Idenshi hatsugen kaiseki ni yoru Euglena gracilis yunikuna tato paramiron gosei koso idenshi koho no sukuriningu

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). 遺伝子発現解析によるEuglena gracilisユニークな多糖パラミロン合成酵素遺伝子候補のスクリーニング 吉田, 勇太(Yoshida, Yuta) 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2014 生命と情報 No.21 (2014. ) ,p.66- 72 単細胞真核生物Euglena gracilis(和名：ミドリムシ)が生産する貯蔵脂質ワックスエステルは, 工業 的に精製することでジェット燃料として利用できるためバイオ燃料リソースとして期待される。 このE. gracilisは好気条件下で光合成により独立的に炭素同化を行い, この生物独特の貯蔵糖パラミロン(ß-1,3-グルカン)を細胞質に蓄積する。この後, 嫌気条件下に置かれると、パラミロンを分解し, ミリスチルミリスチン酸(14:0-14:0)を主成分とす るワックスエステルを細胞内に蓄積する。このパラミロンからワックスエステルへのユニークな 合成の過程において, エネルギー消費を伴わず, 解糖系での基質レベルのATP獲得が可能であるため, この合成経路は『ワックスエステル醗酵』と呼ばれる。その他にもE. gracilisはバイオ燃料生産に 有用な環境耐性を複数持つためオイル生産生物として有望視されている。しかし, ワックスエステ ル合成酵素やパラミロン合成酵素などのワックスエステル発酵経路に関与する酵素やその調節メ カニズム, そして核ゲノム配列などが依然として不明であり, 遺伝子レベルでの研究の遅れが大きな問題の一つとしてあげられる。そこで本研究では, RNASeqを用いた網羅的な遺伝子発現解析を行うことで, ワックスエステル発酵調節メカニズムの解明 を目的とする。好気条件•嫌気条件で培養したサンプル間での発現量比較を行ったところ, 有意に 発現変動している遺伝子のなかからパラミロン合成酵素遺伝子候補配列を2つ見出した。共同研究 先でのwet実験によりノックダウン株が作成され, 候補配列のうちの1つで顕著なパラミロン蓄積量 の減少が確認された。より詳細な酵素の活性を確認するため, 組み換え体作成やEuglenaでの過剰発現株の作成が予定されている。まとめとして, 今回の発現変 動解析によって予想された全ての遺伝子をワックスエステル醗酵経路上に可視化した。 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2014年度学生論文集 修士論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000021 -0066.

2014 年 度 （ 平 成 26 年 度 ）. 修士論文ダイジ:!:スト. 遺伝子発現解析によるEuglena gracilisユニークな 多糖パラミロン合成酵素遺伝子候補のスクリーニング. 慶 應 義 塾 大 学 大 学 院 政 策 •メ デ ィ ア 研 究 科 吉田勇太. 要旨. 単 細 胞 真 核 生 物 Ewg/e如 grac/fo (和 名 ：ミ ド リ ム シ ）が 生 産 す る 貯 蔵 脂 質 ワ ッ ク ス エ ス テ ル は ， 工 業 的 に精製することでジェット燃料として利用できるためバイオ燃料リソースとして期待される.. この E.. g ra c ilis は 好 気 条 件 下 で 光 合 成 に よ り 独 立 的 に 炭 素 同 化 を 行 い ， こ の 生 物 独 特 の 貯 蔵 糖 パ ラ ミ ロ ン (p-1,3- グ ル カ ン ） を 細 胞 質 に 蓄 積 す る . こ の 後 ， 嫌 気 条 件 下 に 置 か れ る と 、 パ ラ ミ ロ ン を 分 解 し ， ミリ ス チ ル ミ リ ス チ ン 酸 （1 4 :0 -1 4 :0 ) を 主 成 分 と す る ワ ッ ク ス エ ス テ ル を 細 胞 内 に 蓄 積 す る .こ の パ ラ ミ ロ ン か ら ワ ッ ク ス エ ス テ ル へ の ユニークな 合 成 の 過 程 に お い て ， エ ネ ル ギ ー 消 費 を 伴 わ ず ， 解 糖 系 で の 基 質 レ ベ ル の ATP獲 得 が 可 能 で あ る た め ， こ の 合 成 経 路 は 『ワ ッ ク ス エ ス テ ル 醚 酵 』 と 呼 ば れ る . そ の 他 にも五. g ra c /fe は バ イ オ 燃 料 生 産 に 有 用 な 環 境 耐 性 を 複 数 持 つ た め オ イ ル 生 産 生 物 と し て 有 望 視 さ れ て いる.. しかし， ワ ッ ク ス エ ス テ ル 合 成 酵 素 や パ ラ ミ ロ ン 合 成 酵 素 な ど の ワ ッ ク ス エ ス テ ル 発 酵 経 路 に 閨. 与する酵素やその調節メカニズム， そして核ゲノム配列などが依然として不明であり，遺伝子レベルで の 研 究 の 遅 れ が 大 き な 問 題 の 一 "5 と し て あ げ ら れ る . そ こ で 本 研 究 で は ， RNA-Seq を 用 い た 網 羅 的 な 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 う こ と で ， ワックスエステル発酵調節メカニズムの解明を目的とする. 好 気 条 件 •嫌 気条件で培養したサンプル間での発現量比較を行ったところ，有意に発現変動している遺伝子のなかか ら パ ラ ミ ロ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子 候 補 配 列 を 2 つ 見 出 し た . 共 同 研 究 先 で の wet 実 験 に よ り ノ ッ ク ダ ウ ン 株 が 作 成 さ れ ， 候 補 配 列 の う ち の 1つ で 顕 著 な パ ラ ミ ロ ン 蓄 積 量 の 減 少 が 確 認 さ れ た . よ り 詳 細 な 酵 素 の 活 性 を 確 認 す る た め ， 組 み 換 え 体 作 成 や 五 wg/emTCの 過 剰 発 現 株 の 作 成 が 予 定 さ れ て い る . ま と め と し て，今 回 の 発 現 変 動 解 析 に よ っ て 予 想 さ れ た 全 て の 遺 伝 子 を ワ ッ ク ス エ ス テ ル 醱 酵 経 路 上 に 可 視 化 し た.. K eyw ord: 五Mg/ena， バ イ オ 燃 料 ， ワ ッ ク ス エ ス テ ル 酴 酵 ， パ ラ ミ ロ ン ， RNA-Seq ， 遺 伝 子 発 現 変 動解析. 66.

1 . 1 研究背景 汾 /g/M a は 鞭 毛 に よ り 移 動 し ， 従 属 栄 養 で 生 育 で き る 一 方 ， 自 身 が 持 つ 葉 緑 体 に よ り 光 合 成 を 行 う ことで独立的に栄養獲得を行う事ができる.. この特性から，五 は 動 物 と 植 物 の 両 方 の 側 面 を. 持 っ た ユ ニ ー ク な 生 物 で あ り ， 進 化 学 • 分 類 学 の 見 地 か ら も 興 味 深 い 生 物 種 で あ る [ 1, 2 ] ま た ， 五 は 動 物 性 . 植 物 性 の 両 方 の タ ン パ ク 質 を 合 成 す る こ と が で き ，五 だ け が 持 つ 特 別 な 生 体 構 造や代謝物，生合成系が見つかっている.. こ の 生 物 は 好 気 条 件 下 で 及 /g/emi独 特 の 合 成 物 質 で あ る パ ラ. ミロン（ P-1,3- グ ル カ ン ）を 貯 蔵 多 糖 と し て 細 胞 質 に 蓄 え ， 嫌 気 状 態 に な る と ， こ の 糖 を 分 解 し ， 同じく 五Mg/emi独 特 の 貯 蔵 脂 質 で あ る ワ ッ ク ス エ ス テ ル を 合 成 し て 嫌 気 的 に エ ネ ル ギ ー を 得 る . こ の 一 連 の 代 謝 経 路 は £ 叹 レ《« で し か 見 つ か っ て お ら ず ， 『ワ ッ ク ス エ ス テ ル 発 酵 』 と 呼 ば れ る [3 ] . ミ リ ス チ ン 酸. (C 1 4 )と ミ リ ス チ ル ミ リ ス テ ー ト （ C 1 4 -C 1 4 ) を 主 成 分 と す る ワ ッ ク ス エ ス テ ル は ， バ イ オ 燃 料 の 中 で も 特にジヱット燃料の組成に近く，有力なリソースと成り得る. 日 本 に お け る 及 /g/e 似 バ イ オ 燃 料 研 究 に お い て は ， 共 同 研 究 先 で あ る 島 根 大 学 石 川 孝 博 教 授 を 代 表 と した CREST ( 戦 略 的 創 造 研 究 推 進 事 業 ） の プ ロ ジ ェ ク ト が 進 行 中 で あ る . こ れ ま で に プ ロ ジ ェ ク ト 成 果 と し て ， £ 叹 /6似 核 ゲ ノ ム へ の 遺 伝 子 導 入 法 が 確 立 し 特 許 が 取 得 さ れ て い る .. また， 株 式 会 社 ユ ー グ. レ ナ に よ っ て ， 現 行 よ り も 高 効 率 で 大 規 模 な 野 外 開 放 系 大 量 培 養 系 の 確 立 が 進 め ら れ て い る .こ れ ら の 技 術 を 用 い て 五 Mg/ewiワ ッ ク ス エ ス テ ル 過 剰 発 現 株 を さ く せ い す べ く 研 究 が 行 わ れ て い る が ， ワックス エステル酸酵経路は未だ詳しい生理活性がわかっていない酵素も多く， その調節メカニズムも不明であ る. そ し て 最 も 大 き な 問 題 と し て ， 遺 伝 子 レ ベ ル で の 研 究 の 遅 れ が あ げ ら れ る . 1993年 に Hallick らによ りカルビン回路研究の材料として，. 如みflcwm •. /?〇/タworp/za と い っ た 生 物 種 に 続 き. 五叹 /emi葉 緑 体 ゲ ノ ム の 全 構 造 が 決 定 さ れ て い る が [4]， ミ ト コ ン ド リ ア ゲ ノ ム ， 核 ゲ ノ ム は 依 然 と し て 未 解 明 な 状 態 で あ る . University of Cambridge の Field ら に よ り 核 ゲ ノ ム 解 析 が 進 め ら れ て い る と の 報 告 が あ るが， 現 状 （2015 年 1月 現 在 ）で は ゲ ノ ム 情 報 は 公 開 さ れ て い な い .. Korean Bioinformation Center. また， 発 現 遺 伝 子 情 報 に 閨 し て も ，. (http://cleanestkobic.re.kr/) が EST デ 一 夕 を 公 _ し て い る が ， 検 索 デ 一 夕. ベ ー ス と し て 利 用 で き る 十 分 な デ ー タ 量 と は 言 え な い . 五呢/em ?の 核 ゲ ノ ム の 予 想 サ イ ズ は 1.72><1〇9塩 基 染 色 体 数 は 45-50本 と 推 測 さ れ ， GC rich な 配 列 で あ る こ と ， リ ピ ー ト 配 列 が 多 い こ と [5] な ど が 解 析 を困難にしている理由としてあげられる. 本研究では， ワックスエステル醱酵調節メカニズムの解明を目的とした好気培養条件と嫌気培養条 件 間 で の 遺 伝 子 発 現 変 動 解 析 を 行 い ，嫌気条件で有意に発現変動する遺伝子をバイオインフォマティ クス手法で詳細に解析することで， ワックスエステル蓄積量に影響を与えるファクターの探索を行う. 先 行 研 究 に よ り ，嫌 気 条 件 下 で 特 異 的 に 活 性 上 昇 が 確 認 さ れ た 酵 素 や ワ ッ ク ス エ ス テ ル 合 成 に 必 須 の ユニークな酵素がいくつか報告されており， それらはワックスエステル酴酵を調節する可能性 を持つ重要な遺伝子とされている.. それら酵素に加え，嫌気条件で発現変動を起こす脂肪酸合成に関. する遺伝子や， ワックスエステル合成のリソースとなっているパラミロンの合成に関する糖合成系遺伝 子を本研究での主な解析対象とした. 今回の報告はダイジヱスト版のため， いくつか行った解析の中で も パ ラ ミ ロ ン の 合 成 に 閨 す る 遺 伝 子 解 析 の 結 果 の み を 示 す .解 析 の 全 体 に つ い て は 修 士 論 文 を 参 照 さ れ たい.. 1 . 2 対象と手法 ページ数の制約により省略した. 詳細は修士論文を参照されたい.. 1 . 3 結果 ページ数の制約によりいくつかの解析結果を省略した. 詳細は修士論文を参照されたい.. 67.

1 3 . 1 解析リードデータの概要とリファレンス配列の決定 仙 で は ゲ ノ ム 配 列 が 未 知 で あ る が ，発現解析を行うためにリファレンスとなる遺伝子配列が必 要 と な る . そ こ で 今 回 の 解 析 で は ， Trinity で ア セ ン ブ ル し た Contig 配 列 を 擬 似 的 な 五 Mg/e«a遺 伝 子 リ フ ァ レ ン ス 配 列 と し て 用 い た . Illumina HiSeq 2000 か ら 得 ら れ た デ 一 夕 を ア セ ン ブ ル し た 結 果 [6 ]， ア セ ン ブ ル で き た total Transcriptが 多 い こ と ， N 50 の 値 が 高 い こ と か ら リ フ ァ レ ン ス 配 列 に は 好 気 光 従 属 7 日目. ( 定 常 期 ） の Contig 配 列 を 使 う こ と が 適 切 で あ る と 推 測 し た . 表 1.1 に は Illumina MiSeq か ら 得 ら れ た 長 期 嫌 気 条 件 株 の リ ー ド デ 一 夕 を ま と め た . な お ， 今 回 得 ら れ た リ ー ド デ ー タ の ク オ リ テ ィ 一 は ， フ ィ ル タ リ ン グ 未 処 理 の 状 態 で も 平 均 Phred ス コ ア ー 2 0 を満た し て い た の で 特 に 処 理 を 行 わ ず raw read の ま ま 解 析 に 用 い た .. こ れ ら 長 期 嫌 気 条 件 株 の raw read を， リフア. レ ン ス 配 列 で あ る 好 気 光 従 属 7 日 目の C o n t ig 配 列 に Bowtie2 で マ ッ ピ ン グ し た 結 果 ， どのサンプノレにつ い て も 95% ほ ど の リ ー ド が マ ッ ピ ン グ さ れ た . 表 1.1 : 長 期 嫌 気 条 件 株 の リ ー ド デ ー タ と リ フ ァ レ ン ス 配 列 へ の マ ッ プ 率. Total Number or Reads (n=3). Aero photo heterotroph. Anaero dark heterotroph. 巳iological Replicate. 0 min. 24 h. 1. 24.9M (95.82%). 22.8M (95.73%). 2. 21.5M (95.29%). 20.8M (95.62%). 3. 17.7M (95.20%). 15.8M (95.61%). 解析対象とした培養株は，嫌気条件で7 日 間 （ 定常期）培養した株（ 便宜的に’’好気光従属0. m in”. とする） と，そこか. ら2 4 時間嫌気条件培養した株（ 便宜的に’’嫌気暗従属2 4 h ” とする）である. “T o ta ln u m b er o fR e a d s”. は“ sequenced. reads” x 2 (p a ir e d - e n d ) を表す.. ンス配列に全read の何％がマッピングされたかを示している.. （ M. 表中の（ ）の中の数はB o w tie 2 によってリフアレ = 106). 1 . 3 . 2 発現変動遺伝子解析結果とアノテーシヨン付与 長 期 嫌 気 条 件 株 （ 0 m in と24 h ) を 対 象 に し た 発 現 変 動 遺 伝 子 （ D E G ) 解 析 の 結 果 を 示 す .長 期 嫌 気 条 件 株 で は ， 定 常 期 で あ る 7 日 目 ま で 好 気 条 件 で 培 養 し た サ ン プ ル と ， そ こ か ら 嫌 気 条 件 で 24 時 間 培 養 した 2 地 点 間 の サ ン プ ル で の 発 現 変 動 解 析 を 行 っ た .. DEG を 抽 出 す る 前 に ， そ れ ぞ れ の サ ン プ ル で の 遺 伝 子 発 現 量 が ど の よ う に 分 布 し て い る か を 見 る た め 散 布 図 行 列 を 作 成 し た . biological replicate n=3 で の 「 好 気 光 培 養 0 m in と 嫌 気 暗 培 養 24 h 」 の 発 現 量. (F P K M ) デ ー タ を 散 布 図 行 列 で 示 し た （図 1 .1 ) .. 68.

図 1.1:好 気 光 培 養 0 m in と 嫌 気 暗 培 養 24 h の FPKM 散 布 図 行 列. 一つ一つの点は各遺伝子を表し，X 軸とY 軸は各サンプルでの遺伝子のFPK M 値 を 表 す （ 各プロットにおいてX 軸とY 軸のスケールが違うことに注意）. プロットの右上の点ほど発現量が大きく，左下ほど小さいため一般に点は左下 に固まる（ 一般に遺伝子発現は低発現量のものが多いため）. 左上 3 つ が 「 好気光培養0. m in 」，右下 3. つが「 嫌気. 暗培養2 4 h 」のサンプルでの発現量を表している.. 次 に ， D E G 解 析 の 結 果 を 表 し た M A プ ロ ッ ト が 図 1 .2 で あ る .. 結 果 ， edgeR に よ り 統 計 的 有 意. (F D R < 0 .0 5 ) に DEG で あ る と 判 定 さ れ た 遺 伝 子 は 2,131 個 で あ っ た . こ の う ち ， 低 発 現 量 の 遺 伝 子 を 除 去 す る た め に 好 気 条 件 / 嫌 気 条 件 の ど ち ら の 条 件 で も FPKM 値 が 1.0 以 下 を 示 す 遺 伝 子 は 除 去 し た . そ う し て 最 終 的 に 得 ら れ た DEG は 2,080 個 と な り ， 発 現 傾 向 と し て 嫌 気 条 件 で 発 現 上 昇 し て い る 遺 伝 子 は 800 個 で ， 発 現 減 少 し て い る 遺 伝 子 は 1， 280 個 で あ っ た .. 同 様 の 処 理 を F D R < 0.0 0 1 で 行 う と ， 538 個 の. DEG (433 個 が 嫌 気 条 件 で 発 現 上 昇 ， 105個 が 発 現 減 少 ） が 得 ら れ た . 今 回 は よ り 多 く の DEG を 対 象 に す る た め に FDR<0.05 で 得 ら れ た 2,080 結 果 に 対 し て 解 析 を 進 め た .. こ れ ら 2,080 個 の DEG についてアノ. テ 一 シ ョ ン 付 与 を 行 っ た . BLASTX で Swiss-Prot に 配 列 類 似 性 検 索 を 行 い ， E-value<le-5 の 閾 値 で 1,076 個がヒットした.. ヒ ッ ト し な か っ た 1,004個 の 遺 伝 子 に 関 し て は HMMER サ ー チ で Pfam-A に対してドメ. イ ン 検 索 を 行 い ， E-value < le-5 の _ 値 で 256 個 の 保 存 さ れ た ド メ イ ン を 抽 出 し た .. 69.

logCounts. 図1.2:好気光培養0 minと嫌気暗培養24 hのMAプロット（FDR < 0.05) 一つの点が一つの遺伝子を表している. X 軸は遺伝子発現強度を示し，右に行くほど発現量が高いことを意味する. Y 軸は発現の変動の倍率を示し，0 は変動がないことを意味し，〇 から上下に乖離するほど変動が大きいことを意味す. る. 赤のプロットは統計的に有意に発現の変動が認められた発現変動遺伝子。黒は非発現変動遺伝子を表す.. 1 . 3 . 4 パラミロン合成酵素候補遺伝子の解析. 本節は論文• 特許申請前のため公表を控えます.. 1 . 4 議論 本節は論文• 特許申請前のため公表を控えます.. 謝辞 最初に，本研究において慶應義塾大学政策• メディア研究科荒川和晴特任准教授には，研究に際し て多くの指導• 議論をして頂きました. そして，所属するG-languageグループメンバー，堀川大樹上席 研究員にもプログレスセミナー等々，コメント• 指摘•質問をしてもらい研究を深めることができまし た. 大変お世話になりました.そして刺激的な研究環境を与えてくださった環境情報学部冨田勝教授 に厚く御礼申し上げます. 本研究テーマは，島根大学石川孝博教授を研究代表とする科学技術振興機 構（ JST) 戦略的創造研究推進機構（ CREST)に採択された『 形質転換Euglenaによるバイオ燃料生産基盤 技術の開発』研究の一部であり，近畿大学農学部田茂井政宏准教授の研究グループと株式会社ユーグ レナ鈴木健吾研究部長の研究グループとの共同研究による成果でもあります.. 参考文献リスト 1 . Baldauf SL: The deep roots of eukaryotes. Science 2003, 300(5626): 1703-1706. 2. Adi SM, Simpson AG, Lane CE, Lukes J, Bass D, Bowser SS, Brown MW, Burki F, Dunthom M, Hamol V et al:T h e revised classification of eukaryotes. The Journal of eukaryotic microbiology 2012, 59(^5): 429-493. 3. Inui H, Miyatake K, Nakano Y, Kitaoka S.: Wax ester fermantation in Euglena gracilis. FEBS Letters 1982, 150(l):89-93. 4. Hallick RB, Hong L, Drager RG, Favreau MR, Monfort A, Orsat B, Spielmann A, Stutz E: Complete sequence o f Euglena gracilis chloroplast DNA. Nucleic acids research 1993, 21(15):3537-3544. 5. Rawson JR: A measurement of the fraction of chloroplast DNA transcribed in Euglena. Biochemical and biophysical research communications 1975, 62(3):539-545.. 6. Yoshida Y. AK, Tomita M” Ishikawa T.: De novo Assembly of Euglena gracilis Genes from RNA-Seq Data. Spring Term Paper 2013.. 70.

7. Okada H, Abe M, Asakawa-Minemura M, Hirata A, Qadota H, Morishita K, Ohnuki S, Nogami S, Ohya Y: Multiple functional domains of the yeast 1,3-beta-glucan synthase subunit Fkslp revealed by quantitative phenotypic analysis of temperature-sensitive mutants. Genetics 2010, 184(4):1013-1024..

図 SI : 3 つ の パ ラ ミ ロ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子 候 補 の マ ル チ ブ ル ア ラ イ メ ン ト 結 果. =…. 、一. —. 丨. S. I. H. '. S. s. ■ 獨 攤. 泉. •KAWomov. ------- … … ハ 一. I. S. i. 3. S. コ^ ?. 2. 5 E S 3 S rE ! H illS S S S ： ：. -r ；3. i ^ P i * :: S iS S IE * 31113H S S !. ニS F * S “. '. }M<i. ■■?.S ><i.. ,. i?.?iW .... >^^<. , .^?5S^,<,. >?>i»,.... n^mSt-i^Z' >s^i. <?«»8?$你 >»メ 、 辦)^?1 抑 餘 绝ノ 幻 ？ 秘 »4 S3««w> «$»<wt WiM^ jW . 'がW < 州辦■嫩伽.. &..... ..... .. ... 抑. ...，...，ぶ^^.、',..、3.i令 ■><.-、バ ^ ぃ ■ ，. ■ ね j 、、..，-n-::.. v. .ぃ "錄漂、 .、 、 ， ， ， 線 狡...极sa->、 、 '"純妨へ....鉍純， ....3 > M&,> ..H m .,.,, z m i -.,-. »><<.a m. 一 蝴 8«4•从 が .,妙 ^*辦物l 衫 滅 极 、 效 »v»と *ノ抑鄉 〜»3»t^.m* > «ws^ !i«^嫩 ^i«> »物 «* 棚 构 .声 《 〇 ^_,ノ 料 粉 ^、 .》 妙 一列目がPA S2 目がPAS1. (com p36539_ c 4 ) , 二列目がcom p3 6 0 1 0 _ c 4 ( 今回の解析ではパラミロン合成酵素遺伝子候補から除去)，三列. (com p3 6157_ c 0 ) の配列を表す.. 72.