Metode de analiză a amidonului, enzimelor și hidrolizatelor de amidon

(1)

Metode de analiză a amidonului,

enzimelor și hidrolizatelor de amidon

Cercetător post-doctorand Dr. Ing. Monica MIRONESCU

Tutore Prof. Dr. Biol. Letiția OPREAN

(2)

Obţinerea produşilor de bioconversie

enzimatică a amidonului

Amidon

Bioconversia enzimatică

Hidrolizate de amidon (siropuri de glucoză, maltoză)

Lichefiere Enzime de lichefiere Gelatinizare

Zaharificare

Amidon lichefiat / Maltodextrine

Enzime de zaharificare

Enzime de inversie

Surse de amidon:

Cartof, porumb, grâu ...

Reziduuri alimentare

(3)

Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

(4)

Metode de analiză a amidonului

• Determinarea caracteristicilor fizico-chimice;

– Umiditatea, pH-ul, conținutul amidon, proteine, lipide, cenușa, caracterul reducător;

– Determinarea capacităţii de îmbibare (de reținere a apei) a amidonului;

– Determinarea solubilităţii amidonului la diverse temperaturi; • Comportamentul reologic a amidonului și determinarea capacităţii

amidonului de formare a gelului;

• Analiza cromatografică a amidonului;

(5)

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

0 1 2 3 4 5 6 7 8 pH la 20°C porumb cartof 0 2 4 6 8 10 12 Umiditate, % % porumb cartof

(6)

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 Cenuşă, % % porumb cartof 87 87,5 88 88,5 89 89,5 90 90,5 91 Amidon, % % porumb cartof

(7)

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Caracter reducător, % % porumb cartof

(8)

Capacitatea de îmbibare a amidonurilor

Capacitatea de îmbibare, % Amidon 50o_C ₆₀o_C ₈₀o_C ₉₀o_C Porumb 2,2 ± 0,2 2,9 ± 0,16 11,9 ± 0,12 15,3 ± 0,18 Cartof 3,0 ± 0,15 18,0 ± 0,15 36,5 ± 0,14 100 -0,08

(9)

Comportamentul reologic

• Curba de viscozitate

104 103 102 101 100 10-1 10-2 10-3 η, Pa. s T, °C 100 90 80 70 60 50 40 30 20 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Time, s I II IV V III

(10)

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 Pa·s η 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 °C T 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 s 1.000 Zeit t Cerestar C*Gel Anton Paar GmbH Cerestar 25% 75°C 30s-1 1 ST 24 η Viskosität T Temperatur Cerestar 25% 75°C 30s-1 2 ST 24 η Viskosität T Temperatur Cerestar 25% 75°C 30s-1 3 ST 24 η Viskosität T Temperatur

(11)

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104 Pa·s η 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 °C T 0 200 400 600 800 s 1.000 Zeit t Cerestar C*Gel Anton Paar GmbH Cerestar 25% 75°C 30s-1 2 ST 24 η Viskosität T Temperatur

C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1 ST 24

η Viskosität T Temperatur

η Viskosität

T Temperatur

(12)

Măsurători dinamice de viscozitate

10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 Pa G' G'' 10-2 0,1 1 10 102 103 Pa·s |η*| 10-2 10-1 100 101 1/s 102 Kreisfrequenz ω Rheoplus Anton Paar GmbH

C*Tex 40% freq sweep winkel 0,5 2 CP 50-2

G' Speichermodul

G'' Verlustmodul

|η*| Betrag(Viskosität)

Remy B7 40% freq sweep winkel 0,5 1 CP 50-2

G' Speichermodul G'' Verlustmodul |η*| Betrag(Viskosität)

C*Gel 50% freq sweep winkel 0,5 7 CP 50-2

G' Speichermodul

G'' Verlustmodul

(13)

SEC

Analiza cromatografică a amidonului prin SEC

Detaliu separare

Separare după volumul hidrodinamic

V

_h

= f( Masa moleculară,

conformaţie)

V

_h

= [η]*M

- Coloana umplută cu un material (faza statică) - Eluentul (faza mobilă)

(14)

SEC a amidonului de porumb

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Elution time, min.

R I out put s igna l ( vol t) Ib 1b 100 80 60 40 20 0 -20 IIb IIIb IVb

Caracteristicile metodei: eluent DMSO; vol. injecţie 50 µl; temperatura 60o_{C; rata}

(15)

Analiza microscopică a amidonului

(16)

Analiza microscopică a amidonului

30o_C ₆₀o_C ₇₀o_C

(17)

Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

(18)

Metode de analiză a enzimelor

amilolitice

• Metode de det. a activităţii enzimatice

– Principiul general de determinare: dozarea

substratului rămas sau a produşilor formaţi

(19)

Activitatea enzimatică

• UI =numărul de micromoli de substrat transformat sau de

produs rezultat pe minut în condiţii bine definite.

– când substratul este amidon (cu MM nedefinită), se produce

un amestec de oligozaharide

UI : numărul de micromoli de legături

hidrolizate pe minut.

(20)

Det. numărului grupărilor reducătoare

• A- metode colorimetrice;

• B- metode cromatografice;

• C- metode enzimatice;

• D- metode fizice;

(21)

Det. numărului grupărilor reducătoare

prin metode colorimetrice

• Metode ce folosesc 3 reactivi:

– cupru alcalin

– fericianură alcalină

– 3,5 dinitrosalicilat alcalin (Metoda Miller)

• Tb. specificat sustratul folisit pt. det. activităţii enzimei

:

– amidon nativ, amidon solubil, amiloză, dextrine limită

– compuşi speciali: pentazaharidul substituit la ambele capete cu indol şi naftalen (INdp5)

(22)

Det. numărului grupărilor reducătoare

prin metode colorimetrice

• Determinarea activităţii enzimatice la α-amilaze

cu micrometoda cu cupru 2,2” bicinchoninate

(Yook and Robyt, 2002)

– Substrat: amidon

– Citirea absorbţiei la 570 nm – Etalon: maltoza

(23)

Det. numărului grupărilor reducătoare

prin metode colorimetrice

• Determinarea activităţii α-amilazei exprimată în

Kilo Novo unit (KNU)

(Legin,1998)

– Substrat: p-nitrofenil α-D–glucopiranozid (pNPG)

– măsurarea la 405 nm a p-nitrofenolului (pNP) eliberat de către enzimă.

– O unitate de activitate α-glucozidazică = cantitatea de enzimă care eliberează un µmol de pNP pe minut.

(24)

Det. numărului grupărilor reducătoare

prin metode fizice

• Determinarea numărului de legături hidrolizate prin

măsurări de osmolaritate

(Marchal,1999)

– Echivalentul de Dextroză (DE) :

DE= MM

_glucoză

x 100 / MM

_{medie_ hidrolizat de amidon}

– DE teoretic: DE= 0,18 x100/(dwkgapă / osm)

– Măsurarea osmometrică:

(

)(

)

(

)

(

₀ ₀

)

3 0 0

1

10

18

1

18 dw

osm

dw

osm

DE

m o m

−

⋅

+

−

=

₋

(25)

Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

(26)

Metode fizice de analiză a amidonurilor

Siropuri de hidrolizate de amidon

cu valori DE diferite Unghiul de rotaţie specifică

15,1 162,8 18,8 168,3 25,2 159,8 32,8 152,6 36,7 146,8 41,8 139,9 48,8 130,0 55,2 105,8 67,2 97,0

(27)

Met. chimice de analiză a amidonurilor

• Determinarea echivalentului dextroză DE

folosind metoda Luff -Schoorl

2Cu2+_{O + R –} _CHO _Cu+ 2O + R - COOH 2Cu2+_SO 4 + 4KI- 2 Cu+I + I02 + 2K2SO4 l0 2 + 2 Na2S-42O3 2 Na2S-64O6 + 2 NaI

(28)

-0 5 10 15 20 25 30 35 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Saccharose D-Glucose D-Maltose Dextran 5000 Dextran 50.000 Dextran 150.000 Dextran Blau Pullulan Xanthan DO C-Detek tor si gn al e Elutionsvolumen in mL

Timpul de eluţie, min.

D-Glucoza D-Maltoza Zaharoza Dextran 5x103_Da Dextran 5x104_Da Dextran 1,5x105_Da Dextran 106_Da Pullulan 106_Da Xanthan 1,2x106 _Da In te ns it at ea s em na lul ui DOC 0 5 10 15 20 25 30 35 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 5 10 15 20 25 30 35 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Saccharose D-Glucose D-Maltose Dextran 5000 Dextran 50.000 Dextran 150.000 Dextran Blau Pullulan Xanthan DO C-Detek tor si gn al e

Elutionsvolumen in mL_{Timpul de eluţie, min.}

D-Glucoza D-Maltoza Zaharoza Dextran 5x103_Da Dextran 5x104_Da Dextran 1,5x105_Da Dextran 106_Da Pullulan 106_Da Xanthan 1,2x106 _Da In te ns it at ea s em na lul ui DOC

Metode cromatografice de analiză a

amidonurilor: SEC

Cromatograma obţinută la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi monozaharide cu mase moleculare diferite. (Mironescu şi colab., 2004)

Condițiile de lucru:

‒eluent apa+tampon fosfat;

‒rata curgere 0,1 ml/min;

‒coloană TSK 50S

(29)

SEC

y = -575376x + 8E+06 R2 = 0,8684 5,0E+04 2,5E+05 4,5E+05 6,5E+05 8,5E+05 1,1E+06 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14

Timpul de retenţie, min.

Ma sa mo le cu la ră . D a y = -1430,7x + 29132 R2 = 0,9899 0,0E+00 1,0E+03 2,0E+03 3,0E+03 4,0E+03 5,0E+03 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21

Timpul de retenţie, min.

Ma sa mo le cu la ră , D a B A

Curbele etalon obţinute la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi

monozaharide cu mase moleculare diferite. A) Compuşi cu masă moleculară mare.

(30)

Det. DE și DP prin HPLC

• DE = DP1 + 0,63

.

_{DP2 +}

0,4

.

_{DP3 + 0,18}

.

_DP4

+

Caracteristicile metodei: eluent apă; vol. injecţie 100 µl; temperatura 96o_{C; rata}

de curgere eluent 0,5 ml/min (Mironescu et al., 2007)

DP1 DP2

DP3 DP4+

(31)