Volume 2, No. 2, Desember 2009 124
Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker
ribu-lose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene
Tri Widayat, Dyah Subositi
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbangkes, Departemen Kesehatan
Jl. Lawu, Tawangmangu, Karanganyar, Jawa tengah
ABSTRAK
Buah makassar (Brucea javanica) adalah salah satu tanaman obat yang dikoleksi Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu. Salah satu aspek dari tanaman obat tersebut yang datanya belum terkoleksi di B2P2TO-OT adalah kekerabatan. Oleh karena itu, tujuan dari studi kekerabatan B. javanica adalah untuk mengetahui hubungan kekerabatan buah B.javanica
berdasarkan penanda molekuler gen ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase (rbcL). Hubungan kekera-batan tersebut dapat dilihat dari pohon filogeni yang dkonstruksi berdasarkan sequence nukleotida pada rbcL.
Sequence rbcL diperoleh dari National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan aligment sequence un-tuk konstruksi pohon filogenetik menggunakan program ClustalW yang diakses dari DNA Data Bank of Japan
(DDBJ) secara online. Pohon filogenetik menunjukkan bahwa B. javanica berkerabat dengan beberapa spesies tanaman anggota familia Anacardiaceae.
Kata kunci:Brucea javanica, filogenetik, rbcL
ABSTRACT
Buah makassar (Brucea javanica) is one of medicinal plant collections in Medicinal plant and Traditional Medi-cine Research Center (B2P2TO-OT) Tawangmangu. Phyllogenetic relationship data of B. javanica is important in-formation as a database for further research. The objective of this study was to provide phylogenetic relationship of B. javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene(rbcL). The rbcL sequence in this research was taken from National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the sequence was aligned by using ClustalW program to construct phylogenetic tree. The result showed that B. javanica has a closed relationship with some species of Anacardiaceae.
Volume 2, No. 2, Desember 2009 125 PENDAHULUAN
Buah Makassar (Brucea javanica) merupakan salah satu jenis tanaman obat yang
ditanam di kebun koleksi Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat
Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu.
Tanaman yang termasuk dalam familia Simarubaceae tersebut secara empiris digunakan untuk mengobati disentri, malaria, kudis dan penawar racun lipan. Ekstrak biji B. javanica
efektif sebagai amubisida. Senyawa bruseantin dan brusein C yang diisolasi dari ekstrak biji diketahui aktif menghambat pertumbuhan
Entamoeba hystolitica. (Anonim, 2009).
Kegunaan buah makassar untuk pengobatan menjadikannya salah satu tanaman obat yang menarik untuk diteliti. Salah satu studi yang belum banyak dilakukan terhadap buah makassar adalah dari bidang sistematika. Similaritas buah makassar dengan tanaman lain dapat diketahui melalui studi taksonomi numerik dengan memanfaatkan data fenetik sebagai karakter. Sedangkan kekerabatannya dapat diketahui melalui konstruksi pohon filogenetik dengan memanfaatkan data molekuler.
Saat ini data molekuler organisme dari semua divisi yang berupa sequence DNA dapat diakses dengan relatif mudah dari bank data yang menyimpannya. Salah satu data molekuler yang dapat digunakan adalah sequence DNA untuk gen
ribulosa-1,5-bifosfat karbosilase/ oksigenase
(rbcL). Gen tersebut dapat dipergunakan sebagai
penanda molekuler dalam penyusunan klasifikasi filogenetik karena gen tersebut terdapat pada organisme kemoautotrof, misalnya beberapa jenis bakteri, dan organisme fototrof, misalnya
tumbuhan. Ekspresi dari rbcL adalah protein
fungsional ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/
oksigenase atau RubisCO yang berfungsi mengkatalisis fiksasi dan reduksi CO2 dari udara menjadi karbon organik (Tabita et al., 2008).
Dalam klasifikasi filogenetik ini data
sequence rbcL pada protoplast tanaman B. javaniva yang disimpan di National Center for Biotechnology Information (NCBI) akan digunakan
untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan kekerabatan evolusioner tanaman B. javanica. Pohon filogenetik adalah ilustrasi evolusi yang terjadi pada sekelompok organisme yang berasal dari nenek moyang yang sama, yang disusun berdasarkan kesamaan dalam beberapa hal, misalnya gen, protein dan organ (Ochieng et al., 2007).
METODE PENELITIAN
Bahan
Sekuens rbcL yang diunduh dari bank data internasional National Center for Biotechnology Information (NCBI) melalui situs http//:www.
ncbi.nlm.niv.gov. Cara kerja
Klasifikasi filogenetik tanaman B. javanica
ini dibuat dengan memanfaatkan data sequence
DNA yang disimpan di bank data internasional
NCBI dan program untuk konstruksi pohon
filogenetik secara online yang disediakan oleh
DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Data sequence
DNA pengkode enzim Rubisco untuk tanaman buah Makassar (Brucea javanica) diunduh dari
situs http//:www.ncbi.nlm.niv.gov. Sequence
Volume 2, No. 2, Desember 2009 126
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
yang dibuka di http//www.ddbj.ac.jp/l untuk
mengukur similiritas antara data sequence yang dimasukkan dengan data yang ditemukan dalam database. Selanjutnya, dilakukan alignment
menggunakan program Clustal W versi 1.83 pada situs yang sama. Hasil alignment digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang visualisasinya dilakukan menggunakan program TREEVIEW. Selain itu, data sequence DNA
dari NCBI juga digunakan untuk memprediksi
struktur tiga dimensi protein yang dikode oleh gen rbcL melalui query yang dikirim ke DDBJ.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Data karakter molekular yang diunduh
dari NCBI adalah sequence gen lengkap subunit
besar ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/
oksigenase yang terdapat di dalam kloroplast tanaman B. javanica. Gen tersebut dapat
digunakan sebagai penanda universal dalam sistematika molekular khususnya sistematika tumbuhan karena dimiliki oleh semua organisme yang berfotosintesis. Ekspresi dari rbcL adalah
enzim ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/
oksigenase (RubisCO) yang berfungsi dalam katalisis fiksasi karbon di dalam siklus Calvin. Selain mengkatalisis pengikatan karbon dioksida pada substrat ribulosa-1,5-bifosfat, RubisCO juga mempercepat oksigenasi substrat tersebut sehingga RubisCO disebut enzim
ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksegenase (Tabita et al., 2008).
Pada data sequence gen RubisCO yang
disimpan oleh NCBI terdapat data translasi gen
tersebut. Data translasi gen yang merupakan deretan asam amino kemudian dikirimkan
DDBJ untuk mengetahui bentuk tiga dimensi
protein hasil translasi. Struktur tiga dimensi subunit besar protein fungsional RubisCO yang
ditunjukkan oleh DDBJ ditampilkan dalam Gambar 1.
Enzim RubisCO pada tanaman biasanya terdiri atas dua subunit protein yaitu rantai panjang (+55.000 Da) dan rantai pendek (+13.000 Da) (Yoon et al., 2001). Substrat yang berupa ribulosa-1,5-bifosfat terikat pada sisi pengikatan subunit besar. Keseluruhan enzim ini tersusun atas delapan dimer rantai panjang dan delapan rantai pendek yang membentuk sebuah kompleks yang lebih besar yaitu protein berukuran 54.000 Da (Stryer et al., 2002).
Gambar 1. Subunit besar enzim ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase
Program yang digunakan untuk menentukan similaritas antar sequence yang
adalah BLAST dan ClustalW. Di dalam kedua
program tersebut terdapat algoritme yang berfungsi mengukur similaritas antar sequence
yang diperbandingkan. Perbedaan keduanya adalah bahwa ClustalW mengukur similaritas di antara beberapa input sequence, sedangkan
BLAST membandingkan satu input sequence
dengan semua sequence yang ditemukan dalam
hubungan evolusioner, sedangkan BLAST
Volume 2, No. 2, Desember 2009 127 database. Pengukuran similaritas menggunakan
ClustalW dapat digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan
hubungan evolusioner, sedangkan BLAST
mengukur semua similaritas tanpa memandang asal-usul evolusioner.
Pohon filogenetik yang dikonstruksi berdasarkan rbcL pada tanaman B. javanica
ditunjukkan oleh Gambar 2. Berdasarkan
Volume 2, No. 2, Desember 2009 128
Volume 2, No. 2, Desember 2009 129 Salah satu tahap penting dalam
mengkonstruksi pohon filogenetik adalah
alignment, yaitu membandingkan sisi yang homolog-homolog dan variable-variabel antar
sequence sehingga diperoleh nilai similaritas.
Berdasarkan alignment menggunakan program
ClustalW yang dilakukan pada sequence rbcL B. javanica diketahui bahwa nilai similaritasnya terhadap sequence rbcL spesies-spesies yang
lain berkisar antara 95-99% (Tabel 1).
Dari 31 spesies tanaman yang dibandingkan dengan B. javanica dalam konstruksi pohon filogenetik diketahui bahwa terdapat lima familia yaitu Anacardiaceae,
Sapindaceae, Burseraceae, Meliaceae dan
Simarubaceae, yang posisinya di dalam pohon filogenetik terlokalisir dalam klaster-klaster yang berdekatan untuk setiap anggota familia yang sama. Nama familia untuk masing-masing spesies disajikan dalam Tabel 1.
Berdasarkan pohon filogenetik diketahui
bahwa klaster-klaster kecil di bagian bawah pohon filogenetik ditempati oleh anggota familia Anacardiaceae dengan nilai similaritas sebesar
98-99%. Spesies tanaman anggota Meliaceae mempunyai nilai similaritas sebesar 96% dan
berada pada klaster bagian tengah. Klaster di
bagian atas ditempati oleh Burseraceae dengan kisaran similaritas 96-97%. Pengelompokan
dalam satu klaster untuk tanaman familia yang sama menggambarkan kedekatan kekerabatannya. Semakin banyak sequence
DNA yang sama semakin tinggi similaritasnya sehingga posisinya di dalam percabangan pohon filogeni berdekatan.
Kejanggalan posisi beberapa spesies
terdapat pada letaknya yang berjauhan, tidak menjadi satu klaster, meskipun spesies-spesies tersebut menjadi anggota familia yang sama ditunjukkan oleh Blepharocarya depauperata dan
Buchanania latifolia (Anacardiaceae), Dobinea delavayi dan Diploglottis campbelli (Sapindaceae). Spesies-spesies tersebut berada terpisah satau sama lain dan juga terpisah dari klaster besar anggota familianya. Anggota Simarubaceae yang lain, B. tenuifolia, bahkan hanya memiliki nilai
similaritas 95% terhadap B. javanica. Posisi dalam klaster yang saling berjauhan untuk keenam spesies tersebut kemungkinan terjadi karena urutan nukleotida pada gen RubisCO yang mereka miliki perbedaannya cukup besar meskipun spesies tersebut adalah anggota familia yang sama. Pengaruh habitat dapat menyebabkan
terjadinya variasi dalam RubisCO. Berdasarkan data dari NCBI diketahui bahwa sumber gen
untuk B. javanica dengan kode aksesi AY510146
Volume 2, No. 2, Desember 2009 130
Tabel 1. Nilai similaritas spesies dalam pohon filogenetik.
No Spesies Familia Similaritas (%)
1 Blepharocarya depauperata Anacardiaceae 98
2 Dobinea delavayi Sapindaceae 97
3 Buchanania latifolia Anacardiaceae 97
4 Beiselia mexicana Burseraceae 97
5 Canarium ovatum Burseraceae 97
6 Canarium indicum Burseraceae 96
7 Proteum madagascariense Burseraceae 97
8 Bursera inaguensis Burseraceae 97
9 Commiphora habessinica Burseraceae 96
10 Diploglottis campbelli Sapindaceae 95
11 Brucea tenuifolia Simarubaceae 95
12 Cedrella odorata Meliaceae 96
13 Khaya anthotheca Meliaceae 96
14 Swietenia macrophylla Meliaceae 96
15 Trichilia emetica Meliaceae 96
16 Nymania capensis Meliaceae 96
17 Cipadessa baccifera Meliaceae 96
18 Spondias cytherea Anacardiaceae 97
19 Tapirira mexicana Anacardiaceae 97
20 Cyrtocarpa procera Anacardiaceae 97
21 Mangifera indica Anacardiaceae 97
22 Anacardium occidentale Anacardiaceae 96
23 Heeria argentea Anacardiaceae 98
24 Brucea javanica Simarubaceae 100
25 Brucea javanica Simarubaceae 100
26 Laurophyllus capensis Anacardiaceae 98
27 Pistacea vera Anacardiaceae 98
28 Cotinus coggygria Anacardiaceae 99
29 Schinus molle Anacardiaceae 98
30 Amphypterygium adstringens Anacardiaceae 99
31 Rhus ambigua Anacardiaceae 99
32 Toxicodendron succedaneum Anacardiaceae 99
KESIMPULAN
Berdasarkan pohon filogenetik yang
dihasilkan dapat disimpulkan sequence rbcL dapat digunakan sebagai karakter molekuler untuk menyusun pohon filogenetik. Penggunaan sequence rbcL untuk kosntruksi pohon filogenetik memperlihatkan bahwa tanaman buah Makassar (B. javanica) berkerabat dekat dengan beberapa tanaman dari familia Anacardiaceae. Pohon filogenetik yang dikonstruksi berdasarkan gen pengkode protein fungsional dimungkinkan dapat
digunakan untuk menduga kemiripan kandungan metabolit antar tanaman yang berkerabat dekat. Studi kekerabatan dengan menggunakan metabolit sebagai karakter diperlukan untuk membuktikan dugaan tersebut.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2009. Kwalot. Diakses dari http//
www:iptek.net.id/ind/pd_tanobat/ view.
Volume 2, No. 2, Desember 2009 131 Oktober 2009.
Kellog EA., and Juliano ND. 1997. The structure and function of rubisco and theirimplication for systematic studies. American Journal of Botany 84(3): 413-428.
Ochieng JW., Muigai AWT., and Ude GN.
2007. Review: Phylogenetics in plant biotechnology: principles, obstacles and opportunities for resource poor. African Journal of Biotechnology, Vol. 6 (6):
639-649.
Stryer L., Berg JM., and Tymoczko JL. 2002.
Chapter 20: The Calvin Cycle and the Pentose Phosphate Pathway. Biochemistry
(5th ed.). WH Freeman, San Francisco.
Tabita FR., Hanson TE., Satagopan S., Witte BH.,
and Kreel NE. 2008. Review: Phylogenetic and evolutionary relationships of RubisCO and the RubisCO-like proteins and the functional lessons provided by diverse molecular forms. Phil. Trans. R. Soc. B., 363:
2629-2640.
Yoon M., Putterill JJ., Ross GS., and Laing WA. 2001.
