PERBANYAKAN CEPAT JERUK KEPROK TAWANGMANGU SECARA
IN VITRO UNTUK MENDUKUNG PENGEMBANGAN AGRIBISNIS
JERUK DI INDONESIA
(In Vitro Multiplication of Citrus Mandarin cv. Tawangmangu to Support Citrus Agribusiness Development in Indonesia)
Samanhudi
JURUSAN/PROGRAM STUDI AGRONOMI, FAKULTAS PERTANIAN UNS
ABSTRAK
Jeruk keprok Tawangmangu merupakan salah satu komoditas hortikultura yang dulu sangat terkenal dan menjadi primadona unggulan Kabupaten Karanganyar. Namun demikian karena terbatasnya pengetahuan petani dalam bercocok tanam jeruk, semakin menyempitnya lahan pertanian serta serangan penyakit CVPD beberapa tahun yang lalu, menyebabkan populasi jeruk keprok Tawangmangu kini semakin sulit ditemukan. Sebagai upaya penyelamatan plasma nutfah jeruk keprok Tawangmangu yang hampir punah ini, maka perlu penyediaan benih tanaman secara cepat dalam jumlah besar dengan sifat yang sama seperti induknya dan sehat. Kondisi inilah yang mendorong dilakukannya penelitian penyelamatan plasma nutfah jeruk keprok Tawangmangu melalui perbanyakan cepat secara in vitro ini. Penelitian ini dilakukan di Lab Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian UNS, mulai bulan Nopember 2006 sampai dengan April 2007. Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan paket teknologi in vitro yang tepat untuk perbanyakan tanaman jeruk keprok Tawangmangu. Sedangkan tujuan khusus penelitian ini adalah untuk mendapatkan konsentrasi BAP dan NAA yang tepat untuk multiplikasi in vitro jeruk keprok Tawangmangu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan BAP dan NAA masing-masing dengan konsentrasi 2 ppm memberikan hasil terbaik terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan jeruk keprok Tawangmangu.
Kata kunci : Jeruk keprok Tawangmangu, multiplikasi, in vitro, BAP, NAA.
ABSTRACT
The Mandarin Citrus c.v Tawangmangu was one of horticulture commodities that was popular formerly and become prime fruit in Karanganyar. Nevertheless due to the limited knowledge of farmers on cultivation, limited growing area, and the CVPD attack in several years ago, resulted in the diminishing population of this cultivar. As an effort to save the germplasm of the cultivar, it is necessary to carry out a research on rapid and was production of seedlings that have similar characteristics with the parent. The rapid and nun production of citrus mandarin cv. Tawangmangu cultivar was conducted through in vitro cultures. The research was conducted in the Plant Physiology and Biotechnology Laboratory of Agriculture of Faculty Sebelas Maret University, from November 2006 to
April 2007. The general aim of the research was to obtain a precise in vitro technology for Citrus c.v Tawangmangu multiplication. Whereas the specific aim was to determine an exact concentration of BAP and NAA. The result indicated that the addition of 2 ppm BAP and 2 ppm NAA in the medium showed the best growth and development of Citrus c.v Tawangmangu explant.
Keywords : Citrus mandarin c.v Tawangmangu, multiplication, in vitro, BAP, NAA.
PENDAHULUAN
Peranan jeruk sebagai tanaman hortikultura makin hari makin terasa penting bagi petani karena nilai ekonomisnya yang tinggi. Jeruk merupakan komoditas buah yang paling populer di dunia, setelah anggur. Buah jeruk merupakan salah satu jenis buah yang banyak digemari oleh masyarakat. Buah jeruk selalu tersedia sepanjang tahun karena tanaman jeruk tidak mengenal musim berbunga yang khusus. Di samping itu, tanaman jeruk dapat ditanam di mana saja, baik di dataran rendah maupun di dataran tinggi.
Walaupun akhir-akhir ini populasi tanaman jeruk secara umum mengalami peningkatan, namun sampai saat ini produksinya masih belum memenuhi harapan. Hal ini disebabkan oleh terbatasnya pengetahuan para petani dalam hal bercocok tanam jeruk yang benar. Kendala lain yang menyebabkan produk buah jeruk di Indonesia belum memenuhi harapan adalah adanya serangan penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration), sehingga banyak tanaman jeruk menjadi musnah. Liberobacter asiaticum merupakan patogen penyebab penyakit pada tanaman jeruk yang mengakibatkan punahnya sebagian besar sentra jeruk pada 1980-an. Penggunaan varietas tahan atau toleran merupakan alternatif terbaik untuk menghambat penyebaran penyakit tersebut (Astuti, 1996).
Upaya penyelamatan dan pelestarian tanaman jeruk sudah dicoba oleh para ahli, yaitu dengan cara memunculkan nutfah-nutfah baru, terutama jenis jeruk yang tahan terhadap virus atau bakteri dan mengupayakan pembuatan benih jeruk bebas penyakit. Kultur jaringan merupakan cara yang paling baik untuk mendapatkan benih tanaman yang bebas virus. Hal ini didasarkan pada suatu teori bahwa bagian tanaman tumbuh lebih cepat daripada virus yang menyerang bagian jaringan di sekitarnya. Dengan kata lain, sel-sel di sekitar titik tumbuh sama sekali belum terinfeksi oleh virus, sehingga bila ditanam secara kultur jaringan akan dapat diperoleh tanaman baru yang bebas virus.
Saat ini teknik perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro telah banyak diterapkan pada tanaman. Sebab dengan teknik kultur in vitro dimungkinkan dapat menghasilkan benih-benih yang seragam dan berproduksi tinggi. Hasil kultur jaringan pertumbuhannya lebih pesat, seragam, dapat disediakan dalam jumlah banyak dalam waktu yang singkat dan
bebas patogen berbahaya (Avivi dan Ikrarwati, 2004). Kultur jaringan termasuk teknik perbanyakan tanaman secara vegetatif buatan yang didasarkan pada sifat totipotensi tumbuhan. Untuk mendukung keberhasilan kultur jaringan, tanaman yang akan dikulturkan sebaiknya berupa jaringan muda yang sedang dalam kondisi tumbuh (Rahardja dan Wiryanta, 2003).
Keberhasilan teknik kultur jaringan ini sangat dipengaruhi oleh eksplan dan komposisi media yang digunakan. Karena pada dasarnya, semua bagian tanaman dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna bila ditumbuhkan pada media yang sesuai. Media yang digunakan untuk kultur jaringan sebaiknya juga harus mengandung ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) untuk mendukung pertumbuhan eksplan. Agar kultur jaringan pada jeruk ini dapat berhasil dengan baik maka perlu diketahui teknik-teknik kultur jaringan pada tanaman jeruk itu sendiri dan juga pengaruh ZPT yang diberikan terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan jeruk.
Kesesuaian suatu bagian tanaman untuk dijadikan eksplan dipengaruhi oleh beberapa faktor. Tanaman yang memeiliki hubungan kekerabatan dekatpun belum tentu menunjukkan respon in vitro yang sama. Meskipun demikian perlu dicatat bahwa ada tiga hal penting yang berpengaruh terhadap respon in vitro tersebut, yaitu kemampuan regenerasi, tingkat fisiologi dan kesehatan dari tanaman donor (Wetherell, 1982). Salah satu komponen media yang menentukan keberhasilan dalam kultur jaringan adalah jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan. Jenis dan konsentrasi ZPT tergantung pada tujuan dan tahap dalam pengulturan (Yusnita, 2003).
Sitokinin, merupakan salah satu zat pengatur tumbuh yang selain berperan merangsang pembentukan tunas adventif, juga merangsang multiplikasi tunas aksilar dan melawan dominasi apikal, sedangkan auksin merangsang pembentukan akar adventif. Perbanyakan tunas aksilar telah dilakukan pada kultur jaringan pisang cavendish, vanili, dan stroberi. Sedangkan perbanyakan tunas adventif telah dilakukan pada kultur jaringan melinjo. Semua perbanyakan tunas tersebut dirangsang oleh sitokinin benziladenin (BA) dalam media kultur.
Zat pengatur tumbuh NAA dapat berperan sebagai perangsang terbentuknya enzim-enzim yang aktif dalam pembelahan sel. Tanpa pemberian NAA, walau telah diberikan sitokinin, eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro belum mampu untuk tumbuh akar. Sedangkan pada media MS dengan adanya penambahan NAA dapat merangsang pertumbuhan akar. Sitokinin yang paling aktif untuk merangsang pertunasan adalah BA ataupun BAP disusul kinetin (Simatupang, 1991).
Sitokinin sering pula digunakan sebagai bahan kombinasi untuk induksi kalus. Misalnya menggunakan 2,22 mM BA (sitokinin) dan 2,69 mM NAA (auksin) berhasil untuk induksi kalus Artemisia absinthium hanya dalam waktu 2-3 minggu. Pengaruh sitokinin di dalam kultur jaringan tanaman antara lain berhubungan dengan proses pembelahan sel dan proliferasi kalus. Pembelahan sel (mitosis) tidak akan terjadi tanpa sitokinin (Santoso dan Nursandi, 2004).
Berdasarkan latar belakang di atas maka penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan konsentrasi BAP dan NAA yang tepat untuk perbanyakan cepat jeruk keprok Tawangmangu secara in vitro.
BAHAN DAN METODE
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksplan yang diambil dari tanaman jeruk keprok asli Tawangmangu. Bahan kimia yang digunakan meliputi: garam makro dan mikro untuk media MS, ZPT (BAP, NAA), Dithane, dan Agrimycin. Sedangkan alat yang digunakan meliputi: botol kultur, bunsen, Laminar Air Flow (LAF), botol semprot, pinset, timbangan analitik, magnetic stirrer, beker glass, gelas ukur, pH meter, autoklaf, pipet, bak plastik, tisu, kertas label dan rak kultur.
Tahapan pelaksanaan penelitian meliputi sterilisasi botol dan alat, pembuatan larutan stok, pembuatan media, persiapan eksplan, penanaman eksplan pada media kultur, dan pemeliharaan. Penelitian disusun berdasarkan rancangan lingkungan RAL yang disusun secara faktorial dengan dua faktor perlakuan sebagai berikut : (1) Konsentrasi BAP (0 ppm, 1 ppm, 2 ppm, dan 3 ppm); dan (2) Konsentrasi NAA (0 ppm, 1 ppm, 2 ppm, dan 3 ppm). Sehingga total ada 16 kombinasi perlakuan dan masing-masing perlakuan diulang 10 kali. Variabel pengamatan meliputi : tinggi tunas, jumlah daun, bobot tunas, ketegaran tunas, kemunculan akar, dan penampilan kalus. Analisis data dilakukan dengan uji F pada taraf kepercayaan 95% dan untuk data mengenai ketegaran tunas, kemunculan akar dan penampilan kalus dianalisis secara deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN Tinggi Tunas
Tinggi tunas merupakan salah satu parameter yang paling mudah diamati untuk menggambarkan pertumbuhan suatu tanaman (Andriyanto, 2002). Pengukuran tinggi tanaman pada penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui pengaruh pemberian BAP dan
NAA terhadap pertumbuhan eksplan tanaman jeruk. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa interaksi antara BAP dan NAA memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap pertambahan tinggi tunas.
Berdasarkan Gambar 1 dapat dilihat bahwa tinggi tunas tertinggi dihasilkan pada perlakuan BAP 0 ppm dan NAA 0 ppm, yaitu 1,40 cm. Sedangkan untuk perlakuan BAP yang dikombinasikan dengan NAA 1 ppm dan 2 ppm maupun tanpa NAA, menghasilkan tinggi tanaman yang rata-rata masih di bawah 0,5 cm.
Pertambahan tinggi tunas dipengaruhi oleh komposisi media yang digunakan dan faktor genetik dari eksplan yang digunakan. Beberapa eksplan yang digunakan secara genetik bisa jadi memiliki pertumbuhan yang lambat, namun ada juga eksplan yang memiliki pertumbuhan yang cepat. Eksplan jeruk keprok Tawangmangu yang digunakan dalam penelitian ini termasuk memiliki pertumbuhan yang tergolong sangat lambat, dengan pertambahan tinggi tunas setelah berumur 3 bulan tidak lebih dari 1,40 cm. Hal ini diduga karena sifat genetik yang dimiliki eksplan tersebut, sehingga pertumbuhannya sangat lambat.
Jumlah Daun
Jumlah daun menunjukkan besarnya potensi munculnya tunas aksilar pada planlet. Tunas aksilar merupakan tunas yang muncul dari ketiak daun, sehingga semakin banyak jumlah daun maka diharapkan akan semakin banyak pula jumlah tunas aksilar atau tunas ketiak yang akan muncul. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa interaksi antara BAP dan NAA berpengaruh sangat nyata terhadap peubah jumlah daun.
0.0 0.5 1.0 1.5 0 1 2 3 Konsentrasi BAP (ppm) T in g g i T u n a s ( c m ) N0 N1 N2 N3
Gambar 1. Tinggi Tunas In Vitro Jeruk Keprok Tawangmangu Pada Umur 3 Bulan.
Berdasarkan Gambar 2 dapat dilihat bahwa jumlah daun yang tertinggi dihasilkan oleh kombinasi perlakuan BAP 2 ppm dan NAA 2 ppm, yaitu rata-rata 5 daun per planlet. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan BAP dan NAA hingga 2 ppm dapat mendorong penambahan jumlah daun. Menurut Wetherell (1982), sitokinin mempunyai dua peran penting dalam propagasi secara in vitro, yaitu merangsang pembelahan sel dalam jaringan dan merangsang pertumbuhan daun dan tunas. Hal ini diperkuat oleh Qi-Guang et al. (1986) yang menyatakan bahwa penambahan sitokinin dapat mendorong meningkatnya jumlah dan ukuran daun.
Menurut Lakitan (1993) bahwa bertambahnya jumlah daun akan mendorong sintesis asimilat di dalam sitosol sebagai sumber energi pada sel dan dapat ditranslokasikan melalui pembuluh floem ke jaringan yang sedang tumbuh. Hasil penelitian Sriyanti (2000), menunjukkan bahwa banyaknya daun yang terbentuk akan meningkatkan asimilat yang dihasilkan melalui fotosintesis yang hasilnya dapat digunakan untuk pertumbuhan mikrostek mencapai tinggi planlet yang lebih baik.
Bobot Tunas
Bobot tunas merupakan salah satu peubah yang dapat digunakan untuk melihat ketegaran planlet. Bobot segar tunas merupakan salah satu bentuk visualisasi dari kemampuan sel-sel eksplan dalam merespon perlakuan pada media, sehingga akan terus membelah hingga waktu tertentu. Perlakuan BAP dan NAA berperan pada pemanjangan dan pembelahan sel. Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan biasanya merupakan jaringan yang bersifat meristematis, sehingga pembelahan sel dan pertumbuhannya sangat dipengaruhi oleh kedua jenis zat pengatur tumbuh tersebut.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 0 1 2 3 Konsentrasi BAP (ppm) J u m la h D a u n N0 N1 N2 N3
Gambar 2. Jumlah Daun Tunas In Vitro Jeruk Keprok Tawangmangu Pada Umur 3 Bulan.
(Number of Leaves of Three Months Old Citrus Mandarin cv. Tawangmangu In Vitro Explant)
Berdasarkan hasil analisis ragam dapat diketahui bahwa interaksi antara BAP dan NAA berpengaruh sangat nyata terhadap bobot tunas. Gambar 3 menunjukkan bahwa perlakuan BAP dan NAA masing-masing dengan konsentrasi 2 ppm menghasilkan bobot tunas tertinggi, yaitu 1,80 g. Bobot tunas dengan berat yang sama juga dihasilkan pada kombinasi perlakuan BAP dan NAA dengan konsentrasi masing-masing 1 ppm.
Hasil penelitian Wetter dan Constabel (1991), menunjukkan bahwa pemberian 2,4-D 1 ml/l pada medium agar B5 dapat membentuk kalus pada eksplan kuncup cemara Douglas (Pseudotsuga menziesii Franco). Sementara penambahan BAP berpengaruh pada penambahan berat planlet.
Ketegaran Tunas
Ketegaran tunas berhubungan vigornya. Sutopo (1985) dalam Andriyanto (2002), menyatakan bahwa tingkat vigor tanaman dapat dilihat dari penampilan fenotip benih atau kecambah yang selanjutnya dapat berfungsi sebagai landasan pokok untuk ketahanannya. Pada tunas yang tampak tegar atau kokoh akan mendukung saat aklimatisasi planlet di lapangan. Tunas yang baik yaitu mempunyai batang lurus dan tunas tampak kokoh dan kuat. Keragaan tersebut menunjukkan bahwa tunas mampu tumbuh secara proporsional yaitu pertumbuhan batang, daun, maupun tunasnya seimbang sehingga tunas kokoh dan tidak mudah rebah, sehingga secara umum tunas mempunyai ketegaran yang baik (Andriyanto, 2002). 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 1 2 3 Konsentrasi BAP (ppm) B o b o t T u n a s ( g ) N0 N1 N2 N3
Gambar 3. Bobot Tunas In Vitro Jeruk Keprok Tawangmangu Pada Umur 3 Bulan.
Secara umum ketegaran tunas yang baik dihasilkan oleh kombinasi perlakuan BAP 2 ppm dan NAA 2 ppm (Gambar 4). Pada perlakuan tersebut, tunas yang dihasilkan mempunyai batang yang lurus dan tunas yang kokoh dan kompak. Daun yang dihasilkan juga berwarna lebih hijau dan secara langsung akan berpengaruh pada ketegaran dari tunas, yaitu tunas menjadi lebih kuat dan kokoh. Warna daun yang terbentuk merupakan indikator kandungan klorofil dalam daun. Daun yang berwarna hijau mengandung klorofil lebih banyak yang diperkirakan akan berhasil tumbuh baik di lapangan pada saat aklimatisasi, karena asimilat yang digunakan untuk pertumbuhan tanaman terbentuk dalam jumlah yang lebih banyak.
Kemunculan Akar
Planlet yang telah menghasilkan akar akan lebih mudah hidup dalam aklimatisasi. Fungsi utama akar bagi tanaman adalah menyerap zat hara dan air dari media tumbuhnya. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diketahui bahwa perlakuan yang mampu merangsang pembentukan akar adalah perlakuan BAP 2 ppm dan NAA 2 ppm dengan panjang akar 1 cm. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian auksin pada eksplan tanaman jeruk keprok Tawangmangu dengan konsentrasi tersebut telah cukup untuk merangsang pembentukan akar.
Skoog dan Miller (1957), menyatakan bahwa auksin digunakan untuk merangsang pembentukan dan pertumbuhan akar. Selain itu auksin dalam media tumbuh juga dapat mengakibatkan terjadinya pembelahan dan pemanjangan sel (Martino, 1997). Sementara Maruyama et al. (1997) melaporkan bahwa sitokinin pada konsentrasi tinggi dapat
Gambar 4. Ketegaran Tunas In Vitro Jeruk Keprok Tawangmangu Pada Umur 3 Bulan.
menghambat pembentukan akar pada Guazuma crinita Mart. Pada penelitian ini, akar pada eksplan jeruk keprok Tawangmangu muncul dari sisi samping pada pangkal batang dengan warna kuning keputihan.
Penampilan Kalus
Penampilan kalus yang meliputi warna dan tekstur kalus dapat dijadikan sebagai acuan bahwa kalus tersebut bersifat embriogenik atau tidak. Pada umumnya tekstur kalus ada dua macam, yaitu kompak dan remah (friabel). Kalus yang kompak berbentuk gumpalan, sedangkan kalus yang remah mudah dipisahkan dan biasanya digunakan untuk kultur suspensi (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Berdasarkan hasil pengamatan kalus secara umum pada perlakuan penambahan NAA akan menghasilkan kalus, walaupun tiap perlakuan memberikan bobot kalus yang tidak sama. Dixon (1993) menyatakan bahwa produksi kalus pada medium padat dapat diinduksi oleh auksin dan pada umumnya kalus yang dihasilkan bertekstur remah. Peningkatan konsentrasi auksin akan meningkatkan friabilitas kalus. Maftuchah et al. (1998) menambahkan bahwa kalus yang friabel dapat mendukung keberhasilan pada tahapan kultur berikutnya. Pada akhir pengamatan dalam penelitian ini, yaitu pada akhir bulan ke tiga, kalus-kalus yang terbentuk belum menunjukkan adanya tanda-tanda berdiferensiasi untuk menghasilkan tunas adventif dan akar adventif.
KESIMPULAN
Kombinasi perlakuan BAP dan NAA masing-masing dengan konsentrasi 2 ppm dapat menghasilkan tinggi tunas tertinggi, jumlah daun terbanyak, dan bobot tunas terberat. Perlakuan tersebut juga dapat menginisiasi terbentuknya akar dan menghasilkan ketegaran tunas yang kokoh dan kompak, sehingga memberikan pertumbuhan dan perkembangan eksplan jeruk keprok Tawangmangu yang lebih baik.
DAFTAR PUSTAKA
Andriyanto, M.N.T. 2002. Pengaruh Konsentrasi 2,4-D dan BAP terhadap Multiplikasi Jeruk Keprok Tawangmangu (Citrus nobilis Lour) Secara In Vitro pada Media Woody Plant (WPM). Skripsi. Fakultas Pertanian UNS. Surakarta.
Astuti, M.E.D. 1996. Evaluasi ketahanan varietas jeruk terhadap penyakit CVPD isolat Lumajang. www.citrusindo.org/index.php?option=com_content&task=view&id= 148&Itemid=142 Diakses tanggal 21 April 2007.
Avivi, S. dan Ikrarwati. 2004. Mikropropagasi pisang abaca (Musa textillis Nee) melalui teknik kultur jaringan. Jurnal Ilmu Pertanian 10(2) : 27-34.
Hendaryono, D.P.S. dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. PT Kanisius. Yogyakarta. Maftuchah, Ardiana H.K. dan Joko B.S. 1998. Induksi kalus Artemisia (Artemisia vulgaris L.) melalui
kultur in vitro. J. Trop. 6(2) : 135-141.
Martino, D. 1997. Tanggap pengkalusan eksplan embrio melinjo (Gnetum gnemon L.) terhadap berbagai komposisi NAA dan BAP pada kultur in vitro. Buletin Agro. Universitas Jambi 1(3) : 173-176.
Maruyama, E., K. Ishii, I. Kinoshito, K. Ohba dan A. Saito. 1997. Micropropagation of Guazuma crinita Mart by root and petiole culture. J. In Vitro Plant 33(2) : 131-135.
Priyono. 2000. Perbanyakan abaca (Musa textilis Nee) melalui kultur mata tunas secara in vitro.
Agrivita 2(2) : Juni - September 2000. Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya. Malang. Raharja, P.C dan W. Wiryanta. 2003. Aneka Cara Memperbanyak Tanaman. Agromedia Pustaka.
Jakarta.
Santoso, U dan F. Nursandi. 2004. Kultur Jaringan Tanaman. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.
Simatupang, S. 1991. Pengaruh konsentrasi benzil amino purine dan lama penggelapan terhadap pertumbuhan stek kentang in vitro. J. Hortikultura 1(2) : 38-44.
Sriyanti, D.P. 2000. Pelestarian tanaman nilam (Pogostemon heyneanus Benth.) melalui kultur mikrostek. BioSmart 2(2) : 19-22.
Wetherell, D.F. 1982. Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro. Every Publishing Ground Inc. Wayne, New Jersey.
Wetter, L.R. dan Constabel. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Penerbit ITB. Bandung.
Yelnitis, N. Bermawie dan Syafaruddin. 1999 Perbanyakan klon lada varietas Panniyur secara in vitro. Jurnal Penelitian Tanaman Industri Vol 5 No 3. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Perkebunan. Bogor.
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Agro Media Pustaka. Jakarta.
