DISERTASI
MUTASI GEN RPOB
ISOLAT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
MULTI DRUG RESISTANCE885 DAN 836
SERTA KLONINGNYA PADA PLASMID PET-28A
SAGUNG CHANDRA YOWANI 0890271010
PROGRAM DOKTOR
PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
MUTASI GEN RPOB
ISOLAT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
MULTI DRUG RESISTANCE885 DAN 836
SERTA KLONINGNYA PADA PLASMID PET-28A
Disertasi untuk Memperoleh Gelar Doktor Pada Program Doktor Program Studi Ilmu Kedokteran
Program Pascasarjana Universitas Udayana
SAGUNG CHANDRA YOWANI 0890271010
PROGRAM DOKTOR
PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
iii
Lembar Persetujuan Promotor/Kopromotor
NASKAH PENELITIAN DISERTASI INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 15 MEI 2012
Promotor
Prof. Dr. dr. I Ketut Sukardika, Sp.MK(K) NIP. 19430520 196712 1 001
Ko Promotor I
Prof. drh. I Nyoman Mantik Astawa, Ph.D NIP. 19601231 198803 1 003
Ko Promotor II
Dr. Drs. I Ketut Junitha, M.S. NIP. 19570628 198403 1 003
Mengetahui
Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Program Pascasarjana
Universitas Udayana,
Dr. dr. I Wayan Putu Sutirta Yasa,M.Si NIP 19570513 198601 1 001
Direktur
Program Pascasarjana Universitas Udayana,
Prof. Dr. dr. A. A. Raka Sudewi,Sp.S(K) NIP 19590215 198510 2 001
Disertasi Ini Telah Diuji oleh Panitia Penguji pada Ujian Tertutup Program Pascasarjana Universitas Udayana
Pada Tanggal 24 April 2012
Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No : 0629/UN14.4/HK/2012
Tanggal 12 April 2012
Panitia Penguji Ujian Tertutup (Tahap I) adalah :
Ketua : Prof. dr. I Ketut Suata,Sp.MK(K), Ph.D Anggota :
1. Prof. Dr. dr. K. Sukardika,Sp.MK(K)
2. Prof.drh. I N. Mantik Astawa,Ph.D
3. Dr. Drs. I Ketut Junitha, M.Sc.
4. Prof. dr.I G.M.Aman, Sp.FK
5. Prof.Dr. dr. K.Tuti Parwati Merati, Sp. PD.(KPTI)
6. Prof.dr.N.T.Suryadhi,MPH.,Ph.D
7. Prof. Dr.dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K)
v
UCAPAN TERIMAKASIH
Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang maha Esa, karena atas asung kerta wara nugrahaNya, disertasi ini dapat diselesaikan.
Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. dr. I Ketut Sukardika, Sp.MK selaku Promotor yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan saran selama penulis mengikuti program doktor, khususnya dalam penyelesaian disertasi ini. Terimakasih yang sebesar-besarnya pula penulis sampaikan kepada Prof. drh. INyoman Mantik Astawa, Ph.Ddan Dr. Drs. I Ketut Junitha, M.S.selaku ko-promotor I dan II atas segala arahan, bimbingan, dan motivasinya untuk menyelesaikan penelitian disertasi ini.
Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana, Prof. Dr. dr. I Made Bakta Sp.PD.(KHOM), atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Doktor di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih ini juga ditujukan kepada Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S (K) beserta seluruh jajarannya, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Doktor pada Program Pascasarjana Universitas Udayana.Tidak lupa pula penulis mengucapkan terimakasih kepada Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana atas ijin dan fasilitas laboratorium yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program Doktor, ucapan terimakasih disampaikan pula kepada Prof. Dr. Dra. Ni Nyoman Tripuspaningsih beserta staf Laboratorium Proteomik, beserta Prof. Dr. dr. Ni Made Martiniasih beserta staf Laboratorium M.tuberculosis, dan Prof. Dr. dr. Indropo, Sp.KK Laboratorium M.Leprae ITD UNAIR atas ijin penggunaan sarana laboratoriummya selama penulis melakukan penelitian program Doktor. Ucapan terimakasih penulis sampaikan pula kepada penguji disertasi, Prof. dr. I Ketut Suata,Sp.MK., Ph.D, Prof. dr. IGusti Made Aman, Sp.,FK,Prof. Dr. dr. K.Tuti Parwati Merati, Sp. PD.(KPTI), Prof. dr. N.T. Suryadhi, MPH., Ph.D.,
Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S (K)., dan Prof. Dr. Dra. Putu Ristiati, M.Pdatas arahan, saran, koreksi, dan pendapatnya untuk kesempurnaan disertasi ini.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Pemerintah Republik Indonesia c.q. Menteri Pendidikan Nasional yang telah memberikan beasiswa BPPS,dana penelitian “Hibah Penelitian Disertasi Doktor” serta dana Program Sandwich
Likekepada penulis sehingga meringankan beban material penulis dalam
menyelesaikan pendidikan Doktor ini, dan berkesempatan untuk melakukan penelitian di RuG (Rijk Universiteit Groningen; University of Groningen).
Terima kasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan kepada Prof. Dr.Bauke W. Djikstra seluruh staf, dan para mahasiswa kelompok studi pada Laboratory of Biophysical Chemistry, RuGatas segala fasilitas dan komunikasi yang sangat bermanfaat untuk kesempurnaan penulisan disertasi ini.
Pada kesempatan ini pula penulis mengucapkan terimakasih kepada seluruh guru yang telah membimbing penulis dari Sekolah Dasar sampai Peguruan Tinggi, keluarga besar, Ayahdan Ibu kandung,Drs. I Gusti Ketut Anom, M,Hum, dan I Gusti Ayu Nilawati, BA., Ayah Mertua (Alm.) dan Ibu Mertua(Almh),Prof. drh. I Gusti Bagus Amitaba dan Ni Nyoman Wirasni Inggas yang telah membesarkan, membimbing dan memberikan motivasi pada penulis, ucapan terimakasih disampaikan pula kepada suami, Drs. I G.B. Gupta Widotama,Apt., Sp.FRS, putri tercinta I Gusti Ayu Kanya Ritawari, atas pengertian, dukungan moral dan materialnya selama menyelesaikan pendidikan ini. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada teman-teman di Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Universitas Udayana, teman-teman Angkatan 2008,khususnya, Mbak Putu Wrasiati, Icha, Bu Ari Agung, Bu Sri Wahyuni, Pak Dewa dan Pak Wijaya atas motivasi, semangat dan kebersamaannya.Ucapan terimakasih disampaikan juga kepada Prof.drh. G.K.Mahardika,Ph.D yang sangat banyak membantu penulis untuk menganalisis hasil sekuensing dan memberikan motivasi, serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas bantuan dan kerjasamanya selama menjalani pendidikan program Doktor ini.
vii
Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang maha Esa selalu melimpahkan rahmatNya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian disertasi ini, serta kepada penulis sekeluarga.
Denpasar, Mei 2012
ABSTRAK
MUTASI GEN RPOB ISOLATMYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
MULTI DRUG RESISTANCE 885 DAN 836
SERTA KLONINGNYAPADA PLASMID PET-28A
Tuberkulosis pada manusia masih merupakan salah satu penyebab kematian di seluruh penjuru dunia. Meskipun telah diimplementasikan regimen kombinasi empat jenis obat, kejadian resistensi dan multidrug-resistant Mycobacterium
tuberculosis (MDR-TB) terus meningkat. Dari beberapa hasil penelitian
ditemukan bahwa hampir 90 % isolat yang resisten rifampisin, juga resisten terhadap isoniazid. Oleh karena itu, resistensi terhadap rifampisin dianggap sebagai marka yang mewakili (surrogate marker) kejadian MDR-TB. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengamplifikasi gen mutan rpoB dari MDR-TB dan merekombinasinya ke dalam vektor ekspresi.
Isolat yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat 885 dan 836 yang telah diketahui resistensinya dari koleksi Balai Besar Laboratorium Kesehatan Daerah Surabaya. Penelitian dilakukan dengan metode eksplorasi bertingkat. Tahap pertama dilakukan amplifikasi fragmen gen rpoB dengan metode PCR(Polymerase Chain Reaction) dilakukan pada thermacycler Takara, dengan tahapan proses preheating pada 95°C selama 15 menit, diikuti amplifikasi awal sebanyak 45 siklus ( 1 menit pada 94°C, 1 menit pada 58°C, 1 menit pada 72°C) serta post ekstensi 5 menit pada 72°C. Tahap kedua, yaitu rekombinasi gen dilakukan dengan meligasi fragmen gen melalui situs restriksi pada sistem plamid pET 28-a, kemudian ditransformasi dengan metode heat shock ke dalam E.coli TOP10. Ekspresi protein RpoB dilakukan dalam kultur sel E.coli BL21. Untuk overekspresi protein, diinduksi dengan IPTG, kemudian pemurnian protein dilakukan dengan metode kromatografi kolom afinitas.
Hasil penelitian menunjukkan adanya mutasi pada kedua isolat.Pada isolat 885 terdapat perbedaan dari wild typesebagai berikutS594A, S626V, dan T629A. Sedangkan pada isolat 836 terdapat beberapa perubahan yaitu C585L,S594A,D623P, dan Q624K, yang disebabkan oleh adanya insersi beberapa nukleotida. Hal ini menyebabkan terjadinya pergeseran satu asam amino Aspartat (D) dari kodon 621 menjadi kodon ke 622.
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terjadi mutasi pada kedua isolat yang dianalisis dari hasil translasi sekuen nukleotida menjadi sekuen asam amino.Pada isolat 885, mutasi yang terjadi adalah missense mutationstransversi, sedangkan pada isolat 836 terjadi pula frameshift mutation karena adanya insersi satu kodon.
ix
ABSTRACT
MUTATIONS IN RPOB GENE OF
MULTIDRUG RESISTANCE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 885 AND 836 AND ITS CLONING INTO PET 28-A PLASMID Tuberculosis is a major cause of death among people all around the world. Eventhough, regiment of four drug combination has been implemented, single-drug resistant and multisingle-drug-resistant of Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) are continuously increasing. Some studies reported that almost 90 % of rifampicin resistant isolate are also resistant to isoniazid. Its resistance to rifampicin is usefull as a surrogate marker of MDR-TB.The major aim of this research is to amplify rpoB mutant gene of M. tuberculosis rifampicin resistant isolate and clone it into expression vector, pET-28a.
For the purpose of this research, MDR-TB 885 and 836 isolates were collected from Regional Health Laboratory of Surabaya.The method that used for this research is sequented exploration. For the first step, PCR was used to amplify the gene, on described steps :a cycle of preheating at 95°C for 15 minutes, amplifying in 45 cycles (1 minute at 94°C, 1 minute at 58°C, 1 minute 72°C) and post extension for 5 minutes at 72°C.The second step, gene recombination, was done using pET system, namelypET 28-a, then transformed into E.coli TOP10. RpoB protein was expressed by E.coli BL21 culture cell. IPTG was used to overexpressed the protein, and protein purification was done by coloumn affinity chromatography method.
The result of this research showed that there were mutations in both of the isolate.For 885 isolate showed S594A, S626V, dan T629A. For the 836 isolate there are some differences namely C585L, S594A, D623P, and Q624K. The mutation in 836 isolate was an insertion of some nucleotides, that make frameshifting of one amino acid, Aspartate (D), from codon the 621st to codon the 622nd.
In conclusion, nucleotide sequences of both isolate that translate to amino acid sequences showed mutations. In the 885 isolate, the mutations are missense mutations occurring transversions and substitutions, where as the mutations in the 836 isolate also occurred due to an insertion frame shift mutation of one codon.
RINGKASAN
Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen penyebab tuberkulosis.
Pada tahun 2007, beberapa negara dengan prevalensi tertinggi, dari dua juta kasus adalah Cina (1,3juta), Indonesia (530.000), Nigeria (460.000), danAfrika Selatan (460.000) (Donald dan van Helden, 2009)
Masalah besar yang timbul saat ini pada penderita tuberkulosi s adalah terjadinya resistensi terhadap beberapa Obat Anti Tuberculosis (OAT). Badan kesehatan dunia (World Health Organization ;WHO) bahkan telah mendefinisikan adanya multi-drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB) yaitu jenis M.
tuberculosis yang resisten terhadap pengobatan standar enam bulan dengan OAT
lini pertama dalam suatu regimen kombinasi obat. Resistensi setidaknya terhadap rifampisin dan INH, sudah dikategorikan sebagai kejadian MDR-TB (Thomas, 2008).
Laporan tentang resistensi OAT di dunia berdasarkan informasi yang dikumpulkan WHO antara tahun 2002-2006 pada 90.000 pasien di 81 negara, menyatakan bahwa saat ini tidak hanya terjadi MDR tetapi jugafenomena yang disebut extensively drug-resistant tuberculosis (XDR-TB). XDR-TB adalah suatu bentuk TB yang disebabkan oleh resistensi bakteri terhadap hampir semua OAT yang efektif (misalnya MDR-TB dengan tambahan resistensi terhadap golongan fluoroquinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua seperti amikacin,
kanamycin atau capreomycin). Fenomena ini oleh WHO telahtercatatterjadi di 45
negara(Thomas, 2008).
Analisis pada ±500 strain M. tuberculosis dari berbagai penjuru dunia menemukan bahwa 96% isolat yang resisten Rifampisin (RMP) memiliki mutasi di segmen 81-bp gen rpoB, suatu house-keeping gene yang menyandi sub-unit-beta dari RNA polimerase dan mampu menghalangi hibridisasi nukleotida pertama untuk mengaktifkan polymerase sehingga menghalangi sintesis mRNA. Mutasi ini tidak ditemukan pada organisme yang rentan (susceptible). Sebagian besar mutasi missense penyebab resistensi RMP terjadi pada kodon 513, 526, atau 531 dari gen rpoB, dan sebagian kecil pada posisi 514 atau 533. Diperkirakan
xi
90% isolat resisten RMP juga resisten terhadap isoniazid, sehingga resistensi terhadap RMP dianggap mewakili (surrogate) kejadian MDR (Rosilawati,2007 ;
Syaifudin,2007).
Penelitian ini merupakan penelitian dengan rancangan eksplorasi bertingkat, dan bertujuan untuk merekonstruksi plasmid vektor kloning dengan gen rpoBM. tuberculosis. Sebagai pembanding homologi urutan nukleotida digunakan urutan nukleotida M. tuberculosis yang ada pada data base URL ://
www.ncbi.nlm.nih.gov.Untuk bisa mendapatkan gen yang diinginkan pada
penelitian ini, maka tahap pertama yang harus dilakukan adalah mengisolasi DNA dari MDR-TB. Dari hasil isolasi DNA secara utuh, barulah bisa dilakukan PCR untuk mendapatkan sekuen dari gen yang diinginkan. Produk PCR inilah yang nantinya dikloning ke dalam sistem plasmid. Tahap kedua dari penelitian ini adalag kloning gen yang sering juga disebut dengan rekonstruksi plasmid, karena pada teknik ini, produk PCR diinsersikan ke dalam daerah multi cloning site dari sistem plasmid, sehingga rekonstruksi awal sistem menjadi berubah
Isolat yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat multi drug resistant
M.tuberculosis koleksi Balai Besar Laboratorium Kesehatan Daerah Surabaya.
Sebagai kontrol pertumbuhan digunakan M.tuberculosis strain H37Rv yang ada pada koleksi laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
Isolat yang telah ditumbuhkan, diekstraksi dengan menambahkan larutan NaCl 0.9%. Lisis sel dilakukan dengan larutan TE(Tris-EDTA) 1X, larutan pelisis (guanidin tiosianat, Tris-HCl, EDTA dan Triton-X) dan 20 μl ddH2O kemudian dikocok selama 10 menit dan disentrifus 2 menit dengan kecepatan 100 rpm. Setelah dicuci dengan buffer dan etanol 70% dingin masing-masing 2 kali dan aseton satu kali, pelet dikeringkan pada 56°C. Pada pelet kering ditambahkan larutan TE dan diinkubasi 56°C selama 10 menit. Setelah disentrifus, supernatannya digunakan untuk template PCR(Boom, 1990). Seluruh prosedur inokulasi dan ekstraksi DNA dilakukan dalam Biological safety cabinet class II. Konsentrasi DNA diukur dengan Spektrofotometer.
PCR dilakukan dengan menggunakan primer yang dipilih dari deret nukleotida spesifik strain M. tuberculosis seperti telah ditinjau sebelumnya. PCR dilakukan pada mesin Takara Thermalcycler, Japan dengan denaturasi awal pada 95°C selama 5 menit, 40 siklus amplifikasi ( 1 menit pada 94°C, 1 menit pada 58°C, 1 menit pada 72°C), dan elongasi akhir pada 72°C selama 5 menit.
Produk PCR dielektroforesis pada 1,5% agarose (Sigma Aldrich, Inc. USA) yang dilarutkan dalam 1,0X TAE (Tris-asetat-EDTA) mengandung etidium bromide (0.5 μg/ml) dan divisualisasi pada panjang gelombang 260 nm UV transilluminator.
Sekuensing dilakukan dengan menggunakan primer yang telah dirancang. Dari hasil sequensing, dilakukan analisis homologi dengan data base pada
www.ncbi.nlm.nih.gov.Sekuen gen yang telah terinsersi ini dapat dianalisis perbedaan urutan nukleotidanya dengan cara membandingkan dengan urutan nukleotida M.tuberculosis wild type yang telah tersimpan pada data base. Analisis dilakukan dengan program Mega 4.
Berdasarkan rancangan penelitian yang dilakukan, maka analisis yang digunakan untuk mengolah data adalah analisis fakta-fakta laboratoris. Dari data sekuens nukleotida yang didapatkan, dilakukan homologi terhadap data base, menggunakan program on-line BLASTX dan MEGA4.
Proses awal PCR dilakukan di laboratorium Biomol Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Proses PCR selanjutnya dan konstruksi plasmid dilakukan di laboratorium Proteomik ITD Universitas Airlangga, Surabaya.Ekspresi protein dan uji ekspresi protein dilakukan di Biophysical Chemistry Laboratory, Rijkuniversiteit Groningen (University of Groningen), Belanda.
Dari hasil sub kultur isolat yang ditumbuhkan pada media LJ dengan rifampisin 4 ppm didapatkan kultur yang berwarna kekuningan pucat (gambar 5.1 dan 5.2) dengan permukaan kasar dan kering,serta tampak sedikit menggumpal. Kultur yang tumbuh sedemikian pada media yang berbasis telur, menunjukkan bahwa kultur tersebut memang benar merupakan M.tuberculosis.
Selanjutnya dilakukan amplifikasi gen rpoB segmen 465 pb yang digunakan untuk penentuan adanya M.tuberculosis dari suatu isolat klinis yang
xiii
kompleks. Pada penelitian ini, amplifikasi terhadap segmen tersebut digunakan untuk memastikan bahwa DNA yang diisolasi dari hasil sub kultur memang benar
M.tuberculosis. Hasil amplifikasi dilihat pada elektroforesis gel agarosa 1,5%.
DNA bakteri yang telah diisolasi selanjutnya digunakan sebagai templat untuk amplifikasi target gen yang akan direkombinasikan.
Amplifikasi fragmen rpoB M. tuberculosis resisten rifampisin dilakukan dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), menggunakan primer yang dirancang melalui program Clone Manager Suite.Produk PCR didapatkan dengan menggunakan primer FNdeR1 5’-GCC ATA TGA TGT CTC CGA TCG ACC ACT TC 3’ dan RBamR1 5’ GTG GAT CCT GTC GTG CAT CAC AGT GAT GTA G 3’.Produk PCR yang dihasilkan adalah fragmen gen rpoB M.tuberculosis resisten rifampisin sebesar 1707 pasang basa dengan penambahan situs enzim restriksi NdeI pada ujung 5’ dan BamHI pada ujung 3’.
Penambahan situs restriksi pada masing-masing ujung berguna untuk proses rekombinasi produk PCR ke dalam plasmid pET-28a. Visualisasi pada agarose menunjukkan pita yang sesuai dengan target yang diinginkan. Produk PCR inilah yang diinsersikan ke dalam plasmid vektor pET28.
Hasil sekuensing produk PCR dianalisis dengan melakukan homologi terhadap database yang tersedia pada situs URL :// www.ncbi.nlm.nih.gov. Hasil sekuensing yang dikerjakan dengan primer forward, terbaca sebanyak 959 basa untuk isolat 836 dan 941 basa untuk isolat 885. Analisis homologi dilakukan dengan menggunakan program BLASTX secara on line, dan didapatkan bahwa fragmen tersebut memang benar adalah bagian dari gen rpoB M.tuberculosis. Dengan M.tuberculosis H37Ra dan H37Rv, yang mewakili wild type ,homologi yang didapatkan adalah sebesar 94 %. Dengan kesamaan sebesar 94 % dapat dipastikan bahwa fragmen yang diamplifikasi adalah benar sekuens nukleotida gen rpoB M.tuberculosis.
Sekuensing yang dilakukan dengan primer reverse dapat membaca sebanyak 835 basa untuk isolat 836 dan 715 untuk isolat 885. Sekuens fragmen digunakan untuk analisis adanya persamaan dengan isolat-isolat resisten dari beberapa negara. Analisis dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.
Hasil analisis menunjukkan adanya perbedaan beberapa asam amino. Pada isolat 885 terdapat perubahan dari wild type sebagai berikut S594A, S626V, dan T629A. Sedangkan pada isolat 836 terdapat beberapa perubahan yaitu C585L, S594A, D623P, dan Q624K, yang disebabkan oleh adanya insersi beberapa nukleotida. Hal ini menyebabkan terjadinya pergeseran satu asam amino Aspartat (D) dari kodon 621 menjadi kodon ke 622. Perubahan-perubahan asam amino ini tidak terjadi pada daerah hot spot (81 bp,kodon 507-533). Selama ini 90 - 98%
M.tuberculosis resisten rifampisin yang dilaporkan memiliki mutasi pada daerah
inti tersebut. Akan tetapi, ada pula dilaporkan resistensi tingkat rendah yang menunjukkan mutasi di luar daerah tersebut yaitu pada L176F(Forbes.et al,2005). Mutasi multiple silent pada daerah kodon 145 sampai dengan 148 gen rpoBMDR-TB juga ditemukan pada penelitian di India (Lingala,et al.,2010). Masih belum jelas bagaimana prevalensi jenis resistensi ini terjadi, tetapi ini perlu digarisbawahi untuk menindaklanjuti deteksi apabila terjadi hasil yang negatif setelah dilakukan pemindaian pada daerah 81 pasang basa dari gen rpoB (Laurenzo dan Mousa,2011)
Perubahan-perubahan yang terjadi pada kedua isolat dapat menyebabkan terjadinya perubahan sifat protein yang terbentuk. Pada isolat 885 perubahan terjadi S594A, dari serin yang bersifat polar menjadi alanin yang bersifat non polar, karena berubahnya dua nukleotida pertama dari kodon yang bersangkutan. Perubahan berikutnya adalah S626V, serin menjadi valin yang bersifat non polar, karena berubahnya satu nukleotida ketiga dari kodon. Perubahan lainnya adalah T629A , treonin yang bersifat polar menjadi alanin yang bersifat polar, karena berubahnya dua nukleotida pertama dari kodon bersangkutan. Dengan berubahnya asam amino serin menjadi asam amino lain yang bersifat non polar dan tidak reaktif, pada isolat 885 ini, diprediksi merupakan salah satu faktor yang menyebabkan aktivitas protein berkurang dan menyebabkan terjadinya resistensi.
Pada isolat 836, terjadi perubahan C585L, asam amino sistein yang mengandung gugus tiol menjadi leusin yang bersifat hidrofobik, dengan perubahan dua nukeotida terakhir. Perubahan lainnya adalah S594A, asam amino serin menjadi alanin,perubahan yang sama seperti pada isolat 885 tetapi dengan
xv
jenis mutasi yang berbeda. Pada isolat 885, mutasi yang terjadi adalah missense
mutation karena perubahan nukleotida, sedangkan pada isolat 836 yang terjadi
adalah insersi beberapa nukleotida sehingga terjadi frameshift mutation dan menyebabkan pergeseran kodon-kodon di sekitarnya. Perubahan yang lainnya adalah D623P, asam amino aspartat yang bersifat polar menjadi prolin yang bersifat hidrofobik dan memiliki gugus sirkuler imino. Rantai samping asam amino prolin diketahui memiliki kespesifikan yang dapat berikatan secara kovalen dengan atom nitrogen untuk membentuk cincin pirolidin siklik dengan mengurangi reaktivitas gugus. Hal ini menyebabkan terjadinya pembengkokan struktur tersier dan kuartener suatu protein. Pembengkokan ini biasanya merupakan penentu situs aktif suatu enzim (Whitfford,D.2005). Perubahan berikutnya adalah Q624K , glutamine yang bersifat netral menjadi lisin yang bersifat basa. Frameshift mutation: GAT (D) 621 622, diprediksikan terjadi karena adanya insersi nukleotida, yang mengubah pembacaan kodon dibandingkan dengan wild type.
Perubahan sifat asam amino penyusun protein akan menimbulkan perubahan sifat aktivitas protein, apabila terjadi pada situs aktifnya. Demikian pula insersi satu asam amino akan menyebabkan perubahan sebagian besar urutan asam amino di belakangnya. Perubahan seperti ini biasanya menyebabkan perubahan yang signifikan pada sifat protein. Pada penelitian ini, karakterisasi protein belum dapat dikerjakan, oleh karenanya belum dapat dipastikan bila perubahan tersebut menyebabkan perubahan karakter protein. Terkait dengan resistensi yang ditunjukkan, maka kemungkinan perubahan yang terjadi tersebut berhubungan dengan timbulnya resistensi terhadap rifampisin.
Kesimpulan dari penelitian adalah (1)Fragmen gen mutan rpoBtelah dapat diinsersikan ke dalam sistem plasmid vektor pET-28a dan sel inang E.coli Top10. (2)Terdapat perbedaan sekuens nukleotida gen mutan rpoB M.tuberculosis yang resisten Rifampisin dibandingkan dengan wild type pada data base. Pada isolat 885 terdapat perubahan dari wild type sebagai berikut S594A, S626V, dan T629A. Sedangkan pada isolat 836 terdapat beberapa perubahan yaitu C585L,S594A,D623P, dan Q624K, yang disebabkan oleh adanya insersi beberapa
nukleotida. Hal ini menyebabkan terjadinya pergeseran satu asam amino Aspartat (D) dari kodon 621 menjadi kodon ke 622.
Dengan keterbatasan penelitian yang dilakukan, maka sebagai penelitian lanjutan dapat dilakukan hal-hal sebagai berikut : (1)Penentuan urutan asam amino dari hasil ekspresi gen, sehingga dapat dilakukan karakterisasi terhadap struktur kuartenernya dengan lebih baik (2)Karakterisasi struktur dan aktivitas protein yang didapatkan, dan diharapkan dapat menjadi suatu antigen yang baik untuk induksi antibodi. (3)Analisis lebih mendalam tentang genetika mikobakteria, sehingga bisa didapatkan urutan DNA spesifik yang konservatif untuk mikobakteria yang berkembang di wilayah Indonesia.
