BEBERAPA MUTASI GEN katG
ISOLAT KLINIS Mycobacterium tuberculosis
RESISTEN ISONIAZID
TESIS
Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari
Institut Teknologi Bandung
Oleh:
ELFIRA ROSA PANE
NIM: 20505008
Program Studi Kimia
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2007
ABSTRAK
Beberapa Mutasi gen katG
Isolat Klinis Mycobacterium tuberculosis Resisten Isoniazid
Oleh:
Elfira Rosa Pane
20505008
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis. Penyakit ini dapat diobati dengan obat-obat anti-TB (OAT). Resistensi bakteri TB terhadap OAT dapat dipicu oleh pengobatan TB yang tidak tuntas. Badan kesehatan dunia (WHO) telah mendefinisikan ‘Multi-drug resistant M. tuberculosis’ (MDR-TB) adalah jenis M. tuberculosis yang resisten setidaknya terhadap dua macam obat, yaitu rifampin (RIF) dan isoniazid (INH), yang merupakan OAT lini pertama. Resistensi terhadap RIF disebabkan oleh mutasi pada gen rpoB pengkode RNA polymerase subunit β, dengan frekuensi yang paling tinggi pada kodon 526 dan 531. Sedangkan isoniazid adalah suatu prodrug, harus diaktifkan oleh enzim katalase peroksidase yang dikode oleh gen katG M. tuberculosis, mutasi gen ini mengakibatkan resisten INH. Posisi yang paling sering termutasi pada gen katG adalah pada posisi nukleotida 944, G menjadi C. Mutasi ini berada pada kodon 315, AGC menjadi ACC, yang mengubah Ser menjadi Thr dan telah dibuktikan menjadi penyebab sifat resistensi terhadap INH. Enam sampel klinis yaitu L4, L7, L10, L18, L19, dan R2, yang fenotipenya MDR-TB dan berdasarkan uji PCR isolat-isolat tersebut mengalami mutasi pada gen rpoB kodon 526 dan 531, tetapi tidak termutasi pada gen katG kodon 315, telah diisolasi oleh kelompok penelitian M. tuberculosis KK Biokimia, ITB. Tujuan riset ini adalah untuk mendapatkan informasi pada tingkat genotipe penyebab resistensi terhadap INH dalam isolat klinis MDR-TB tersebut.
Tahapan penelitian yang dilakukan di sini yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks spesifik alel katG, elektroforesis gel agarosa, penentuan urutan nukleotida (sekuensing), dan analisis in silico. Gen katG diamplifikasi dengan metode PCR multiplek menggunakan tiga primer yaitu dua primer-luar KF dan KR serta satu primer-dalam K315. Fragmen DNA hasil PCR multiplek dikonfirmasi dengan sekuensing menggunakan jasa Macrogen.Inc., Seoul, Korea. Analisis in silico hasil sekuensing dilakukan dengan program DNA٭star untuk mendeteksi posisi mutasi pada isolat klinis dibandingkan dengan galur standar H37Rv, dan pemodelan protein dengan program Pymol.
Hasil PCR multiplek dan elektroforesis gel agarosa untuk semua isolat menunjukkan adanya dua pita DNA berukuran 0,43kb dan 0,29kb. Analisa homologi membandingkan elektroforegram hasil sekuensing fragmen 0,43kb gen katG enam isolat dengan fragmen yang sama dari M. tuberculosis galur standar H37Rv. Hasil analisa homologi menunjukkan tiga isolat (L10, L18, L19) termutasi pada posisi 946, G menjadi T; dan satu isolat (R2) termutasi pada posisi 869, C menjadi T. Dua isolat yang lainnya yaitu L4 termutasi pada posisi 795, G menjadi A; dan isolat L7 termutasi pada posisi 944, G menjadi C dan posisi 946, G menjadi T. Hasil pemodelan Pymol menggambarkan posisi masing-masing asam amino sebagai akibat mutasi pada tingkat DNA tersebut dalam struktur tiga dimensi molekul protein katalase peroksidase M. tuberculosis.
Analisa data yang diperoleh menunjukkan bahwa mutasi G946T tiga isolat (L10, L18, L19) terletak pada kodon 316, GGC menjadi TGC, mengakibatkan asam amino glisin termutasi menjadi sistein. Simulasi struktur ruang katalase peroksidase dengan program Pymol menunjukkan residu asam amino 316 berada dekat dengan sisi aktif pengikatan INH. Penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa mutasi pada residu 315 mengakibatkan sifat resistensi terhadap INH. Tiga isolat ini tidak mengalami mutasi pada residu 315 sehingga mutasi pada residu 316 diduga kuat menjadi penyebab sifat resistensi. Satu isolat (R2) mengalami mutasi nukleotida C869T yang terletak pada kodon 290, GCT menjadi GTT, mengakibatkan asam amino alanin termutasi menjadi valin. Simulasi katalase peroksidase dengan program Pymol menunjukkan residu asam amino 290 berada di daerah loop ujung N dan relatif jauh dari sisi aktifnya, pengaruh mutasi ini serta hubungannya dalam sifat resistensi terhadap INH belum diketahui. Isolat L4 mengalami mutasi nukleotida G795A yang terletakpada kodon 265, TTG menjadi TTA, tetapi tidak menyebabkan perubahan asam amino sehingga dapat dipastikan bahwa mutasi tersebut bukan penyebab sifat resistensinya. Dengan demikian penyebab sifat resistensi INH isolat L4 belum diketahui. Sedangkan isolat L7 termutasi pada kodon 315, yang telah dibuktikan sebagai penyebab resistensi INH. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi baru mengenai posisi mutasi dalam gen katG M. tuberculosis yang resisten INH oleh karena mutasi G946T (glisin316sistein) untuk isolat L10, L18, L19, dan C896T (alanin290valin) untuk isolat R2 belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Kata kunci: Isoniazid, gen katG, Multi-drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB), Polymerase Chain Reaction (PCR).
ABSTRACT
katG Gene Mutations
in Isoniazid Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates
by:
Elfira Rosa Pane
20505008
Tuberculosis (TB) is an infected diseased caused by Mycobacterium tuberculosis, and treatment with anti-tuberculosis drugs (OAT) could cured the disease. Inappropriate medication could cause TB drugs resistance. Multi-drug Resistant TB (MDR-TB) has been define by World Health Organization asstrains of tuberculosis that are resistant to at least the two main first-line drugs,namely isoniazid (INH) and rifampicin (RIF). Resistance to RIF has been associated with mutations in rpoB, the gene coding for the β subunit of RNA polymerase, and the highest frequency in codon 526 and 531. INH resistance is most frequently associated with a single mutation in katG, a gene that encodes the catalase-peroxidase enzyme in M. tuberculosis. INH is a pro-drug and requires catalytic activation into its active form, which done by the M. tuberculosis catalase-peroxidase enzyme. One particular substitution reported to be the most frequent that confers resistance to INH is G944C, in codon 315 which repalced, AGC to ACC, henceSer mutated toThr. Our research group in KK Biokimia ITB has six clinical isolates (L4, L7, L10, L18, L19, and R2) MDR-TB, which genotypic-ally showedmutation in rpoB gene codon 526 and 531, but no mutation found in katG315 based on PCR experiment assays. The aim of our research is to find the genotype information of the aboveresistance INH in six clinical isolates.
Our research methods consist of Polymerase Chain Reaction (PCR) multiplex specific alleles katG assays, gel agarose electrophoresis, nucleotidessequencings, and in silico analysis. The PCR multiplex assay employed three primers, two outer primers KF and KR; and one inner reverse primer K315. DNA fragments of PCR product were confirmedby sequencing method. In silico analysis of nucleotides using DNA*star program was usedtodetect theposition of mutations in six clinical isolates with wild-type H37Rv as a reference, and the Pymol program was exploited for protein modeling.
Multiplex PCR of all isolates showed DNA fragment of 0.43kb and 0.29kb bands. Electroforegram of 0.43kb katG gene fragment werecompared to the same fragment of M. tuberculosis wild type. Homology analysis showed three isolates (L10, L18, and L19) have mutation in nucleotide 946, G to T; and an isolate (R2) has mutation in
nucleotide 869, C to T. Two other isolates, L4 has mutation in nucleotide 795, G to A; and L7 isolate have two mutations in nucleotides 944 and 946 which changeG to C and G to T respectively. Pymol modeling showed each amino acid position in three dimensions structure protein as the effect of mutation in the DNA level.
Data analysis obtained here showed that G946T mutation in three isolate (L10, L18, L19) located in codon 316, GGC change in to TGC, with the consequence of replacing amino acid glycine to cysteine. Pymol program showed the three dimensional structure of catalase-peroxidase enzyme, and the residue 316 was located closed tothe active site of the enzyme. The recent report have proved that mutation in theresidue 315 confers INH resistance. The fact that three isolates have no mutation in the residue 315, we suggest that mutation in residue 316 was responsible for the resistance phenotype. The R2 isolate has mutation in nucleotide C869T located in codon 290, GCT change in to GTT, hence amino acid alanine replaced by valine. Pymol program showed amino acid residue 290 located in the loop region of N terminal and was located far from the active site. The effect of this mutation and the relation in resistance INH has not been yet known. L4 isolate has mutation in nucleotide G795A located in codon 265, TTG change in to TTA, which is asynonym substitution. Therefore, the caused of resistance of INH in the L4 isolate have not been yet known. While L7 isolate have mutation in codon 315, which is confer INH resistance. The implication of our results is to give the new information about mutation position in katG gene M. tuberculosis which is resistance INH because of mutation G946T (glycine316cysteine) in isolate L10, L18, L19; and C869T (alanin290valin) in isolate R2 have not been published before.
Key words: Isoniazid, gen katG, Multi-drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB), Polymerase Chain Reaction (PCR).
BEBERAPA MUTASI GEN katG
ISOLAT KLINIS Mycobacterium tuberculosis
RESISTEN ISONIAZID
Oleh:
Elfira Rosa Pane
NIM: 20505008
Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung
Bandung, Juli 2007 Mengetahui/Menyetujui,
Pembimbing
Achmad Saifuddin Noer, Ph.D NIP: 130875577
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS
Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya.
Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.
Dipersembahkan kepada:
Mama Dwi Astuti, Papa Dahrul Pane, Yuk Lil, Yuk Pik, Epan, Kak Andi, Kak Gatmir, Farah, Aurel, keluarga besar Pane, my future husband,
KATA PENGANTAR
Syukur alhamdulillah kami panjatkan ke hadirat Illahi Robbi, atas terselesaikannya tesis ini. Tesis ini disusun untuk melengkapi salah satu syarat dalam penyelesaian program magister pada Bidang Kekhususan Biokimia Institut Teknologi Bandung.
Tersusunnya tesis ini tidak lain berkat bantuan dari berbagai pihak, untuk itulah pada kesempatan ini Penulis ucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Achmad Saifuddin Noer, Ph.D selaku Pembimbing yang telah berkenan meluangkan waktu membimbing dan mengarahkan dalam pembuatan tesis ini.
2. Bapak Bun Bun Bundjali dan Ibu Fida Madayanti selaku koordinator Program Studi Kimia
3. Bapak Akhmaloka, Bapak Rukman Hertadi, dan Ibu Sadijah selaku dosen penguji.
4. Seluruh staff pengajar pada Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung.
5. Bu Sony, Bu Tini dan seluruh staff tata usaha.
6. Mbak Hera Noviana M.Si atas isolat dan bimbingannya.
7. Ary K, Dwita, Indira, Puti, Karina, Mia, Anton, dan teman-teman angkatan 2005 Program Studi Kimia atas kerja sama, dan persahabatan yang baik selama studi di ITB.
8. Mbak Mastura, Bambang, Mira, Dea, dan rekan-rekan sesama anak bimbingan Bapak Agus atas kerja sama yang baik.
9. Mbak Ika1, Mbak Ika2, Latri, Ema, Ita, Wiwid, Ririd, Shila, dan anak Kos Ungu lainnya atas kebersamaan selama ini.
10. Semua pihak yang tidak bisa kami sebut satu-persatu dan telah memberikan bantuannya.
Akhir kata kami sadari akan keterbatasan kami sehingga hasil karya ini pun sangat relatif dan jauh dari sempurna, hingga saran dan kritik demi perbaikan di masa mendatang sangat kami harapkan.
Bandung, 28 Juni 2007
DAFTAR ISI
ABSTRAK ... . ii
ABSTRACT... iv
LEMBAR PENGESAHAN ... vi
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS ... vii
PERUNTUKAN...viii
KATA PENGANTAR ... ix
DAFTAR ISI... x
DAFTAR LAMPIRAN... xii
DAFTAR GAMBAR ...xiii
DAFTAR TABEL... xiv
SINGKATAN ... xv
BAB I. Pendahuluan ... 1
I.1 Latar Belakang ... 1
I.2 Tujuan Penelitian ... 2
I.3 Batasan Masalah ... 2
I.4 Metode Penelitian ... 2
I.5 Sistematika Penulisan ... 2
BAB II. Tinjauan Pustaka ... 4
II.1 Tuberkulosis ... 4
II.2 Mycobacterium tuberculosis ... 5
II.3 Resistensi M. tuberculosis terhadap antibiotik... 8
II.3.1 Resistensi Terhadap Rifampin (RIF)... 9
II.3.2 Resistensi Terhadap Isoniazid (INH)………...9
II.4 Enzim Katalase Peroksidase M. tuberculosis (KatG)... 10
II.5 Aktivasi INH oleh Enzim KatG ... 15
II.6 Mutasi Gen katG ... 16
II.7 PCR Multiplek... 18
DAFTAR ISI
(Lanjutan)
BAB III. Metodologi Penelitian...22
III.1 Rancangan penelitian ... 22
III.2 Alat dan Bahan... 23
III.3 Metode Penelitian ... 23
III.3.1 Uji Genotipe... 23
III.3.2 Penentuan Urutan Nukleotida...25
III.3.3 Analisa In Silico ... 25
BAB IV. Hasil dan Pembahasan...26
IV.1 PCR Multiplek ... 26
IV.2 Hasil Penentuan Urutan Nukleotida... 27
IV.3 Analisa Homologi ... 27
IV.3.1 Analisa Homologi Isolat L10, L18, L19... 27
IV.3.2 Analisa Homologi Isolat R2 ... 30
IV.3.3 Analisa Homologi Isolat L4………31
IV.3.4 Analisa Homologi Isolat L7………33
IV.4 Visualisasi Protein Katalase Peroksidase dengan Pymol... 34
BAB V. Kesimpulan ... 37
DAFTAR PUSTAKA ... 38
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran A Gen katG M. tuberculosis... 41
Lampiran B Urutan nukleotida hasil sekuensing enam isolat dan galur alami H37Rv ... 43
Lampiran C Elektroforegram Isolat L4………. 45
Lampiran D Elektroforegram Isolat L10………. 46
Lampiran E Elektroforegram Isolat L19………. 47
Lampiran F Elektroforegram Isolat L7……… 48
Lampiran G Elektroforegram Isolat R2………. 49
DAFTAR GAMBAR
Gambar II.1. Genom M. tuberculosis... 6
Gambar II.2. Aktifasi INH ... 11
Gambar II.3. Struktur Enzim KatG ... 12
Gambar II.4. Monomer Enzim KatG ... 13
Gambar II.5. Lingkungan Heme Enzim KatG ... 14
Gambar II.6. Kompleks INH-Enzim Katalase Peroksidase M. tuberculosis 15 Gambar II.7. Interaksi-Interaksi yang Mungkin Dalam Pengaktifan INH.... 16
Gambar II.8. Posisi Beberapa Mutasi Klinis yang Dekat Dengan Pengikatan INH ... 17
Gambar II.9. PCR Multiplek... 19
Gambar II.10. Nukleotida dan Dideoksinukleotida ... 20
Gambar II.11. Ilustrasi Penambahan Dideoksi T... 21
Gambar II.12. Contoh Pembacaan Urutan DNA ... 21
Gambar III.1. Diagram Alur Kerja Penelitian... 22
Gambar IV.1. Elektroforesis Gel Agarosa Hasil PCR Multiplek ... 26
Gambar IV.2. Elektroforegram Hasil Penentuan Urutan Nukleotida ... 28
Gambar IV.3. Analisa Homologi Isolat L8... 29
Gambar IV.4. Analisa Homologi Isolat R2... 31
Gambar IV.5. Analisa Homologi Isolat L4... 32
Gambar IV.6. Analisa Homologi Isolat R7... 33
Gambar IV.7. Posisi Residu yang Mengalami Mutasi ... 35
DAFTAR TABEL
Tabel II.1 Klasifikasi gen M. tuberculosis... 7 Tabel III.1 Primer DNA yang Digunakan……….……….. 24
SINGKATAN Nama Pemakaian pertama kali pada halaman
A Adenin 22
Ala (A) Alanin 27
Asp (D) Aspartat 27
C Sitosin 20
Cys (C) Sistein 27
ddH2O Aqua bidestilasi 22
DNA Deoxyribonucleic acid 8
dNTP Deoxynucleosidetriphosphat 22
EtBr Etidium bromida 22
G Guanin 22
Gln (Q) Glutamin 29
Gly (G) Glisin 27
His (H) Histidin 31
HIV Human Immunodeficiency Virus 1
Ile (I) Isoleusin 27
INH Isoniazid 1
kb Kilo basa 22
Leu (L) Leusin 29
Lys (K) Lisin 27
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis 2
MDR Multidrug-resistant 1
Met (M) Metionin 29
OAT Obat anti-TB 5
PCR Polymerase Chain Reaction 2
Phe (F) Fenilalanin 30
Pro (P) Prolin 29
K315 Primer dalam spesifik alel kodon 315 wild type 22
SINGKATAN Nama Pemakaian pertama kali pada halaman
RIF Rifampin 1
RNA Ribonucleic acid 8
KR Primer reverse 22
Ser (S) Serin 27
T Timin 19
Taq Thermus aquaticus 22
TB Tuberkulosis 1
Thr (T) Treonin 27
Trp (W) Triptofan 29
Tyr (Y) Tirosin 27
Val (V) Valin 27
