Mutasi G3316A Gen NADH Dehidrogenase 1 (ND1) mtdna sebagai Faktor Risiko Terjadinya Diabetes Melitus Tipe 2 pada Suku Bali

1

Mutasi G3316A Gen NADH Dehidrogenase 1 (ND1) mtDNA sebagai Faktor Risiko Terjadinya

Diabetes Melitus Tipe 2 pada Suku Bali

Oleh:

dr. I Wayan Surudarma, M.Si.

dr. Desak Made Wihandani, M.Kes.

dr. I Made Pande Dwipayana, Sp.PD.

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA

2015

2

DAFTAR ISI

RINGKASAN

LEMBARAN IDENTITAS DAN PENGESAHAN DAFTAR ISI

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang Masalah ... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 2

1.3. Tujuan Penelitian ... 2

1.4. Manfaat Penelitian ... 2

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 3

2.1. Mitokondria ... 3

2.2. Genetika Mitokondria ... 6

2.3. Patofisiologi Penyakit Mitokondria ... 8

2.4. Mutasi DNA Mitokondria Penyebab Diabetes Melitus ... 9

BAB III. METODE PENELITIAN 3.1. Rancangan Penelitian ... 11

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ... 11

3.3. Populasi, Sampel dan Besar Sampel ... 11

3.4. Bahan dan penyiapan mtDNA templat ... 11

3.5. Karakterisasi hasil PCR dengan enzim ApaI (RFLP) ... 12

3.6. Karakterisasi hasil PCR dengan enzim ApaI (RFLP) ... 12

3.7. Analisis Data ... 13

BAB IV. PEMBIAYAANDAN JADWAL PENELITIAN ... 14

4.1. Pembiayaan ... 14

4.2. Jadwal Penelitian ... 14

DAFTAR PUSTAKA ... 15

LAMPIRAN ... 17

3

RINGKASAN

Mutasi G3316A Gen NADH Dehidrogenase 1 (ND1) mtDNA sebagai Faktor Risiko Terjadinya Diabetes Melitus Tipe 2 pada Suku Bali

Diabetes Melitus merupakan suatu penyakit poligenik kompleks yang ditandai dengan gangguan produksi insulin atau ketidak mampuan jaringan target untuk merespon insulin.

Berbagai mutasi pada DNA mitokondria telah dilaporkan memegang peranan penting dalam pathogesis terjadinya Diabetis Melitus. Gen-gen pada DNA mitokondria manusia (mtDNA) menjadi salah satu kemungkinan penyebab diabetes melitus tipe 2 karena fosforilasi oksidatif yang terjadi di mitokondria memainkan peranan yang penting dalam sekresi insulin oleh sel β pankreas pada saat merespon peningkatan kadar glukosa dalam tubuh. Berbagai mutasi mtDNA telah dilaporkan berkaitan dengan DM diantaranya C1310T, A1382C, G1438A, A1202G, A3252G, A3256T, A3264C, A3271C, T3290C, C3303T, G3316A, T3394C, A8296G, A8344G, G11778A, A12026G, C12258A, T14577C, T14709C, dan T16189C.

Penelitian ini merupakan kasus kontrol untuk mengetahui hubungan mutasi titik G3316A gen NADH 1 Dehidrogenase (ND1) mtDNA dengan diabetes melitus tipe 2 pada suku Bali.

Pengambilan sampel dilakukan di RSUP Sanglah dengan jumlah sampel sebanyak 16 orang subyek per kelompok. Isolasi gen spesifik dari sampel darah dilakukan melalui tahapan- tahapan yang dimulai dari ekstraksi DNA, amplifikasi dengan PCR dan visualisasi DNA dengan elektroforesis gel agarose 2%. Amplifikasi Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer forward 5’GAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAG3’ (nt2826–2849) dan primer rivers 5’GATTGTTTGGGCTACTGCTCGC3’ (nt3728–3749). Pemurnian hasil PCR akan dilakukan dengan metode presipitasi etanol. Hasil PCR murni kemudian dikarakterisasi dengan enzim restriksi HaeIII.

Amplifikasi Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA dari DNA template dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer forward 5’GAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAG3’(nt2826–2849) dan primer rivers 5’GATTGTTTGGGCTACTGCTCGC3’ (nt3728–3749). Hasil amplifikasi dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dengan DNA marker dan visualisasi

4 dengan bantuan lampu ultra violet. Amplifikasi PCR menghasilkan fragmen mtDNA dengan panjang 902 pasang basa yaitu nukleotida 2826 sampai nukleotida 3728. Analisis PCR-RLFP dengan digesti enzim HaeIII terhadap produk PCR pada posisi basa 3316 dari gen ND1 mitokondria akan menghasilkan fragmen dengan panjang 322, 180, 169, 120, 97 dan 15 bp pada gen normal, sedangkan pada mutan akan menghasilkan fragmen dengan panjang 322, 266, 180, 120 dan 15 bp. Pada penelitian didapatkan mutasi G3316A DNA mitokondria ditemukan pada 1 orang dari 16 kasus DM tipe 2 sedangkan pada kontrol normal tidak ditemukan mutasi. Perhitungan Odd Rasio (OR) mendapatkan angka 2,14 yang berarti bahwa orang yang mengalami mutasi DNA mitokondria G3316A mempunyai kemungkinan lebih besar 2,14 kali untuk terkena diabetes melitus tipe 2 dibandingkan dengan orang yang tidak mengalami mutasi DNA mitokondria G3316A.

5

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Diabetes Melitus merupakan suatu penyakit poligenik kompleks yang ditandai dengan gangguan produksi insulin atau ketidak mampuan jaringan target untuk merespon insulin.

Berbagai mutasi pada DNA mitokondria telah dilaporkan memegang peranan penting dalam pathogesis terjadinya Diabetis Melitus. Mutasi gen mtDNA biasanya ditemukan pada penderita DM usia dewasa. Gene MtDNA mengkode 13 polipeptida komplek sfosforilasi oksidatif (OXPHOS) mitokondria . Polipeptida tersebut akan membentuk rantai respirasi dan ATP sintase yang fungsional setelah bergabung dengan sub unit protein yang dikode oleh DNA nukleus. MtDNA juga mengkode 22 tRNA dan dua rRNA yang penting untuk ekspresi protein dari gen mtDNA..

Gen-gen pada DNA mitokondria manusia (mtDNA) menjadi salah satu kemungkinan penyebab diabetes melitus tipe 2 karena fosforilasi oksidatif yang terjadi di mitokondria memainkan peranan yang penting dalam sekresi insulin oleh sel β pankreas pada saat merespon peningkatan kadar glukosa dan nutrien yang lainnya dalam tubuh [Kadowaki et al., 1994]. Diabetes karena mutasi ini ditandai dengan terjadinya gangguan pada sekresi insulin dan sering diikuti oleh melemahnya indera pendengaran [Malecki et al., 2001].

Berbagai mutasi mtDNA telah dilaporkan berkaitan dengan DM diantaranya C1310T, A1382C, G1438A, A1202G, A3252G, A3256T, A3264C, A3271C, T3290C, C3303T, G3316A, T3394C, A8296G, A8344G, G11778A, A12026G, C12258A, T14577C, T14709C, T16189C (Zeviani et al., 1991; Silvestri et al., 1992; Morten et al., 1993; Hirai 1996, et al. ; Suzuki et al., 1997a; Kameoka et al., 1998; Lynn et al., 1998; Poulton et al., 1998a; Bruno 1999 et al.; Ohkubo et al., 2001; Tawata et al., 1998; Tawata et al., 2000). Mutasi a G3316A ditemukan pada 3,4% pasien DM di Jepang (Odawara et al, 1996) yang menyebabkan perubahan asam amino tirosin menjadi histidin. Hal yang sama juga dilaporkan di China (Ji et al., 2001).

Penelitian mutasi ini di Indonesia pernah dilakukan di Rumah Sakit dr. Soetomo Surabaya. Penelitian tersebut menemukan frekuensi kejadian mutasi G3316A pada penderita

6 DM tipe 2 adalah 0,44%. Mutasi G3316A gen NADH dehidrogenase mtDNA di Bali belum pernah diteliti sama sekali sehingga keterkaitannya dengan DM tipe 2 di Bali juga tidak diketahui. Penelitian ini ditujukan untuk mengetahui hubungan antara mutasi G3316A gen NADH dehidrogenase mtDNA dengan DM tipe 2 pada suku Bali.

1.2. Rumusan Masalah

Dari latar belakang diatas dirumuskan masalah sebagai berikut:

- Apakah mutasi titik G3316A Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA merupakan faktor risiko terjadinya Diabetes Melitus tipe 2 pada suku Bali?

1.3. Tujuan Penelitian

Berdasarkan uraian di atas maka tujuan penelitian ini adalah:

- Untuk mengetahui apakah mutasi titik G3316A Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA merupakan faktor risiko terjadinya Diabetes Melitus tipe 2 pada suku Bali.

1.4. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian diharapkan dapat bermanfaat secara teoritis dan praktis, yaitu:

1. Teoritis

Memberikan informasi berupa data dasar hubungan mutasi G3316A Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA dengan Diabetes Melitus tipe 2 pada suku Bali.

2. Praktis

Mengetahui pola pewarisan penyakit diabetes millitus tipe 2 di Bali, sehingga faktor-faktor yang memicu penyakit dapat dihidari sejak dini.

7

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 MITOKONDRIA

Mitokondria berasal dari kata Yunanimito yang berarti benang, dan chondrion yang berarti seperti granul (butiran-butiran), sehingga dapat diartikan sebagai organela dengan rangkaian butir-butir yang tersusun seperti benang. Mitokondria merupakan organela yang unik karena memiliki DNA tersendiri dengan sifat-sifat yang spesifik pula (Wortmann, 2004).

A. Struktur Mitokondria

Mitokondria merupakan organel berupa kantung yang diselaputi oleh dua membran, yaitu membran luar dan membran dalam; sehingga mitokondria memiliki dua kompartemen, yaitu ruang antar membran (intermembrane space) dan matriks (matrix) mitokondria yang diselimuti langsung oleh membran dalam(Beal MF, 1998).Lihat gambar 1.

Gambar 1. Struktur mitokondria

Keterangan: diagram struktur tiga dimensi mitokondria

Membran luar

Membran luar mengandung protein transport yang disebut porin. Porin membentuk saluran yang berukuran relatif lebih besar di lapisan ganda lipid membran luar; sehingga

8 membran luar dapat dianggap sebagai saringan yang memungkinkan lolosnya ion maupun molekul kecil berukuran 5 kDa atau kurang, termasuk protein berukuran kecil.Molekul- molekul tersebut bebas memasuki ruang antar membran, namun sebagian besar tidak melewati membran dalam yang bersifat imper-meabel. Ini berarti bahwa dalam hal kandungan molekul kecil, di ruang antar membran bersifat ekuivalen dengan sitosol sedangkan di ruang matriks berbeda.8 Protein yang terletak pada membran luar meliputi berbagai enzim yang terlibat dalam biosintesis lipid mitokondria dan enzim-enzim yang mengubah substrat lipid menjadi bentuk lain untuk selanjutnya dimetabolisme di matriks mitokondria (Artika, 2003).

Membran dalam dan krista

Membran dalam dan matriks mitokondria terkait erat dengan aktivitas utama mitokondria yaitu terlibat dalam siklus asam trikarboksilat, oksidasi asam lemak dan pembentukan energi.Rantai respirasi terdapat dalam membran dalam ini (DiMauro, 2003).

Ruang antar membran

Ruang antar membran adalah ruang yang berada di antara membran luar dan membran dalam mitokondria. Ruang ini mengandung sekitar 6% dari total protein mitokondria dan beberapa enzim yang bekerja menggunakan ATP (adenosine triphosphate) yang tengah melewati ruang tersebut untuk memfosforilasi nukleotida lain (Sangkot M.,2003).

Matriks

Sebagian besar (sekitar 67%) protein mitokondria dijumpai pada bagian matriks.

Enzim-enzim yang dibutuhkan untuk proses oksidasi piruvat, asam lemak dan untuk menjalankan siklus asam trikarboksilat terdapat pada matriks ini (Artika, 2003).

B. Rantai respirasi

Rantai respirasi dan ringkasan jalur metabolik mitokondria digambarkan pada gambar Semua kompleks ini berada di membran dalam dan mereka dapat dicapai oleh substrat baik yang berada pada membran maupun pada matriks.Telah diketahui pula berbagai inhibitor rantai respirasi dan efek kliniknya yang dapat dianggap sebagai pengetahuan awal dari mitochondrial medicine(Sangkot M., 2003).

9 C. Metabolisme mitokondria

Fungsi utama mitokondria adalah memproduksi energi kimia dalam bentuk ATP yang akan dipergunakan untuk aktivitas seluruh sel-sel tubuh manusia. Secara garis besar, reaksi pembentukan ATP yang berlangsung di mitokondria dapat dibagi menjadi 3 tahap (Sangkot M., 2003):

a. Reaksi oksidasi piruvat (atau asam lemak) menjadi CO2. Reaksi ini terkait dengan reduksi NAD+ dan FAD menjadi NADH dan FADH2. Reaksi-reaksi ini berlangsung dalam ruang matriks mitokondria (lihat gambar 2).

b. Transfer elektron dari NADH dan FADH2 ke O2. Rentetan reaksi ini berlangsung pada membran dalam dan terkait dengan pembentukanproton motive force atau gradien elektrokimia lintas membran dalam mitokondria.

c. Pemanfaatan energi yang tersimpan dalam bentuk gradien elektrokimia untuk memproduksi ATP. Reaksi ini dikatalisis oleh kompleks enzim F0-F1 ATP sintetase yang berlokasi pada membran dalam.

Gambar 2.Jalur metabolik dalam mitokondria.

10 2.2.GENETIKA MITOKONDRIA

DNA mitokondria manusia merupakan DNA sirkuler tertutup yang berada pada matriks mitokondria yang mengandung 37 gen, dan berukuran 16569 pasang basa. Dua puluh empat gen (24) diperlukan untuk translasi mtDNA [2 RNA ribosom (rRNAs) dan 22 RNA transfer (tRNA)] dan 13 mengkode subunit rantai respirasi, dengan perincian sebagai berikut: 7 subunit untuk kompleks I [ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 DAN ND6 (ND singkatan dari NADH dehydrogenase)], 1 subunit untuk kompleks III (sitokrom b), 3 subunit untuk sitokrom oksidasi (COX1,II,III) serta 2 subunit untuk ATP sintetase. Sebagian rantai respirasi dikode oleh DNA nukleus.Genom DNA mitokondria manusia dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3.Menunjukkan genom mitokondria manusia.Dikutip dariDiMauro S, Schon E.A.

Mitochondrial Respiratory-Chain Diseases. N Eng J Med. 2003;348:2658-68.

http://www.nejm.org

Genetika mitokondria berbeda dengan hukum Mendel dalam 3 aspek utama:

diturunkan dari ibu, heteroplasmi dan segregasi mitotic (Di Mauro, 2003).

A. Diturunkan dari ibu

Secara hukum umum, semua DNA mitokondria dalam zigot berasal dari ovum.

Sehingga seorang ibu membawa mutasi mtDNA pada semua anak-anaknya, tetapi hanya anak perempuannya yang akan memindahkan mutasi tersebut pada keturunannya. Bukti baru transmisi paternal mtDNA pada otot rangka (tetapi tidak pada jaringan lain) pada pasien dengan miopati mitokondria memberikan peringatan penting bahwa sifat mtDNA yang

11 diturunkan dari ibu bukan merupakan hukum yang mutlak, tetapi tidak disangkal bahwa penyakit-penyakit yang berhubungan dengan mtDNA terutama diturunkan dari pihak ibu (Artika, 2003).

B. Heteroplasmi dan efek ambang batas (threshold effect)

Terdapat ribuan molekul mtDNA dalam tiap sel, dan secara umum terdapat beberapa mutasi patogenik mtDNA, tetapi bukan semuanya.Sehingga sel dan jaringan tercampur mtDNA normal dan mutan, keadaan ini disebut heteroplasmi.Heteroplasmi juga terdapat pada tingkat organel yaitu mitokondrion dengan mtDNA normal dan mutan yang bercampur.Pada orang normal semua mtDNA adalah identik (homoplasmi).Tidaklah mengherankan bila dengan jumlah mtDNA minimal belum terjadi disfungsi oksidatif dan belum tampak tanda klinis, ini yang disebut efek ambang batas.Tiap-tiap sel organ memiliki ambang batas tersendiri, tergantung metabolisme jaringan tersebut. Efek tersebut lebih rendah pada jaringan yang tergantung pada metabolisme oksidatif, seperti: otak, jantung, otot rangka, retina, tubulus ginjal, dan kelenjar endokrin (Sangkot M.,2003).

C. Segregasi mitotik

Redistribusi acak organela saat pembelahan sel dapat mengubah proporsi mtDNA mutan yang diterima oleh sel anak perumpuan, jika efek ambang patogenik dalam jaringan yang tidak terkena terlampaui, maka fenotip dapat juga berubah. Pada gangguan mtDNA sering berhubungannya dengan umur, jaringan yang terkena, dan variabilitas gambaran klinik (John DR, 2001)

Mutasi DNA mitokondria ternyata relatif tinggi.mtDNA secara alami dihadapkan pada faktor-faktor yang tidak menguntungkan seperti:

(a) tingginya kadar spesies oksigen reaktif sebagai produk samping metabolisme oksidatif mitokondria,

(b) terpaparnya mtDNA terhadap oksigen reaktif tersebut karena tidak adanya proteksi oleh nukleoprotein, yang berlainan dengan DNA inti sel dan

(c) tidak adanya sistem repair DNA yang efektif di dalam organela ini.

12 Karakteristik mutasi pada DNA mitokondria

a. Terjadi dengan laju tinggi

- Tidak ada mekanisme repair DNA yang efektif pada mitokondria - DNA mitokondria tidak memiliki proteksi nukleoprotein

- Produksi spesies oksigen reaktif (ROS) yang tinggi di mitokondria

b. Faktor-faktor mitokondria adanya hot spot untuk mutasi mutasi yang sama terjadi berkali-kali secara independen (seperti mutasi DM/ketulian/MELAS A3243G dan LHON G11778A).

c. Faktor di inti sel menentukan fidelitas replikasi mtDNA.

d. Ekspresi mutasi mtDNA poligenik dipengaruhi oleh faktor pemodifikasi di inti sel, lingkungan sekuens mtDNA dan faktor lingkungan.

Dikutip dariSangkot M. Mitochondrial Medicine: Perspektif ke Depan. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed. Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijman. Jakarta. 2003. 1-17.

3.3.PATOFISIOLOGI PENYAKIT MITOKONDRIA

Dalam tiap-tiap sel, mitokondria dapat disamakan dengan mesin mobil. Mesin biologi yang kecil ini mengkombinasikan makanan yang kita makan dengan oksigen untuk memproduksi energi bagi kelangsungan hidup. Energi yang dibentuk oleh mitokondria disimpan dalam bentuk zat kimia yang disebut adenosine triphosphate (ATP).12,14 Selain memproduksi energi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, mitokondria juga terlibat dalam berbagai aktivitas yang penting seperti memproduksi hormon steroid dan membangun blok DNA. Adanya defek pada bagian mitokondrion yang disebut rantai respirasi atau rantai transport elektron akan menyebabkan miopati mitokondria yang melibatkan otot, dan bila melibatkan otak disebut ensefalomiopati mitokondria. Proses yang terjadi tersebut menimbulkan gangguan suplai energi, timbunan sekunder produk toksik seperti radikal bebas dan asidosis laktat, atau kombinasi dari kedua keadaan tersebut (Hesterlee, 2004). Bila komponen kunci rantai respirasi dalam mitokondria hilang atau terjadi kerusakan maka akan terjadi proses yang saling berkelanjutan. Peristiwa tersebut dapat terjadi dalam dua tahap yaitu;

a. Yang pertama terjadi adalah tidak terbentuk elektron. ATP tidak terbentuk secara efisien dan sel kehilangan energi untuk melakukan fungsi normal.

13 b. Kedua, semua dari tahap-tahap sesudahnya menjadi terhenti, selanjutnya sering

menimbulkan bahan kimia abnormal yang akan memproduksi bahan toksik. Produk tersebut adalah radikal bebas dan metabolik yang berlebihan seperti asam laktat yang dalam jumlah besar akan membahayakan.Radikal bebas adalah molekul reaktif yang dapat merusak DNA dan membran sel melalui jalur oksidasi. Normalnya, rantai respirasi mitokondria membuat radikal bebas dalam jumlah yang rendah selama proses pembuatan ATP. Bila terdapat malfungsi pada rantai respirasi, maka produksi radikal bebas meningkat. Radikal bebas ini kemudian menyebkan kerusakan lebih lanjut mtDNA, yang akan mengakibatkan "vicious cycle" timbulnyakerusakan dan produksi radikal bebas. Tidak jelas berapa besar peranan pembentukan radikal bebas ini dapat menyebabkan atau memperburuk keadaan sehingga terjadi gejala-gejala penyakit mitokondria.

3.4. MUTASI DNA MITOKONDRIA PENYEBAB DIABETES MELITUS

Secara klinis, penyakit DM awalnya didominasi oleh resistensi insulin yang disertai defect fungsi sekresi. Tetapi, pada tahap yang lebih lanjut, hal itu didominasi defect fungsi sekresi yang disertai dengan resistensi insulin.

Kaitannya dengan mutasi DNA mitokondria yakni karena proses produksi hormon insulin sangat erat kaitannya dengan mekanisme proses oxidative phosphorylation (OXPHOS) di dalam sel beta pankreas. Proses pengeluaran insulin dalam tubuhnya mengalami gangguan sebagai akibat dari peningkatan kadar glukosa darah. Mitokondria menghasilkan adenosin trifosfat (ATP). ATP yang dihasilkan dari proses OXPHOS ini mengalami peningkatan.

Peningkatan kadar ATP tersebut otomatis menyebabkan peningkatan beberapa senyawa kimia yang terkandung dalam ATP. Peningkatan tersebut antara lain yang memicu tercetusnya proses pengeluaran hormon insulin.

Berbagai mutasi mtDNA telah dilaporkan berkaitan dengan DM diantaranya C1310T, A1382C, G1438A, A1202G, A3252G, A3256T, A3264C, A3271C, T3290C, C3303T, G3316A, T3394C, A8296G, A8344G, G11778A, A12026G, C12258A, T14577C, T14709C, T16189C (Zeviani et al., 1991; Silvestri et al., 1992; Morten et al., 1993; Hirai 1996, et al. ; Suzuki et al., 1997a; Kameoka et al., 1998; Lynn et al., 1998; Poulton et al., 1998a; Bruno 1999 et al.; Ohkubo et al., 2001; Tawata et al., 1998; Tawata et al., 2000). Mutasi a G3316A

ditemu peruba al., 20

K pada perkem mende episod terjadi akan m akan m

Gamb

ukan pada 3 ahan asam am 001).

Kalangan kli DM. Muta mbangannya erita DM. Pe de. Hal itu te

i karena mak makin renda meningkat ju

ar 4. Mutasi

3,4% pasien mino tirosin

inis menyeb asi ini terle a, terkadang enyakit yang elah diidentif kin tinggi pr ah dan defek umlahnya bil

i pada Genom

n DM di Je n menjadi hi

butnya sebag etak pada para pende g menyertai fikasi sebaga roporsi sel m k fungsi sekr

la penderita

m Mitokond

epang (Oda istidin. Hal y

gai mutasi A gen penya erita DM me

itu antara la ai akibat dar mutan pada s resi makin b

DM itu men

dria Manusia

awara et al, yang sama ju

A3243G yan andi ribo n

enderita pen ain tuli senso ri mutasi DN sel beta pan

erat. Prevale nderita penya

a yang diketa

1996) yan uga dilapork

ng merupaka nucleid acid nyakit lainny oris, epileps NA pada mit nkreas maka ensi mutasi akit penyerta

ahui menyeb

ng menyeba kan di China

an mutasi k d (tRNA).

ya sebagai a si, dan stroke

tokondria. H fungsi OXP tersebut bias a tadi.

babkan peny

14 abkan (Ji et

kausal Pada akibat e like Hal ini PHOS sanya

yakit.

15

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1.Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan kasus kontrol untuk mengetahui hubungan mutasi titik G3316A gen NADH 1 Dehidrogenase (ND1) mtDNA dengan diabetes melitus tipe 2 pada suku Bali.

3.2.Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Biokimia FK UNUD selama 10 bulan yang berlangsung mulai bulan Agustus 2014 sampai dengan Juni 2015. Pengambilan sampel dilakukan di RSUP Sanglah.

3.3.Populasi, Sampel dan Besar Sampel

a. Kasus adalah penderita Diabetes Melitus suku Bali yang terdiagnosis diabetes melitus (DM) tipe 2 yang berumur lebih dari 50 tahun, sedangkan kontrol adalah bukan penderita yang memiliki karakteristik yang sama terhadap kasus berdasarkan metode matching.

b. Besar sampel ditentukan dengan rumus Frederer : (t-1)(r-1) ≥ 15 Ket : t = jumlah perlakuan

r = jumlah ulangan

Pada penelitian ini : t = 2 kelompok Maka besar sampel yaitu :

(2-1)(r-1) ≥ 15 1(r-1) ≥ 15 (r-1) ≥15

r ≥16

Dengan menggunakan rumus tersebut diperoleh sampel minimal sebanyak 16 orang subyek per kelompok. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara consecutive sampling.

16 3.4. Definisi Operasional

Diagnosis diabetes Melitus tipe 2 pada penelitian ini ditentukan dengan kriteria sebagai berikut:

- Umur lebih dari 50 tahun

- Kadar Gula darah puasa >= 126 mg%

- Kadar gula darah sewaktu >= 200 mg%

- Kadar Gula darah 2 jam PP >= 200 mg%

- Kadar HB A1C > 6,5 %

3.5.Bahan dan penyiapan mtDNA templat

MtDNA templat disiapkan menggunakan metode ekstraksi DNA dengan Purelink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen)

Pemilihan sel darah sebagai sampel dikarenakan sel ini mempunyai jumlah organel mitokondria yang cukup banyak [Thorpe, 1984]. Alasan lainnya adalah karena sampel darah relatif mudah untuk diambil dan telah digunakan sebagai sampel pada penelitian yang dilakukan oleh Ohkubo et al.[2001], Lee et al. [1997], dan Malecki et al. [2001] untuk menganalisis mutasi gen mtDNA yang berhubungan dengan diabetes melitus di Jepang, Korea, dan Polandia.

3.6.Amplifikasi mtDNA secara in vitro (PCR)

Amplifikasi Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNAdilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer forward 5’GAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAG3’(nt2826–2849) dan primer rivers 5’GATTGTTTGGGCTACTGCTCGC3’ (nt3728–3749). Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA Polymerase 1 unit, mtDNA templat hasil lisis, sepasang primer masing-masing 1 μM, bufer PCR 10x (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM, Triton x-100 0,1%), dNTP 200 μM, MgCl2 2 μM dan ddH2O steril. Proses PCR akan dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler 35 siklus. Tahap awal PCR adalah denaturasi awal yang akan dilakukan pada suhu 94^oC selama 5 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu denaturasi pada suhu 94^oC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 56^oC selama 1 menit, dan perpanjangan primer (extension) pada suhu 72^oC selama1 menit. Akhir dari semua siklus dilakukan

17 tambahan proses extension pada suhu 72^oC selama 10 menit [Zhang et al., 2001]. Hasil dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dengan DNA marker dan visualisasi dengan bantuan lampu ultra violet.Amplifikasi akan menghasilkan fragmen mtDNA dengan panjang 902 pasang basa (nt 2826 – nt 3728).

3.7.Karakterisasi hasil PCR dengan enzim HaeIII (RFLP)

Pemurnian hasil PCR akan dilakukan dengan metode presipitasi etanol [Sambrook, et al., 1989]. Hasil PCR murni akan dikarakterisasi dengan enzimrestriksi HaeIII (New England Biolabs, Beverly, Mass, USA). Hasil restriksi akan dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) dengan DNA marker dapat dilihat secara visual dengan bantuan lampu ultra violet.

Enzim restriksi HaeIII digunakan untuk mengetahui adanya.mutasi G3316A Gen NADH dehidrogenase 1 (ND1) karena mempunyai sisi pengenalan nukleotida GGCC.Tidak terpotongnya fragmen gen NADH dehidrogenase 1 (ND1) oleh enzim restriksi HaeIII menunjukkan adanya mutasi G3316A pada sampel tersebut. Hal ini terjadi karena mutasi G3316A menyebabkan hilangnya sisi pengenalan enzim restriksi HaeIII pada Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA.

3.8. Analisis Data

Resiko relatif dapat diketahui dengan menghitung Odd Ratio.

Hasil analisis akan disajikan secara deskriptif dalam bentuk tekstular, tabel dan grafik.

Perhitungan ODD Ratio (OR)

case control

Exposure + a b a+b Exposure – c d c+d

a+c b+d

^a.d

ODD RATIO (OR) = --- b.c

18

BAB IV.

HASIL PENELITIAN

4.1. Pengambilan Sampel

Sampel yang diambil sebagai templat mtDNA adalah sel darah vena dari 16 subjek kasus penderita diabetes melitus tipe 2 dan 16 orang kontrol yang tidak menderita DM tipe 2 di Rumah Sakit Sanglah Denpasar. Sampel yang diambil adalah sampel darah yang diambil dari vena medianan kubiti sebanyak 3 cc. Pemilihan sel darah sebagai sampel dikarenakan sel ini mempunyai jumlah organel mitokondria yang cukup banyak selain sel-sel yang lain seperti sel epitel, sel akar otot, sel ekor sperma dan sel akar rambut. Alasan lainnya adalah karena sampel darah relatif mudah untuk diambil dan telah digunakan sebagai sampel pada penelitian sebelumnya untuk menganalisis mutasi G3316A mtDNA yang berhubungan dengan DM.

4.2. Ekstraksi DNA

Isolasi DNA dengan menggunakan kit ekstraksi asam nukleat GF-1 Vivantis.

Gambar 5. Hasil Isolasi DNA. Lajur M = Marker, lajur 1-8 hasil isolasi DNA

19 4.3. Amplifikasi DNA

Amplifikasi Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNAdilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer forward 5’GAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAG3’(nt2826–2849) dan primer rivers 5’GATTGTTTGGGCTACTGCTCGC3’ (nt3728–3749). Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA Polymerase 1 unit, mtDNA templat hasil lisis, sepasang primer masing-masing 1 μM, bufer PCR 10x (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM, Triton x-100 0,1%), dNTP 200 μM, MgCl2 2 μM dan ddH2O steril. Proses PCR akan dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler 35 siklus. Tahap awal PCR adalah denaturasi awal yang akan dilakukan pada suhu 94^oC selama 5 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu denaturasi pada suhu 94^oC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 56^oC selama 1 menit, dan perpanjangan primer (extension) pada suhu 72^oC selama1 menit. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan proses extension pada suhu 72^oC selama 10 menit. Hasil dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dengan DNA marker dan visualisasi dengan bantuan lampu ultra violet.Amplifikasi akan menghasilkan fragmen mtDNA dengan panjang 902 pasang basa (nt 2826 – nt 3728).

Gambar 6. Produk PCR 900 bp. Lajur 1 marker, lajur 2-12 produk PCR

20 4.4. Karakterisasi hasil PCR

Hasil PCR murni akan dikarakterisasi dengan enzimrestriksi HaeIII. Hasil restriksi akan dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) dengan DNA marker dapat dilihat secara visual dengan bantuan lampu ultra violet. Mutasi G3316A menyebabkan hilangnya sisi pemotongan enzim restriksi HaeIII pada genGen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA. Tidak terpotongnya fragmen gen NADH dehidrogenase 1 (ND1) oleh enzim restriksi HaeIII menunjukkan adanya mutasi G3316A pada sampel tersebut.

Mutasi G3316A DNA mitokondria ditemukan pada 1 orang dari 16 kasus DM tipe 2 (6%) sedangkan pada kontrol normal tidak didapatkan mutasi. Odd Rasio (OR) yang didapatkan adalah 2,14.

Gambar 7. Analisis PCR-RLFP dengan digesti enzim HaeIII terhadap produk PCR pada posisi basa 3316 dari gen ND1 mitokondria yg dipisahkan dengan gel agarosa 3,5 %. Pada Kasus Normal mengandung fragmen 322, 180, 169, 120, 97 dan 15 bp, sedangkan pada mutan mengandung fragmen 322, 266, 180, 120 dan 15 bp.

21

BAB V.

PEMBAHASAN

Sampel yang diambil sebagai templat mtDNA adalah sampel darah vena. DNA template diisolasi dengan menggunakan kit ekstraksi asam nukleat GF-1 Vivantis. Amplifikasi Gen NADH dehygrogenase 1 (ND1) mtDNA dari DNA template dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer forward 5’GAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAG3’(nt2826–2849) dan primer rivers 5’GATTGTTTGGGCTACTGCTCGC3’ (nt3728–3749). Hasil amplifikasi dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dengan DNA marker dan visualisasi dengan bantuan lampu ultra violet. Amplifikasi PCR menghasilkan fragmen mtDNA dengan panjang 902 pasang basa yaitu nukleotida 2826 sampai nukleotida 3728.

Posisi basa 3316 dalam gen mitokondria terletak pada daerah yang mengkode sub unit NADH Dehidrogenase (ND1). Mutasi G3316A merupakan mutasi missence yang menyebabkan perubahan kodon GCC menjadi ACC sehingga juga menyebabkan perubahan asam amino Alanin menjadi Threonin. Kehadiran mutasi G3316A ditentukan dengan restriksi hasil PCR dengan enzim restriksi HaeIII, PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Analisis PCR-RLFP dengan digesti enzim HaeIII terhadap produk PCR pada posisi basa 3316 dari gen ND1 mitokondria akan menghasilkan fragmen dengan panjang 322, 180, 169, 120, 97 dan 15 bp pada gen normal, sedangkan pada mutan akan menghasilkan fragmen dengan panjang 322, 266, 180, 120 dan 15 bp.

Pada penelitian didapatkan mutasi G3316A DNA mitokondria ditemukan pada 1 orang dari 16 kasus DM tipe 2 sedangkan pada kontrol normal tidak ditemukan mutasi. Perhitungan Odd Rasio (OR) mendapatkan angka 2,14 yang berarti bahwa orang yang mengalami mutasi DNA mitokondria G3316A mempunyai kemungkinan lebih besar 2,14 kali untuk terkena diabetes melitus tipe 2 dibandingkan dengan orang yang tidak mengalami mutasi DNA mitokondria G3316A.

22

BAB VI.

KESIMPULAN

1. Amplifikasi PCR menghasilkan fragmen mtDNA dengan panjang 902 pasang basa yaitu nulkeotida 2826 sampai nukleotida 3728.

2. Analisis PCR-RLFP dengan digesti enzim HaeIII terhadap produk PCR pada posisi basa 3316 dari gen ND1 mitokondria menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 322, 180, 169, 120, 97 dan 15 bp pada gen normal, sedangkan pada DNA mitokondria yg mengalami mutasi G3316A akan menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 322, 266, 180, 120 dan 15 bp.

3. Mutasi G3316A DNA mitokondria ditemukan pada 2 orang dari 16 kasus DM tipe 2 sedangkan pada kontrol hanya ditemukan 1 orang.

4. Perhitungan Odd Rasio (OR) mendapatkan angka 2,14 yang berarti bahwa orang yang mengalami mutasi DNA mitokondria G3316A mempunyai kemungkinan lebih besar 2,14 kali untuk terkena diabetes melitus tipe 2 dibandingkan dengan orang yang tidak mengalami mutasi DNA mitokondria G3316A.

23

DAFTAR PUSTAKA

1. Artika I.M, Struktur, Fungsi, dan Biogenesis. Mitokondri. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed.

Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijkman. Jakarta. 2003. 19-51.

2. DiMauro S, Schon E.A. Mitochondrial Respiratory-Chain Diseases. N Eng J Med. 2003 ; 348 : 2658-68. http://www.nejm.org .

3. Dorland W.A.N. Kamus Kedokteran Dorland Edisi 29. EGC. Jakarta; 2002 : 442,1363.

4. Froguel, P., Hager, J. 1995. Human diabetes and obesity: tracking down the genes.

Tibtech. 13: 52-55.

5. Hart, L.M., Lemkes, H.H., Heine, R.J., et al. 1994. Prevalence of maternally inherited diabetes and deafness in diabetic population in the Netherlands. Diabetologia. 37: 1169- 70.

6. Hesterlee S. Mitochondrial Disease in Perspective Symptoms, Diagnosis and Hope for The Future. http://www.mitoresearch.org/Quest_6_5.htm

7. Hesterlee S. Mitochondrial Myopathy: An Energy Crisis in The Cells.

http://www.mitoresearch.org/Quest_6_4a.htm

8. John DR, Disease Caused by Genetic Defect of Mitochondria, in : Fauci A.S, Brunwald E, Isselbacher K.J. et all, ed. Harrison's Principle of Internal Medicine 15th. McGraw-Hill.

New York. 2001; 1: 2451-2457.

9. Kadowaki, T., Kadowaki, H., Mori, Y., Tobe, K., Sakuta, R., Suzuki, Y., Tanabe, Y., Sakura, H., Awata, T., Goto, Y., Hayakawa, T., Matsuoka, K., Kawamori, R., Kamada, T., Horai, S., Nonaka, I., Hagura, R., Akanuma, Y., Yazaki, Y. 1994. A subtype of diabetes mellitus associated with a mutation of mitochondrial DNA. NEJM. 330: 962-968.

10. Lee, H.C., Song, Y.D., Li, H., Park, J.O., Suh, H.C., Lee, E., Lim, S., Kim, K., Huh, K.

1997. Mitochondrial gene transfer ribonuclaic acid (tRNA)^Leu(UUR) 3243 and tRNA^Lys 8344 mutations and diabetes mellitus in Korea. The Journal of Clinical Endocrinology &

Metabolism. 82 (2): 372-374.

11. M. Sangkot. Kelaian Mitokondria, Diagnosis dan Pengobatan. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed.

Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijman. Jakarta. 2003. 71-89.

12. Maksum, I.P. 2002. Tiga mutasi spesifik yang lestari daerah D-loop DNA mitokondria manusia indonesia pada tujuh generasi segaris keturunan ibu. Tesis. Bidang Studi Magister Kimia Program Pascasarjana ITB.

13. Malecki, M., Klupa, T., Wanic, K., Frey, J., Cyganek, K., Sieradzki, J. 2001. Search for mitochondrial A3243G tRNA^Leu mutation in Polish patients with type 2 diabetes mellitus.

Med Sci Monit. 7(2): 246-250.

24 14. Ng, M.C., Lee, S.C., Ko, G.T.C., Li, J.K.Y., So, W.Y., Hashim, Y., Barnett, A.H.,

Mackay, I.R., Critchley, J.A.J.H., Cockram, C.S., Chan, J.C.N. 2001. Familial early-onset type 2 diabetes in China patients. Diabetes Care. 24: 663-671.

15. Noer, A.S., Martasih, F., Mulyani, S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M.1994.

Analisis variasi urutan nukleotida D-loop mtDNA manusia dari beberapa daerah di Indonesia, Proc. 1^st joint seminar on chemistry UKM-ITB, Malaysia.

16. Ohkubo, K., Yamano, A., Nagashima, M., Mori, Y., Anzai, K., Akehi, Y., Nomiyama, R., Asano, T., Urae, A., Ono, J. 2001. Mitochondrial gene mutations in the tRNA^Leu(UUR) region and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan. Clinical Chemistry. 47:

1641-1648.

17. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, vol. 1,2,3,. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

18. Sangkot M. Mitochondrial Medicine: Perspektif ke Depan. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed.

Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijman. Jakarta. 2003. 1-17.

19. Thorpe, N.D. 1984. Cell biology. John Wiley & Sons Inc. New York Urata, M.,

Wakiyama, M., Iwase, M., Yoneda, M., Kinoshita, S., Hamasaki, N., Kang, D. 1998. New sensitive method for the detection of the A3243G mutation of human mitochondrial deoxyribonucleic acid in diabetes mellitus patients by ligation mediated polymerse chain reaction. Clinical Chemistry. 44 : 2088-2093.

20. Wortmann RL. Metabolic diseases of muscle, in: Koopman WJ, ed. Arthritis and Allied Conditons, 4^th ed , volume two. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2001: 2416- 2434.

21. Zhang yong, Li Jianfeng, Wang fengyan. 2001. The study of A3243G and G13513A mitochondrial DNA pointmutation in patients with cerebral infartion, Chin Med J., 114 (10): 129-135.