktivitas enzim} α-amilase. Hal ini sebanding dengan energi aktivasi (Ea) untuk setiap enzim membentuk kompleks enzim-substrat dan kemudian membentuk produk dan enzim kembali. Jika suhu inkubasi lebih tinggi maka protein akan terdenaturasi yang mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Begitu pula jika diinkubasi pada temperatur yang lebih rendah maka aktivitas enzim α-amilase kurang optimal. Penginkubasian ini bertujuan agar enzim α-amilase dapat bekerja sempurna dalam mengidrolisiss amilum menjadi glukosa.

6.1. Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Soumogyi Percobaan ini bertujuan untuk penentuan kadar gula pereduksi dengan menggunakan metode Nelson-Soumogyi. Penentuan kadar gula pereduksi merupakan wujud dari uji aktifitas enzim α-amilase. Aktivitas enzim merupakan unit aktivitas enzim permiligram protein, sedangkan satu unit aktivitas enzim α-amilase merupakan kemampuan enzim α-amilase yang menyebabkan terbentuknya 1mg produk glukosa dari substrat amilum persatuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan pH tertentu. Uji aktivitas spesifik enzim α-amilase diawali dengan reaksi enzimatis, yaitu dengan menambahkan larutan amilum 1% dan buffer fosfat ke dalam enzim

kasar dan enzim halus.

E + S ES E + P

Enzim αsubstrat enzim-substrat enzim produk

Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi, dimana pada proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi :

O CH₂OH OH OH O O

O + Buffer Fosfat alfa - amilase CH₂OH OH OH CH₂OH OH OH O O CH₂OH OH OH OH HO O CH2OH OH OH OH HO Maltosa Glukosa Kadar gula pereduksi dapat ditentukan dengan metode Nelson-Soumogyi. Penambahan larutan Ba(OH)2 bertujuan untuk meminimalisasi

masuknnya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat mengoksidasi kupri oksida (Cu2O) dan penambahan ZnSO4 bertujuan untuk

mengendapkan protein. Supernatan yang terbentuk ditambahkan reagen Nelson-Soumogyi dan dipanaskan dengan tujuan untuk mempercepat reaksi. Penambahan reagen Nelson-Soumogyi menyebabkan terbebtuknya kupri oksida. Reagen Cu-tartrat akan direduksi oleh glukosa, hal ini karena glukosa mempunyai gugus gula pereduksi, yaitu gugus aldehid.

Reaksi reduksi Cu2+ _:

Cu2+ _{+ e Cu}2+

Ion Cu+ _{akan mengendap sebagai Cu}

2O dalam suasana basa :

2 Cu + _{+ 2 OH}- _Cu

2O + H2O

Reaksi terbentuknya kupri oksida : CHO C C C C CH2OH OH H OH OH H OH H H CHO C C C C CH2OH OH H OH OH H OH H H Cu2+ Alkali + Cu2O

Glukosa asam D-glukonat

Metode Nelson-Soumogyi menganalisa secara kuantitatif produk reaksi enzimatis berupa glukosa, akan tetapi metode ini memiliki kekurangan karena gula non pereduksi (sukrosa) tidak dapat terdeteksi dan hanya bisa mendeteksi gula pereduksi (glukosa-fruktosa) padahal produk dari pemecahan amilum oleh enzim α-amilase bukan glukosa melainkan maltosa, sukrosa dan gula non pereduksi yang lain.

Gula dapat direduksi dengan sinar UV karena memiliki elektron-elektron yang dapat tereksitasi dari keadaan dasar ketingkat energi yang lebih tinggi. Biasanya transisi elektron disebabkan oleh elektron π dimana dalam molekul glukosa mengandung gugus karbonil yang dibentuk oleh elektron π.

Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan tersebut dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ 520 nm. Panjang gelombang 520 nm ini merupakan panjang gelombang maksimum, dimana terjadi serapan maksimum oleh larutan glukosa. Kadar gula pereduksi ditentukan dengan membandingkan absorbansi larutan sampel terhadap kurva larutan standar glukosa. Hasil yang didapatkan adalah larutan berwarna biru dengan nilai absorbansi yang didapat adalah pada ekstrak kasar sebesar 0,207;fraksi I sebesar 0,055;dan fraksi II sebesar 0,056. Sedangkan kadar glukosanya adalah 6,032unit untuk ekstrak kasar, 0,1257unit untuk fraksi I dan 0,0851unit untuk fraksi II.

6.2. Penentuan kadar Protein dengan Metode Lowry

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dengan metode lowry. Penentuan kadar protein dengan metode lowry didasarkan pada warna kompleks yang yang dibentuk, dimana intensitas warnanya bervariasi bedasarkan jenisprotein atau jumlah asam amino aromatik pada protein. Warna yang timbul disebabkan oleh reaksi tembaga alkali dengan protein.

merupakan campuran natrium tungstat dan natrium molibdat dalam asam. Campuran asam ini akan mereduksi protein yang digunakan dalam percobaan melalui penguraian Cu2+ _{sehingga campuran asam ini kehilangan} satu atau lebih atom oksigen dan kompleks biru yang dihailkan merupakan kompleks antara protein dengan Cu2+_.

Struktur kompleks biru :

Cu2+ HN CH C HN NH C HC NH O R O R

Penentuan kuantitatif kadar protein secara lowry didasarkan pada absorbansi sinar oleh kompleks biru. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS pada λ 750nm. Hasil yang diperoleh adalah larutan berwarnabiru dongker dengan nilai absorbansi sampel yang diperoleh yaitu pada ekstrak kasar sebesar 0.293 mg/mL; fraksi I sebesar 0,582mg/mL;dan fraksi IIsebesar 0,544mg/mL. Sedangkan nilai aktivitas spesifik enzim α-amilase pada ekstrak kasar adalah sebesar 2,346 unit/mg protein, pada fraksi I yaitu 0,0246 unit/mg protein dan pada fraksi II sebesar 0,0178 unit/mg protein

VII. PENUTUP 7.1 Kesimpulan

7.1.1 Penentuan aktivitas enzim α-amilase dapat di lakukan dengan metode spektro fotometri menggunakan metode Nelson-soumogyi dan Lowry

7.1.2 Kadar gula pereduksi pada ekstrak kasar adalah 6,032unit, pada fraksi I adalah 0,1257 unit dan pada fraksi II adalah 0,0851 unit 7.1.3 Kadar protein enzim dalam ekstrak kasar adalah 2,57075 mg/mL,

dalam fraksi I adalah 5,0995mg/mL dan pada fraksi II adalah 4,767mg/mL

7.1.4 Nilai aktivitas spesifik enzim α-amilase yaitu pada ekstrak kasar sebesar 2,346unit/ mg protein, pada fraksi I sebesar 0,0246unit/ mg protein, dan pada fraksi II adalah sebesar 0,0178 unit/mg protein

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Azmi, 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae Untuk Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka, Laboratorium Kimia Jurusan PMIPA FKIP Universitas Riau, Pekanbaru Daintith, 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta.

Darmajana And Agustina, 2008, Pengaruh Konsentrasi Enzim α-Amilase Terhadap Sifat Fisik Dan Organoleptik Filtrat, Balai Besar Teknologi Tepat Guna – Lipi, Subang

Hardjono, 2001, Spekstroskopi, liberty, Yogyakarta Lehninger, 1999, Biokimia Dasar, Erlangga, Jakarta Poedjiadi, 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI Press, Jakarta

Winarno, 1983, Kimia Pangan dan Gizi, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta

LEMBAR PENGESAHAN

Semarang, 24 November 2012 Praktikan,

Istiana Sulisminawati Zasrie Putri Oktaviani

24030110120011 24030110141009

Nor Sri Inayati Galih Purbo Utomo

240301101410 20 24030110141026

Fitria Kusumawati 24030110141034

Mengetahui, Asisten

Reny Ingemer S J2C009044

LAMPIRAN

• Penentuan Kadar Glukosa Absorbansi Nelson-Somougyi - Ekstrak kasar :0,207 - Fraksi I :0,055 - Fraksi II :0,0851 V analisa : 0,1 mL Vsampel : 5mL Vtotal : 5mL Venzim : 0,1mL t inkubasi : 40 meniit kadar glukosa: X = - Ekstrak kasar X = = 1,7374

= 6,032 unit - Fraksi I X = = 0,0362 = 0,1257 unit - Fraksi II X = = 0,0245 = 0,0851 unit

• Penentuan Kadar Protein Absorbansi Lowry

- Ekstrak kasar : 0,293

- Fraksi I : 0,582

- Fraksi II : 0,544

kadar protein = - Ekstrak kasar Kadar protein = = 2570,75μg/mL = 2,57075 mg/mL - Fraksi I Kadar protein = = 5099,5μg/mL = 5,0995 mg/mL - Fraksi II Kadar protein = = 4767μg/mL = 4,767 mg/mL • Aktivitas spesifik enzim α-amilase

Aktivitas spesifik =

Aktivitas spesivik = = 2,346 unit/mg protein - Fraksi I Aktivitas spesifik = = 0,0246 unit/mg protein - Fraksi II Aktivitas spesifik = = 0,0178 unit/mg protein