kerusakan akihat faktor biotik, khususnya oleh mikroorganisme patogen. Plasma

Pemuliaan tanaman untuk karakter resistensi atall toleran terhadap penyakit merupakan salah satll cara efektif untuk melindungi tanaman dari kerusakan akihat faktor biotik, khususnya oleh mikroorganisme patogen. Plasma nutfah yang mempunyai karakter resisten terhadap penyakit yang mewaris dari satll generasi ke generasi berikutnya sangat berharga, karena dengan demikian plasma nutfah tersebut dapat dengan mudah digunakan dengan menghemat biaya pengendalian hama dan penyakit secara signiftkan. Di samping itu, secara ekologi. budidaya tanaman menggunakan varietas tahan penyakit sangat ramah lingkungan. Namun demikian, terdapat beberapa kendala untuk mendapatkan varietas unggul baru yang laban penyakit, sekaligus berproduksi tinggi. Beherapa kendala tersehut meliputi variabilitas patogen dalam huhungarmya dengan ketahanan inang. tidak adanya tetua donor yang membawa gen resistensi, te~adinya linkage drag jika gen resistensi terdapat pada tanarnan yang herkerabat jaub, atau tanaman yang secara agronomi kurang menguntungkan (Johnson 1992, Wynne el al. 1991 ). Pada kacang tanab, pemuliaan untuk karakter resistensi terhadap penyakit pada umumnya dilakukan dengan earn hibridisasi dan seleksi (Norden el al. 1982,

Knauft

dan Ozias-Akins \995).

Salah satu penyakit penling kacang tanab yang dapat menyebabkan kerusakan dan penurunan hasil secara nyata adalah busuk batang SclerOlium (southern stem rot) yang disebabkan oleh infeksi Sclerotium rolfsii. Penyakit ini relatif sulit untuk dikendaIikan secara

kimia,

karena inangnya sangat beragarn (200-500 tanaman), dan pada siklus hidupnya dapat membentuk sklerosia yang

dapat bertahan hidup di dalam tanah dalam waktu lama (Backman 1984, Punja 1985). Sejaub ini, hanya beberapa galur atau aksesi yang te1ah di1aporkan mempunyai resistensi parsial terhadap S. rolfsii, diantaranya NC 2 dan NC 3033 (Wynne el al. 1991).

Di Indonesia belurn ditemukan genotipe atau varietas kacang tanah yang resisten terhadap S. rolfsii (Rani 200 I, Widyanti 2001). sehingga tetua donor dengan gen resistensi terhadap penyakit ini belum ada. Oleh karena itu, pada tahap awal penelitian disertasi ini telah dievaluasi sebanyak 30 genotipe kacang tanah untuk reaksinya terhadap infeksi

S.

rolfsii di rumah plastik. Agar evaluasi tersebut efektif, sebeJumnya telab dikembangkan metode inokulasi cendawan patogen tersebut ke pangkal batang kacang tanah. Dari peneiitian ini dapat disimpulkan bahwa metode inokulasi yang paling efektif adalah dengan carn me1ukai pangkal batang kacang tanah dengan jarum, menempe1kan inoku1urn pada bagian batang yang dilukai.

dan

menimbun inokulum dengan tanah. Dari pene1itian tersebut juga disimpulkan bahwa dari 30 genotipe yang diuji, tidak didapatkan kacang tanah yang tahan terhadap S. rolfsii.

Salah satu cara meningkatkan variabilitas genetik tanpa hibridisasi adalah dengan pengulturan sel atau jaringan tanaman (Larkin dan Scowcroft 1981). Pengulturan jaringan tanaman, terutama yang melalui tahapan pembentukan kalus haik pada organogenesis maupun embriogenesis somatik telah banyak. dilaporkan menyebabkan perubahan genetik yang menyebabkan beragarn kelainan sifat dari tanaman awal sumber eksplan (Skirvin dan Janick 1976, Calelf 1983, Scowcroft ef aI. 1985, George 1996). Fenomena timbulnya vari.bilitas genetik pada tanaman yang diregenerasikan melalui kultur sel dan jaringan lazim disebut

dengan variasi somaklonal. Dalam membantu pemuliaan tanarnan untuk sifat resistensi terhadap penyakit, induksi variasi somaklonal sering kali diikuti dengan seleksi in vitro menggunakan agens penyeleksi berupa toksin yang dikeluarkan oleh patogennya (Daub 1985, Wenzel 1985, Hammerschlag 1992). Keberhasilan kombinasi kedua metode tersebut (variasi somaklonal dan seleksi in vitro) bergantung pada tersedianya teknik regenerasi in vitro yang reproducible, adanya agens penyeleksi yang dapat menyebabkan kondisi selektif terhadap sel atau jaringan yang dikulturkan, dan adanya korelasi positif antara ekspresi fenotipik pada tingkat sel dengan ekspresi pada tanaman utuh.

Dalam patogenesisnya, S. rolfsii menge1uarkan sejumlah besar asam oksalal (OA), yaitu fitotoksin yang bertanggung jawab pada kematian jaringan tanaman, sebelum dan seiring dengan pertumbuhan miseHa pada jaringan tanaman yang terinfeksi (Backman 1984, Punja 1985, Punja et al. 1985). Toksin yang terdapat dalam ekstrak kasar filtrat kultur S. rolfsii mungkin dapat digunakan sebagai agens penyeleksi pada kultur kalus embriogenik kacang tanah. Di lain pihak, sistem regenerasi kacang

tanah

melalui embriogenesis somatik yang mapan telab dilaporkan sebelunmya oleh Edy (1998) dan Sulichantini (1998). Oleh karena itu, percobaan selanjutnya dilakukan untuk mencarl teknik seleksi in vitro embrio somatik kacang tanah dalam medium yang mengandung filtrat kultur S. rolftii dan regenerasi planlet menjadi tanaman. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa penambahan 30% filtrat kultur S. rolfsii telah menyebabkan kondisi sub-lethal pada embrio somarik yang diknlturkan selama 3 periode pengulturan masing-masing satu bulan. Setelab periode seleksi, dihasilkan sejumlah embrio somatik yang insensitifterhadap filtrat kultur cendawan.

Setelah mengalami tahapan pemulihan, maturasi dan pengecambahan,

embrio somatik dapat diregenerasikan menjadi 50 planlet, yang seianjutnya

dipindahkan untuk ditanam di rumah plastik hingga panen. Benih RO: 1 dipanen secara terpisah berdasarkan masing-masing nomor RO, lalu dikeringkan. Pada musim berikutnya, ditanam tanaman somaklon Rl dari benih RO: 1, hingga menghasilkan benih Rl:2 yang juga dipanen secara terpisah berdasarkan masing-masing Domor galur Rl. SeJanjutnya pada musim berikutnya ditanam tanaman

R2 dari benih R 1 :2.

Tujuan akhir penelitian disertasi ioi adalah untuk mendapatkan varian somaklonal kacang tanah yang resisten terhadap penyakit busuk batang Sclerotium. Untuk itu, evaluasi respons ketahanan varian somaklon terhadap penyakit target pada umumnya tidak dilakukan pada somaklon generasi RO,

melainkan pada somaklon generasi Rl dan R2, atau bahkan generasi berikutnya

Hal ioi diJakukan untuk meyakinkan bahwa karakter resistensi terhadap penyakit Gika didapatkan) bersifat mewaris dengan stabil.

Dalam seleksi in vitro, sel atau jaringan diseleksi berdasarkan fenotipe insensitivitas diantara populasi kalus embriogenik yang sensitif terhadap FK cendawan. Dengan demikian sel atau jaringan varian yang insensitif hasH seleksi

in vitro diduga telah mengalami mutasi yang dikendalikan oleh gen dominan atau telah mengalami mutasi ganda (jika mutan homosigot), sehingga identitas varian dapat dievaluasi pada generasi RO. Pengulturan tunas RO basil seleksi in vitro

dalam media selektif MSO yang mengandung filtrat kultur cendawan S. rolfsii

diajukan sebagai metode identifikasi dini untuk tunas varian yang resisten terhadap S. rolfsii. Tunas RO yang insensitif terhadap FK cendawan diharapkan

juga merupakan tunas yang resisten terhadap S. rolfsii. Percobaan selanjutnya adalah membandingkan metode pengujian tunas RO dan metode inokulasi dengan

S. rolfsii pada potongan daun atau anak dauD tanaman RO (detached leaf test) dengan inokulasi yang dilakukan pada somaklon generasi Rl di rumah plastik.

Dari percobaan ini dapat disimpu1kan babwa pengulturan tunas RO dalam media selektif berisi 30% filtrat kultur cendawan dapat digunakan sebagai identifikasi dini galur kacang tanah yang taleran terhadap infeksi S. rolfsii hasil seleksi in vitro. Walaupun dernikian. pengujian resistensi terhadap S. ro/fsii perlu dilakukan terhadap varian somaklonal pada generasi selanjutnya (R2) untuk mempelajari apakah karakter tersebut secara konsisten mewaris dan stabil, sekaligus uotuk menyeleksi karakter agronomi unggul yang lain.

Kalaupun dari penelitian ini pada akhimya didapatkan vanan dengan fenotipe resisten terhadap penyakit busuk batang, hal lain yang perlu diperhatikan

adalah keragaan agronomis dari varian somaklon tersebut. Hasil akhir yang dibarapkan dari penelitian disertasi ini adalab didapatkannya sifat resistensi terhadap penyakit pada varian somaklon yang keragaan agronontisnya tidak lebih jelek daripada tanaman awal. Dengan kata lain, varian somaklon kacang

tanah

yang resisten terhadap

S.

rolfsii dibarapkan juga menghasilkan pnlong bemas dalam jumlab yang sarna atau lebih banyak dibandingkan dengan tanaman awal yang sehat.

Oleh karena itu, percobaan selanjutnya bertujuan untuk mengevaluasi keberadaan

dan

frekuensi keragaman

karakter

morfologi, agronomi atau fisiologi pada pnpulasi tanaman kacang tanab yang diregenerasikan dari ES yang insensitif terhadap filtrat kultur cendawan basil seleksi in vitro, dan menentukan

keragaman karakter yang diamati sebagai penyimpangan akibat faktor genetik atau epigenetik dengan mengamati keberadaannya di antara populasi RO, RI dan R2, serta mengidentifikasi galur-galur varian somaklonal yang menunjukkan sifat-sifat penting yang dapat digunakan sebagai plasma outfah barn kaeang tanab.

HasH pengamatan menunjukkan bahwa, varian somaklonal kacang tanah yang dijumpai untuk karakter kualitatif maupun kuantitatif banyak yang bernilai agronomi negatif. Akan tetapi. sejumlah nomor galur R2 zuriat nomor-nomor RO tertentu mempunyai tinggi tanaman dan jumlah polong bemas yang sarna atall lebih tinggi dan jumlah polong cipo yang sarna atall lebih sedikit daripada nilai tanaman awalnya Dipedukan pengujian Iebih lanjut untuk menapis karakter varian yang resisten terhadap infeksi S.rolfsii pada populasi tanaman somaklon

tersebut sehingga pada akbimya didapatkan karakter yang diharapkan, yaitu varian somaklonal yang resisten terhadap penyakit busuk. batang Sclerotium, sekaligus mampu mengbasilkan polong bemas dalam jumlab sama atau lebih besar daripada tanaman awal yang tidak diinokulasi.

HasH evaluasi respons tanaman somaklon Rl dan R2 terhadap inokulasi

dengan S. rolftii di rumab plastik menunjukkan babwa dati 18 tanaman somaklon RI zuriat dari 6 galur RO yang diinokulasi dengan S. rolftii, didapatkan \0 somaklon yang bertahan hidup dengan gejala penyakit pada skor 2 atau 3, dan menghasilkan benib Rl :2. Hasil inokulasi dengan S. rolftii pada populasi

tanaman R2 zuriat galur Rl terpilih menunjukkan bahwa dari 158 nomor R2 yang diinokulasi dan terinfeksi S. rolftii terdapat 66 tanaman yang pada aWainya menunjukkan gejala penyakit dengan skor 1-3, diikuti dengan indikasi resistensi

terhadap penyakit yang ditandai dengan munculnya gejala penyemhuhan luka pada lesio. Dari 66 tanaman yang resisten tersebut, beberapa tanaman hanya menghasilkan polong bemas lebih sedikit, namun 20 somaklon resisten yang lain mampu menghasilkan poiong bernas yang hampir sarna atau lebih besar dibandingkan tanaman kacang tanah awal yang tidak diinokulasi. Dengan

demikian, tujuan akhir dari disertasi ini, yaitu mendapatkan varian somaklon kacang tanah yang resisten terhadap penyakit busuk batang Sclerotium melalui induksi variasi somaklonal dan seleksi in vitro ernbrio somatik dengan agens penyeleksi herupa 30% filtrat kultur S. rolfsii, telab tercapai. Walaupun demikian, penelitian lebih lanjut untuk mengevaluasi kestabilan sifat resisten terhadap penyakit busuk batang dan mendapatkan mutan homozigot pada generasi berikutnya melalui beberapa selfing masih perlu dilakukan.

Mekanisme ketahanan yang terjadi pada varian somaklonal yang resisten

terhadap penyakit busuk batang diduga berhubungan dengan detoksifikasi salah satu faktor patogenisitas S. rolfsii yaitu asam okaalat (OA). OA disekresikan oleh

S. rolfsii pada awal dan selama proses patogenesisnya, dan berperan dalam kematian jaringan inang bersama-sama dengan· enzim-enzim pendegradasi

dinding sel (Punj. 1985). Oleh karen. itu, filtrat kultur S. rolfsii yang digunakan

untuk seleksi in vitro kemungkinan besar mengandung sejwnlah besar asam

okaalat. Filtrat kultur cendawan mempunyai pH sang.t asam, yaitu 2.9 - 3.0. Enzim pendegradasi dinding sel di dalam filtrat kultur cendawan mungkin tidak aktif lagi karena sebelum disaring biakan cendawan disterilkan dengan autoklaf.

Strategi yang umum digunakan untuk menjadikan suatu tanaman resisten terhadap cendawan patogen yang mensekresikan OA adalah dengan

mendegradasi OA tersebut pada saat awal terjadinya infeksi (Lu 2003). Salab satu enzim yang dapat mengubah OA menjadi produk yang tidak toksik bagi tanaman adalah oxalate oxidase (OXO) (Lane et at. 1991). Enzim ini ditemukan di banyak tanaman, yaitu gandum, barley, jagung, oat, padi, rye dan cemara (Dunwell el al. 2000,

Lane

2002). Oleh karena itu, besar kemungkinan kacang

tanah juga mempunyai gen penyandi enzim ini. OA memang telah ditemukan di banyak tanaman dalam konsentrasi rendab di vakuola (~alis~an 2000). Diduga, tanaman somaklon resisten kacang tanah yang didapatkan dalam penelitian ini

telah mengalami ekspresi berlebih enzim OXO setelah mengalarni seleksi in vitro

dengan agens penyeJeksi yang mengandung OA. Hal ini dapat disebabkan oleh tidak aktifnya trans-acting/actor yang semula menghambat aktivitas enzim

axo

atau terjadinya duplikasi sekuen gen penyandi OXO karena terjadi chromosomal rearrangengement. Perubahan genetik yang mendasari terjadinya variasi somaklonal meliputi mutasi titik (single nucleotide changes), perubahan jumlah kopi gen tertentu, aktivasi transposable element, perubahan jumlah kromosom, chromosomal rea"angenements, dan metilasi DNA (Scowcroft 1985, Hanunerschlag 1992).

Dengan dipaparkannya serangkaian hasil penelitian disertasi ini, maka hal yang terpenting adalab babwa induksi variasi somaklonaI yang diikuti dengan seleksi in vitro menggunakan filtrat kultur cendawan patogen telah terbukti dapat diguiiakan untuk: mendapatkan tanaman varian somaklonal yang resisten terhadap patogen yang bersangkutan.