Penapisan Cepat Toleransi Kedelai terhadap Kekeringan secara In Vitro
M. Kosmiatin, S. Hutami, A. Husni, dan I. MariskaBalai Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar No 3A, Bogor
nomor kedelai yang diuji. Eksplan embrio masak dapat mengelompok-kan varietas kedelai dalam kelompok peka, moderat dan toleran pada media dengan penambahan PEG konsentrasi 10%. Hasil penelitian seri kedua menunjukkan bahwa konsentrasi PEG 10% tetap mengelompokkan kedelai berdasarkan toleransinya terhadap kekeringan. Pengenceran media hingga 25% lebih encer dari formulasi dasar tidak mengganggu pengelompokan kedelai. Kata kunci: Penapisan in vitro, toleransi kekeringan, PEG 6000,
Glycine max.
T
eknologi in vitro memungkinkan penyediaan somaklon untuk tujuan perbaikan sifat tanaman, sekaligus berpeluang dilakukan penapisan secara cepat terhadap ketahanan cekaman biotik maupun abiotik. Penapisan genotipe-genotipe baru di lapang seringkali menghadapi kendala cekaman lingkungan yang sulit dikendalikan, antara lain cekaman abiotik sering dibatasi oleh perubahan musim. Di samping itu dengan melakukan penapisan di lapang untuk toleransi terhadap kekeringan sulit dilakukan karena sulit mengendalikan kadar air tanah sesuai dengan yang diinginkan. Penapisan di kamar kaca dapat dilakukan tetapi menjadi lebih merepotkan apabila pengukuran kadar air tanah dilakukan secara manual.Penapisan secara in vitro untuk sifat ketahanan terhadap cekaman abiotik mempunyai keunggulan komparatif, antara lain waktu seleksi lebih singkat, tidak membutuhkan ruang yang luas, mudah dikontrol, dan tidak dibatasi oleh musim (Sirait 2001).
Penapisan secara in vitro dilakukan dengan me-manfaatkan komponen penyeleksi yang dapat men-simulasikan cekaman lingkungan. Dengan dikuasainya faktor-faktor yang berperan dalam kondisi cekaman, memungkinkan mengganti kondisi cekaman tersebut dengan bahan organik atau anorganik yang sama peranannya atau menyamai kondisi cekaman tersebut. Simulasi kondisi kekeringan dengan larutan osmotikum sebagai komponen seleksi yang dikombinasikan dengan penerapan teknik in vitro diharapkan mampu mem-permudah usaha penapisan untuk toleransi terhadap kekeringan (Widoretno 2003). Senyawa osmotikum yang dapat digunakan untuk penapisan in vitro untuk toleransi terhadap kekeringan antara lain adalah sorbitol, manitol (Gulati and Jaiwal 1993; Rajashekar et
al. 1995), PEG (Santos-Diaz and Ocha-Alejo 1994; Dami
and Hughes 1995; Rasanen et al. 2004).
ABSTRACT. Rapid Screening for Drought Tolerance in Soybean through In Vitro Culture. Screening for crop tolerance
to abiotic stresses through in vitro cultures is advantageous because it is quick, need small space, easy to control, and not limited by seasons. In vitro selection for drought tolerance was done using polyethylene glycole ( PEG 6000). The aim of the experiment was to develop a quick in vitro selection method for selection of soybean varieties or lines tolerant to drought. Soybean seeds of susceptible (3209 and 3083, moderately tolerant (Wilis), and tolerant to drought (MLG 2805, Tanggamus and Nanti) were used in this study. The experiment was done in two series. In the first experiment, steril explants of embryo axis, young embryo, and mature embryo were cultured in an MS solid medium containing GA3 0.5 mg/l. PEG 6000 was added to media before sterilization tot a concentration of 0, 10, 20, and 30%. In the second experiment, young and mature seeds were used as sources of explants, which were cultured on different solid media (MS ½, MS ¼, PC-L2 ½ and PC-L2 ¼) containing different concentration of PEG 6000 (0; 5; 10; 15; 20%). Observation was done visually based on germination percentages of the explants. The results showed germination percentages of the explants varied with the types of the soubean explants used in the trial.. The use of PEG in the media decreased the germination percentages of all soybean varieties and lines. Explants of mature embryo were appropriate to be used in the drought tolerance trial in a medium containing 10% PEG. The second experiment showed that PEG with 10% concentration still regrouping soybean seeds based on the tolerance to drought stress. Dilution of the medium untill ¼ of the basic formula did not affect level of drough tolerance of the soybean.
Keywords: In vitro technique, drought tolerance, PEG 6000, soybean.
ABSTRAK. Metode penapisan secara in vitro mempunyai
keunggul-an komparatif, keunggul-antara lain waktu seleksi lebih singkat, tidak mem-butuhkan ruang luas, mudah dikontrol, dan tidak dibatasi oleh musim. Penapisan in vitro untuk toleransi kekeringan dapat menggunakan Poly Ethylene Glycol (PEG) sebagai komponen seleksi. Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan metode seleksi in vitro untuk menapis varietas atau nomor-nomor kedelai toleran kekeringan secara cepat dengan komponen seleksi PEG. Bahan tanaman yang digunakan adalah beberapa nomor kedelai yang sudah diketahui tanggapnya terhadap kekeringan, yaitu nomor 3209 dan 3083 (rentan), Wilis (moderat) dan MLG 2805, Tanggamus, Nanti (toleran). Penelitian dilakukan dua seri, seri pertama mengkulturkan eksplan steril (embrio aksis, embrio muda dan embrio masak) pada media MS + GA3 0,5 mg/l + PEG 6000 konsentrasi 0; 10; 20; 30%, ditambahkan ke dalam media kultur sebelum media disterilisasi. Penelitian seri kedua menggunakan eksplan biji muda dan masak yang dikulturkan pada media MS ½, MS ¼, PC-L2 ½ dan PC-L2 ¼ dengan PEG 6000 konsentrasi 0; 5; 10; 15; 20%. Pengamatan dilakukan terhadap persentase perkecambahan dan visual biakan. Hasil penelitian seri pertama menunjukkan bahwa penggunaan eksplan memberikan persentase perkecambahan yang berbeda, embrio aksis muda memberikan perkecambahan tidak normal yang tinggi. Penambahan PEG di dalam media perkecambahan secara umum akan menurunkan persentase perkecambahan pada seluruh
Penggunaan senyawa osmotikum PEG dalam induksi cekaman air pada tanaman sudah dipakai sejak lama (Krizek 1985). PEG adalah senyawa yang stabil, non-ionik, polymer panjang yang larut dalam air, dan dapat digunakan dalam sebaran berat molekul yang luas (Lawyer 1970). Penggunaan PEG lebih disarankan karena dengan berat molekul lebih dari 4000 tidak dapat diserap oleh sel tanaman (Dami and Hughes 1995; Paadey et al. 2004). PEG dengan berat molekul lebih dari 4000 dapat menginduksi cekaman air pada tanaman dengan mengurangi potensial air pada larutan nutrisi tanpa menyebabkan keracunan (Lawyer 1970). Di samping itu PEG larut dalam air sehingga penurunan potensial air yang terjadi menjadi homogen dan lebih stabil dalam menginduksi kondisi cekaman (Paadey et
al. 2004). Dengan sifat-sifat tersebut, PEG dapat
diguna-kan untuk menginduksi cekaman air dalam kultur in
vitro. Short et al. (1987) menyatakan bahwa dalam kultur in vitro, PEG dapat menginduksi cekaman air dan
ber-kolerasi positif dengan yang terjadi di lapang atau rumah kaca. Penggunaan PEG sebagai agen penyeleksi telah digunakan untuk identifikasi dan seleksi variasi genetik
poplar (Forestry Department 1997), juga pada kultur kayu
manis dengan konsentrasi PEG 15% (Li et al. 2004) Dengan penapisan secara in vitro maka intensitas seleksi yang lebih besar dan homogen dapat diberikan kepada biakan sehingga efisiensi dapat ditingkatkan dalam memperoleh genotipe baru yang diinginkan (Specht and Graef 1996). Dari usaha-usaha tersebut banyak dihasilkan nomor-nomor yang diharapkan toleran terhadap kekeringan. Dengan dikuasainya teknik penapisan secara in vitro diharapkan penapisan dapat dilakukan secara dini untuk seluruh nomor-nomor yang dihasilkan dengan biaya dan cara yang relatif lebih murah dan cepat.
Penggunaan teknik in vitro tidak terlepas dari pe-milihan media dan eksplan yang tepat untuk dapat menapis seluruh aksesi kedelai. Media dan eksplan ini harus sesuai untuk dapat mengecambahkan bahan tanaman pada media pembanding (tanpa penambahan komponen seleksi). Pada penapisan in vitro, penambah-an komponen seleksi harus dipilih, sehingga pada konsentrasi yang tepat dapat mengelompokkan antara nomor-nomor yang peka, moderat, dan toleran.
Tujuan penelitian adalah untuk mengembangkan metode seleksi in vitro untuk menapis varietas atau nomor-nomor kedelai toleran kekeringan secara cepat dengan komponen seleksi PEG.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan kelompok peneliti Biologi sel dan jaringan dan rumah kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Biotek-niologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor pada tahun 2003-04.
Bahan tanaman yang digunakan pada percobaan seri pertama adalah empat genotipe kedelai yang sudah diketahui tanggapannya terhadap kekeringan, yaitu MLG 2805, (toleran), Wilis (moderat), No. 3083 dan 3209 (peka). Bahan tanaman ini ditanam di kamar kaca sebagai sumber eksplan untuk penapisan in vitro. Eksplan yang dipergunakan adalah embrio aksis muda, embrio muda dan embrio masak.
Eskplan diisolasi dari polong yang telah disimpan selama dua hari di lemari pendingin. Polong dicuci dengan detergen, dan disterilkan dengan kombinasi sterilan alkohol 70%, HgCl2 dan kloroks. Polong ke-mudian dibilas dengan aquadest steril dan larutan antiseptik. Eksplan ditanam pada media dasar MS yang ditambah dengan GA3 0,5 g /l serta PEG 6000 sebagai penyeleksi dengan konsentrasi 0, 10, 20 dan 30%. Ke dalam media dasar ditambahkan pula vitamin meso inositol 100 mg/l, piridoksin 0,5 mg/l, asam nikotinat 0,5 mg/l, dan thiamin 0,1 mg/l (Tabel 1). Untuk bahan pe-madat digunakan phytagel 2,5 g/l. Kemudian pH media dibuat menjadi 5,7 dengan menambahkan KOH atau HCl 0,1 N.
Tabel 1. Komposisi media MS dan PC-L2.
Uraian MS (mg/l) PC-L2 (mg/l) Makro KNO3 1900 2100 NH4NO3 1650 1000 CaCl2.2H2O 440 600 MgSO4.7H2O 370 435 KH2PO4 170 325 NaH2PO4.H2O - 85 Mikro MnSO4.4H2O 22,3 19,8 ZnSO4.7H2O 8,6 5 H3BO3 6,2 5 KI 0,83 1 CuSO4.5H2O 0,025 0,1 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,4 CoCl2.6H2O 0,025 0,1 Na2EDTA.2H2O 37,3 33,6 FeSO4.7H2O 27,8 25 Vitamin Meso-Inositol 100 250 Thiamine HCl 0,1 2 Nicotinic acid 0,5 -Pyridoxine.HCl 0,5 0,5 Glycine 2
-Percobaan seri kedua menggunakan eksplan embrio muda dan masak dari empat varietas kedelai yang sudah diuji pada seri pertama. Eksplan dikulturkan pada media MS½, MS¼, PC-L2 ½ dan PC-L2 ¼.
Pengamatan dilakukan terhadap persentase per-kecambahan normal dan visual biakan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan Seri Pertama
Berdasarkan persentase perkecambahan eksplan, penambahan PEG pada media menurunkan kemampu-an perkecambahkemampu-an semua jenis eksplkemampu-an dari seluruh varietas kedelai yang digunakan. Penurunan per-kecambahan nyata terlihat pada media menggunakan PEG 10%. Pada PEG 30%, hanya varietas MLG 2805 yang berasal dari eksplan embrio masak yang memiliki perkecambahan 10% (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa varietas ini toleran terhadap kekeringan.
Pada media MS + 0,5 mg/l GA3 dengan penambahan PEG, ketiga jenis eksplan banyak yang mengalami pencoklatan, terutama pada bagian eksplan yang menyentuh atau terkena media. Pencoklatan meningkat dengan makin tingginya konsentrasi PEG pada media. Pada varietas toleran (MLG 2805), perkecambahan tetap berlangsung atau terjadi pembukaan kotiledon (eksplan tetap hidup) meskipun eksplan mengalami pencoklatan. Sementara pada kelompok yang peka, pencoklatan menghambat perkecambahan.
Pada konsentrasi PEG tinggi, kelompok toleran memiliki pertumbuhan akar yang sangat pesat dengan percabangan yang banyak dan perkecambahan yang normal (tunas dan akar tumbuh) (Gambar 1). Pada kelompok ini, meskipun bagian yang terkena PEG men-coklat tetapi masih menunjukkan pertumbuhan yang
terlihat dari menghijaunya kotiledon bagian dalam. Dengan adanya PEG dalam media maka air menjadi tidak tersedia bagi jaringan tanaman. Keberadaan PEG dapat menginduksi respon tanaman, baik secara fisiologis maupun morfologi (Molnar et al. 2004). Bagi kelompok toleran ada mekanisme toleransi yang dapat menarik air dari media atau ada mekanisme lain seperti potensial air jaringan yang tinggi sehingga sistem perakaran meningkat. Dapat pula terjadi karena potensial air ja-ringan yang rendah melalui akumulasi senyawa solut organik pada sitoplasma yang kemudian
dikompartmen (ditempatkan) pada vakuola (Jensen et al. 1996; Hasegawa et al. 2000). Pada kelompok moderat
dan peka, eksplan yang mencoklat umumnya gagal berkecambah, pertumbuhan akarnya juga tidak secepat dan sebanyak akar pada kelompok toleran.
Kedelai kelompok peka kekeringan (Nomor 3083 dan 3209) hanya berkecambah pada media dengan penambahan PEG 10%, dengan tingkat perkecambahan di bawah 6,7% berasal dari eksplan embrio masak. Perkecambahan dari eksplan embrio aksis dan embrio muda mengalami kegagalan (Tabel 3 dan 4). Pada ke-lompok ini penambahan PEG menyebabkan kematian yang ditunjukkan oleh mencoklatnya eksplan atau layunya kecambah (masa hidup kecambah pendek). Eksplan yang berkecambah gagal tumbuh lebih lanjut karena tidak dapat mempertahankan turgornya, se-hingga layu dan akhirnya mati. Pada eksplan embrio masak dan embrio muda, eksplan yang tidak mati hanya mampu membuka kotiledon dan akar yang tumbuh pendek dan tebal dengan percabangan sedikit (Gambar 2 dan 3).
Pada kelompok moderat (Wilis), kemampuan per-kecambahannya hampir sama dengan kelompok peka untuk semua jenis eksplan yang digunakan. Pada eksplan embrio aksis, perkecambahan dapat terjadi pada media dengan penambahan PEG 10% meskipun tingkat per-kecambahnnya rendah, hanya 3,3% (Tabel 3). Eksplan
Tabel 2. Persentase perkecambahan embrio masak pada media penapisan MS + 0,5 mg/l GA3, 4 minggu setelah tanam. Persentase perkecambahan (%)
Varietas/nomor Konsentrasi PEG (%)
0 10 20 30 N TN M N TN M N TN M N TN M 3083 20,0 0,0 80,0 6,7 0,0 93,3 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 3209 26,7 0,0 73,3 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 Wilis 20,0 0,0 80,0 6,7 0,0 93,3 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 MLG 2805 80,0 20,0 0,0 30,0 70,0 0,0 40,0 30,0 30,0 10,0 90,0 0,0
Tabel 4. Persentase perkecambahan embrio muda pada media penapisan MS + 0,5 mg/l GA3, 4 minggu setelah tanam. Persentase perkecambahan (%)
Varietas/nomor Konsentrasi PEG (%)
0 10 20 30 N TN M N TN M N TN M N TN M 3083 100 0,0 0,0 0,0 80,0 20,0 0,0 20,0 80,0 0,0 0,0 100 3209 0,0 100 0,0 0,0 25,0 75,0 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 Wilis 100 0,0 0,0 0,0 47,5 52,5 0,0 43,0 57,0 0,0 0,0 100 MLG 2805 0,0 100 0,0 0,0 100 0,0 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100
N = Normal, TN = Tidak normal, M = Mati/tidak ada perubahan
Tabel 3. Persentase perkecambahan embrio aksis muda pada media penapisan MS + GA3 0,5 mg/l, 4 minggu setelah tanam. Persentase perkecambahan (%)
Varietas/nomor Konsentrasi PEG (%)
0 10 20 30 N TN M N TN M N TN M N TN M 3083 50,0 0,0 30,0 0,0 31,3 68,8 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 3209 100 0,0 0,0 0,0 25,0 75,0 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 Wilis 70,0 0,0 30,0 3,3 53,3 43,7 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100 MLG 2805 0,0 100 0,0 0,0 100 0,0 0,0 0,0 100 0,0 0,0 100
N = Normal, TN = Tidak normal, M = Mati/tidak ada perubahan
Gambar 1. Perkecambahan dan pertumbuhan akar dari kelompok toleran yang berasal dari eksplan embrio masak
a. Perkecambahan pada PEG 0%, b. Perkecambahan pada PEG 10% c. Perkecambahan pada PEG 20%, d. Perkecambahan pada PEG 30%
Gambar 2. Perkecambahan dan pertumbuhan akar dari kelompok peka yang berasal dari eksplan embrio masak
a. Perkecambahan pada PEG 0% b. Perkecambahan pada PEG 10% c. Perkecambahan pada PEG 20% d. Perkecambahan pada PEG 30%
embrio masak juga dapat berkecambah pada media ini dengan tingkat perkecambahan 6,7% (Tabel 2), tetapi embrio muda gagal berkecambah pada media dengan penambahan PEG. Penampakan visual kecambah dari kelompok ini lebih menyerupai kelompok peka (Gambar 3).
Pada kelompok kedelai toleran kekeringan (MLG 2805), kemampuan perkecambahan pada media dengan PEG 10% cukup tinggi terlihat pada eksplan yang berasal dari embrio masak, berkisar antara 20-30% (Tabel 2). Bahkan MLG 2805 dan Nanti dapat ber-kecambah pada media dengan penambahan PEG 30%, meskipun persentasenya rendah. Kelompok toleran yang berasal dari eksplan embrio masak, per-kecambahannya normal. Eksplan yang tidak
ber-kecambah normal berwarna coklat pada bagian yang terkena medium. Pada eksplan ini, bila kotiledon mem-buka terlihat bagian dalamnya berwarna hijau dan beberapa masih dapat menumbuhkan akar. Eksplan yang berasal dari embrio aksis dan embrio muda pada kelompok toleran kekeringan tidak mampu ber-kecambah secara normal pada semua konsentrasi penambahan PEG. Pada penambahan PEG 10%, eksplan yang berasal dari embrio aksis hanya dapat memanjang tanpa menumbuhkan daun (tunas), walaupun akar dapat tumbuh (Gambar 4). Sementara yang berasal dari embrio muda eksplan hanya dapat membuka kotiledon tanpa pertumbuhan tunas dengan akar yang umumnya terbentuk pendek.
Dari hasil pengamatan terhadap persentase per-kecambahan terlihat hanya pada medium dengan pe-nambahan PEG 10% dengan eksplan yang berasal dari embrio masak yang memperlihatkan pengelompokan yang jelas. Pada kelompok peka (Nomor 3083 dan 3209), perkecambahan berlangsung kurang dari 6,7%. Tingkat perkecambahan kelompok moderat (Wilis) adalah 6,7%, sedangkan kelompok toleran di atas 20%.
Adkins et al. (1995) menyatakan bahwa kemampu-an PEG dalam menghidrasi jaringkemampu-an tkemampu-anamkemampu-an dapat bertindak sebagai penapis in vitro, sehingga mampu menyeleksi variasi berbagai tanaman dengan tingkat toleransi kekeringan yang lebih baik. Penurunan po-tensial air dalam media untuk penapisan yang baik akan bergantung pada konsentrasi dan berat molekul dari PEG.
Dari visual biakan terlihat bahwa kelompok toleran memperlihatkan pertumbuhan akar yang pesat dengan percabangan yang banyak, bahkan terlihat pada embrio yang gagal berkecambah. Pada varietas yang peka dan
Gambar 4. Tunas dari eksplan embrio aksis muda dan embrio
muda varietas Tanggamus yang gagal membentuk kecambah normal pada media tanpa PEG.
Gambar 3. Perkecambahan dan pertumbuhan akar dari kelompok moderat yang berasal dari eksplan embrio masak
a. Perkecambahan pada PEG 0% b. Perkecambahan pada PEG 10% c. Perkecambahan pada PEG 20% d. Perkecambahan pada PEG 30%
moderat, pertumbuhan akar pada kecambah cukup panjang, tapi percabangan kurang dan eskplan yang gagal berkecambah tidak memperlihatkan pertumbuh-an akar.
Penggunaan eksplan yang berbeda memperlihatkan respon yang berbeda. Eksplan embrio aksis paling banyak membentuk kecambah yang tidak normal, berupa pembentukan kalus pada eksplan, sehingga pertumbuhan tunas (daun) dan akar terhambat. Hal ini terjadi karena embrio aksis muda merupakan jaringan dengan daya meristematisnya yang tinggi, sehingga pembelahan sel berlangsung secara cepat dan meng-hambat proses diferensiasi. Selain itu, penggunaan embrio aksis muda sebagai eksplan dalam penapisan
in vitro diperlukan keterampilan yang tinggi dalam teknik
isolasinya, karena bagian embrio yang terlukai akan memacu pembelahan sel kalus yang tinggi. Ketidak-normalan kecambah juga ditemui pada eksplan embrio muda, di mana ketidaknormalan diperlihatkan dengan terhambatnya pertumbuhan plumula (daun pertama), sementara pertumbuhan radikel (akar) tetap ber-langsung. Pada eksplan embrio matang, kecambah tumbuh normal.
Perkecambahan pada media dengan penambahan 0.5 mg GA3 /l beragam, meskipun tidak ditambahkan PEG. Hal ini menunjukkan bahwa komposisi media ini tidak sesuai untuk semua varietas/nomor dan jenis eksplan yang digunakan. Ketidaksesuaian ini ditunjuk-kan oleh adanya beberapa eksplan yang sama sekali tidak dapat berkecambah, seperti pada varietas Tang-gamus, MLG 2805, dan nomor 3209 yang berasal dari eksplan biji muda.
Percobaan Seri Kedua
Percobaan seri kedua ditujukan untuk melihat kon-sistensi pengelompokan kedelai dengan menggunakan senyawa penyeleksi PEG 10% dengan menggunakan eksplan embrio masak dan embrio muda. Pada per-cobaan ini, media yang dicoba adalah media MS dan PC-L2 yang diencerkan. Media MS dipilih karena umum digunakan untuk hampir semua jenis tanaman yang dikulturkan. Media PC-L2 dipilih karena baik untuk kultur hampir semua tanaman kelompok legum. Pada media dasar tidak ditambahkan zat pengatur tumbuh apa pun, karena hasil penelitian sebelumnya menunjukkan
Tabel 5. Persentase perkecambahan embrio masak pada media penapisan dengan penseleksi PEG, 4 minggu setelah tanam.
Persentase perkecambahan (%)
Varietas/Media Konsentrasi PEG (%)
0 5 10 15 20 N TN M N TN M N TN M N TN M N TN M MS ½ MLG 2805 75 25 0 65 0 35 70 30 0 65 35 0 10 90 0 Wilis 75 10 15 60 35 5 20 70 10 0 50 50 0 45 55 3209 60 5 35 40 60 0 0 40 60 0 40 60 0 25 75 3083 100 0 0 90 10 0 25 70 5 5 60 35 00 50 50 MS ¼ MLG 2805 100 0 0 75 25 0 65 35 0 10 55 35 15 85 0 Wilis 60 30 10 65 35 5 30 35 35 10 25 65 0 10 90 3209 60 5 35 35 50 15 15 50 35 0 30 70 0 30 70 3083 100 0 0 90 5 5 25 60 15 5 85 10 0 40 60 PC-L2 ½ MLG 2805 100 0 0 80 20 0 50 50 0 10 70 20 20 80 0 Wilis 80 10 10 65 15 20 30 5 65 0 0 100 5 0 95 3209 60 30 10 20 50 30 5 30 65 0 35 65 0 10 90 3083 100 0 0 45 40 15 30 50 20 0 40 60 0 65 35 PC-L2 ¼ MLG 2805 95 5 0 85 15 0 50 50 0 10 70 20 20 80 0 Wilis 70 0 30 55 30 15 35 30 15 0 0 100 5 0 95 3209 50 35 15 45 15 40 10 30 60 0 25 75 0 0 100 3083 85 0 15 65 35 0 20 65 15 0 30 70 0 0 100
bahwa penambahan GA3 tidak memberikan hasil yang lebih baik.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa PEG 10% tetap mengelompokkan kedelai berdasarkan toleransi-nya terhadap kekeringan. Berdasarkan persentase per-kecambahan eksplan, penambahan PEG tetap me-nurunkan kemampuan perkecambahan. Penurunan perkecambahan mulai terlihat pada media dengan penambahan PEG 5%, dan mulai mengelompok pada media dengan PEG 10%. Pada media dengan pe-nambahan PEG 15%, embrio Wilis (moderat) dan MLG 2805 (toleran) masih dapat berkecambah, tetapi pada PEG 20% hanya varietas MLG 2805 yang berasal dari eksplan embrio masak yang berkecambah dengan tingkat perkecambahan 20% (Tabel 5).
Penggunaan embrio masak sebagai eksplan lebih baik daripada eksplan embrio muda. Hal ini ditunjukkan ole berkecambahnya eksplan pada semua perlakuan media dasar dengan tingkat perkecambahan di atas 60% untuk semua media yang digunakan. Pada kedelai kelompok peka kekeringan (Nomor 3083 dan 3209) penambahan PEG 5% mulai menurunkan persentase perkecambahan, eksplan yang tetap hidup umumnya menunjukkan pertumbuhan yang tidak normal. Pada
kelompok moderat dan toleran juga terjadi penurunan persentase perkecambahan, tetapi tidak sebesar pada kelompok peka. Penambahan PEG 10% ke dalam se-luruh media, pada eksplan embrio masak memperlihat-kan persentase perkecambahan yang mengelompok, sesuai dengan tingkat toleransinya terhadap kekeringan. Pada kelompok rentan, rata-rata perkecambahan hanya 25%, moderat 35%, dan toleran 60%.
Penggunaan eksplan embrio muda pada media yang diencerkan (disederhanakan) ternyata tidak memberi-kan hasil yang baik. Hal ini ditunjukmemberi-kan oleh gagal atau rendahnya perkecambahan pada media tanpa PEG. Respon kedelai MLG 2805 terhadap kultur embrio muda pada media yang diencerkan tidak begitu baik yang ditunjukkan oleh sangat rendahnya persentase embrio yang dapat berkecambah, 8,7-27,5% (Tabel 6). Pada varietas lain yang dicoba juga terjadi keragaman persentase perkecambahan pada media kontrol (tanpa PEG) dan meningkatnya persentase ketidaknormalan perkecambahan. Ketidaknormalan ini diperlihatkan oleh terhambatnya pertumbuhan plumula (daun pertama), sementara pertumbuhan radikel (akar) tetap ber-langsung. Pada eksplan embrio matang, kecambah tumbuh normal.
Tabel 6. Persentase perkecambahan embrio muda pada media penapisan dengan penseleksi PEG, 4 minggu setelah tanam.
Persentase perkecambahan (%)
Varietas/Media Konsentrasi PEG (%)
0 5 10 15 20 N TN M N TN M N TN M N TN M N TN M MS ½ MLG 27,5 52,5 80 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Wilis 63,8 36,3 0 31,3 0 68,8 47,1 0 52,9 18,8 0 81,3 0 0 100 3209 65 10 25 37,5 0 62,5 0 0 100 0 0 100 0 0 100 3083 67,5 22,5 10 100 0 0 50 0 50 6,3 0 93,8 0 0 100 MS ¼ MLG 10 30,5 59,5 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Wilis 55 20 25 43,8 0 56,8 12,5 0 87,5 25 0 75 0 0 100 3209 25 59,4 15,7 0 0 100 12,5 0 87,5 0 0 100 0 0 100 3083 52,5 10 37,5 100 0 0 56,3 0 43,8 31,3 0 68,8 0 0 100 PC-L2 ½ MLG 10,5 34,2 53,4 12,5 0 87,5 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Wilis 55 20 25 31,3 0 68,8 47,1 0 52,9 0 0 100 0 0 100 3209 27,5 10,8 51,5 12,5 0 87,5 0 0 100 0 0 100 0 0 100 3083 37,5 20 42,5 37,5 12,5 50 15 0 85 0 0 100 0 0 100 PC-L2 ¼ MLG 8,7 30,1 61,3 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Wilis 32,5 30,0 37,5 18,8 0 81,3 15 25 60 12,5 0 87,5 0 0 100 3209 25 10 65 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 3083 37,5 12,5 50 12,6 37,5 50 0 0 100 0 0 100 0 0 100
167 Hasil pengamatan terhadap perkecambahan
dengan eksplan embrio masak menunjukkan eksplan dapat berkecambah pada semua media dasar yang dicoba meskipun konsentrasinya diencerkan. Per-kecambahan masih berlangsung meskipun 25% lebih encer dari formula dasar dan tetap dapat memisahkan kedelai berdasarkan toleransinya terhadap kekeringan dengan eksplan embrio masak. Untuk penapisan dengan eksplan embrio muda, pengenceran media menurunkan persentase perkecambahan dan me-ningkatkan perkecambahan yang tidak normal. Ketidak-normalan kecambah diperlihatkan oleh terhambatnya pertumbuhan plumula (daun pertama), sementara pertumbuhan radikel (akar) tetap berlangsung.
KESIMPULAN
Penggunaan PEG dengan konsentrasi 10% dapat me-ngelompokkan varietas kedelai dalam kelompok peka, sedang, dan toleran dengan menggunakan eksplan embrio masak, sehingga penapisan untuk toleransi terhadap kekeringan pada plasma nutfah kedelai dapat dilakukan dengan lebih cepat dan murah.
Eksplan embrio aksis dan embrio muda sulit diguna-kan untuk penapisan karena memberidiguna-kan hasil yang beragam dengan tingkat kesulitan mengisolasinya yang tinggi.
Pengenceran media sampai 25% lebih encer dari formulasi dasar dapat dilakukan dan tetap dapat me-ngelompokkan kedelai berdasarkan toleransinya ter-hadap kekeringan.
DAFTAR PUSTAKA
Adkins S. W, R. Kunamuvatchaidah, I.D. Godwin. 1995. Somaclonal variation in rice drought tolerance and other agronomic characters. Aust. J. Bot. 45:201-209.
Dami I and H Hughes. 1995. Leaf anatomy and water loss of in vitro PEG-treated ‘valiant’ grape. Plant Cell Tissue Organ Culture. 42:179-184.
Forestry Department. 1997. Drylands development and combating desertification. Bibliographic study of experiences in China. FAO Corporate Document Repository.
Gulati, A and P K Jaiwal. 1993. Selection and characterization of mannitol-tolerant callus lines of Vigna radiate (L.) Wilczek. Plant Cell Tissue Organ Culture. 34:35-41.
Hasegawa, P M, R a Bressan, J K Zhu and H J Bohnert. 2000. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol. 51:463-499
Jensen, A.B., P.K Besk, M. Figueras, M.M. Alba, G. Pera cehta, R. Messeguer, A. Goday and M. Pages. 1996. Drought signal transduction in plants. Plant Growth Reg. 20:105-110. Krizek, D.T. 1985. Methods of inducing water stress in plant. Hort
Sci. 20:1028-1038.
Li, M, G X Wang, J Sh Lin. 2004. Calcium stimulate the adaptation cultured liquorice cells to PEG-induced water stress. Russian Journal of Plant Physiol. 51(4):518-524
Lawyer, D.W. 1970. Absorption of polyethilene glicol by plants anther effect on plant growth. New physiol. 69:501-513. Molnar, I, L Gaspar, E Sarvan, S Dulai, B Hoffman, M Molnar-Lang
and G Galiban. 2004. Physiological and morfological responses to water stress aegilops bioncalis and Triticum aestivum with differing tolerance to drought. Functional Plant Biology 31(12):1149-1159.
Paadey R, R M Agarwal, K Jeevaratnam and G L Sharma. 2004. Osmotic stress-induced alteration in rice (Oryza sativa L.) and recovery on stress release. Plant Growth regulation 42(1):79-87.
Rajashekar G, D Palquist and CA Ledbetter. 1995. In vitro screening procedure for osmotic tolerance in Prunus. Plant Cell Tissue Organ Culture. 41:159-164.
Rasanen, LA, S Saifets, K Jokinen and K Lindstrom. 2004. Evaluation of the roles of two compatible solute, glycine betaine and trehalosa for the Acacia Senegal-sinorhizobium symbiosis Plant Cell Tissue Organ Culture. 42:179-184osed to drought stress. Plant soil 260(1-2):237-251.
Santos-Diaz, MS and N Ocha-Alejo. 1994. PEG tolerant cell clones of chili pepper: growth, osmotic potentials and solute accumulation. Plant Cell Tissue Organ Culture. 37:1-8. Short, K.C. I. Warburton and A.V. Roberts. 1987. In vitro Hardening
of cultures cauliflower and chrysanthemum plantlets to humidity. Acta Hort. 2120:329-324.
Sirait, B. 2001. Evaluasi karakter morfofisiologis dan produksi galur kedelai (Glydine max (L.) Merr.) toleran aluminium yang diseleksi secara in vitro. Thesis. Program Pasca Sarjana IPB. 147p.
Specht, J.E and G. Graef. 1996. Limitations and potential of genetic manipulation of soybean In Verma, P.P.S and R.C. Shaaamaker (Eds.) Soybean: Genetic Molecular Biology and Biotechnology. C.AP. International, Wallingford.
Widoretno, W. 2003. Seleksi in vitro untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan pada kedelai (Glycine maxi L. Merr) dan karakterisasi varian somaklonal yang toleran. Disertasi. Program Pascasarjana. IPB.
