Terdapat 4 jenis utama teknik HPLC, yaitu jenis HPLC fase normal [Normal-Phase Chromatography (NP)], jenis HPLC fase terbalik [Reversed-Phase HPLC ( RP HPLC, RPLC)], jenis HPLC penukar Ion [ Ion-Exchange Chromatography (IEC)] dan terakhir jenis HPLC Size-Exclusion Chromatography (SEC).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
yang lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.
Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang berbeda fasanya (fasa diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fasa (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fasa diam akan bergerak lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:
Keunggulan HPLC diantaranya adalah:
a. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
b. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
c. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi seperti polimer.
Jenis-jenis kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) yaitu : a. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar. Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut juga kromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu : 1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-solut bervariasi.
3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik. 5) Lebih ekonomis.
d. Kromatogarfi penukar ion
e. Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih.
Di bawah ini beberapa komponen-komponen KCKT secara umum, antara lain : a. Eluen (pelarut)
Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan larutan yang digunakan untuk KCKT haruslah terbebas dari partikel-partikel dari gas/udara. Hal ini dikarenakan:
1) Adanya partikel dalam larutan bisa terbawa masuk ke dalam pompa, hal ini dapat mengakibatkan tersumbatnya aliran pelarut tersebut.
2) Udara yang masuk ke dalam pompa dapat mengganggu kestabilan pemompaan dan jumlah volume tetap yang dipakai akan terganggu.
3) Selain itu pada kolom dan detektor akan mengalami gangguan.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu : 1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan detektor.
b. Sistem Pemompaan
Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan : 1) Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
2) Keluaran yang bebas denyut
3) Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 – 10 ml/menit
4) Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik 5) Tahan terhadap korosi.
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu : 1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.
c. Injeksi sampel
Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat menyebabkan pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas. Sebagai akibatnya, volume injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 μl.
Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringe yang digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi. Aliran dihentikan sementara saat injeksi dan dikembalikan setelah sampel masuk ke aliran fasa gerak.
Metode pemasukkan sampel yang paling umum digunakan adalah dengan menggunakan sampling loop. Seringkali disatukan dalam sistem KCKT dengan kapasitas beragam 0,5 hingga 500 μl (Skoog et al., 1998)
d. Kolom KCKT
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 – 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 μm. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 – 10 μm terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
e. Detektor
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10-8 hingga 10-15 gram zat
terlarut per pembacaan
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi 4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT : 1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi. Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 – 10 μl dengan panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa
