19 BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN
Penelitian ini diawali dengan pemeriksaan bahan baku. Pemeriksaan bahan baku yang akan digunakan dalam formulasi mikroemulsi ini dimaksudkan untuk standardisasi agar diperoleh produk yang bermutu. Bahan baku meliputi minyak kelapa murni dan zat aktif dl-alfa tokoferol asetat. Alfa tokoferol asetat dikarakterisasi berdasarkan persyaratan yang terdapat dalam British Pharmacopoea 2002. Pemeriksaan dl-alfa tokoferol asetat memperlihatkan data percobaan yang sesuai dengan data pustaka.
Tabel 4.1 Karakterisasi dl-Alfa Tokoferol Asetat
Pemeriksaan Persyaratan (BP 2002) Hasil Pemerian Cairan berminyak, jernih, kental,
warna agak kuning kehijauan.
Sesuai
Identifikasi Spektrum serapan ultra violet larutan dl-alfa tokoferol asetat dalam etanol mutlak menunjuk- kan maksimum pada 284 nm, bahu pada 278 nm, dan minimum pada 254 nm.
Spektrum serapan ultra violet larutan alfa tokoferol asetat dalam etanol mutlak menunjukkan maksimum pada 286 nm, bahu pada 280, dan minimum pada 256 nm.
Kelarutan Praktis tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol mutlak, dalam aseton, dalam kloroform, dalam eter, dan dalam minyak lemak, larut dalam etanol.
Praktis tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol mutlak (1 : 2), dalam aseton (1 : 2), kloroform (1 : 2), eter (1 : 3,6), minyak kelapa murni (1 : 1)
Kadar Mengandung tidak kurang dari 96% dan tidak lebih dari 102,0% C31H52O3.
98,1%
Pemeriksaan minyak kelapa murni memperlihatkan data percobaan sesuai dengan data pustaka. Hal ini menunjukkan bahwa bahan tersebut adalah minyak kelapa murni. Hasil pemeriksaan karakteristik minyak kelapa murni dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Tabel 4.2 Pemeriksaan Bahan Baku Minyak Kelapa Murni (LIPI) Parameter Hasil Karakterisasi Data Pustaka
(SNI-01-2902-1992) Data Pustaka (APCC) Angka Yodium (g yod/100 g) 6,2 8-10 4,1-11 Angka Penyabunan (mg KOH/ g sampel) 255,65 255-265 250-260
Asam lemak bebas sebagai asam laurat (% asam lemak)
0,41 Maksimal 5 -
Kadar Air (%) 0,25 Maksimal 5 -
Asam Laurat (%) 46,94 - 43,0-53,0
Berat Jenis (g/cm3) 0,920 - 0,915-0,920
- : tidak diperoleh data pustaka
Formulasi mikroemulsi diawali dengan orientasi formula sediaan mikroemulsi untuk mendapatkan formula yang terbaik dari sisi stabilitas dan kenyamanan dalam penggunaan sebagai sediaan topikal. Formulasi mikroemulsi ini menggunakan emulgator polyoxyl 35
castrol oil atau biasa disebut sebagai Cremophor ELP. Polyoxyl 35 Castrol Oil
(Cremophor ELP) terdiri dari konstituen hidrofobik sekitar 83% dari total campuran. Komponen utama termasuk polietilenglikol ricinoleat. Konstituen hidrofobik lainnya antara lain asam lemak ester dari polietilenglikol dan minyak jarak. Bagian hidrofilik (17%) terdiri dari polietilenglikol dan gliserol etoksilat. Cremophor ELP memiliki nilai HLB sekitar 12-14. Kelebihan dari Cremophor ELP adalah sifat kelarutannya yang dapat larut baik di fasa minyak dan fasa air.
Pembuatan mikroemulsi diawali dengan melarutkan Cremophor ELP terlebih dahulu di fasa minyak supaya bagian hidrofobik dari Cremophor ELP dapat mengikat fase minyak dengan kuat. Proses Pelarutan Cremophor ELP dibantu dengan pemanasan di atas tangas air pada suhu 60oC. Pemanasan dilakukan untuk menurunkan viskositas dari fasa minyak dan tegangan antarmuka sehingga memudahkan pencampuran fasa minyak dan fasa air.
Formulasi Mikroemulsi diawali dengan orientasi jumlah emulgator Cremophor ELP dan kosurfaktan Etanol yang diperlukan untuk membentuk mikroemulsi minyak kelapa murni. Jumlah minyak kelapa murni yang digunakan ditetapkan sebesar 12% b/b.
Tabel 4.3 Orientasi Jumlah Emulgator Mikroemulsi Miyak Kelapa Murni 12% b/b
Komposisi (%b/b) FA FB FC FD FE FF FG FH FI
Minyak Kelapa Murni 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Cremophor ELP 48 48 48 42 36 36 36 30 24
Etanol 95% 16 16 16 14 12 12 12 10 8
Gliserin 0 15 20 20 0 15 20 20 20
Air ad. 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Hv/Ho 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Hasil Pengamatan Jernih, tidak berwarna Putih
susu Putih susu
Gambar 4.1 Diagram pseudoternary mikroemulsi minyak kelapa murni. ( ) : Daerah terbentuknya mikroemulsi minyak kelapa murni.
Pengamatan menunjukkan bahwa mikroemulsi minyak kelapa murni dengan konsentrasi 12% b/b dapat terbentuk dengan jumlah emulgator Cremophor ELP minimal sebesar 36%, dengan perbandingan jumlah Cremophor ELP dan etanol sebesar 3 : 1. Dalam Formulasi mikroemulsi ini digunakan gliserin sebagai emollient, selain itu gliserin juga berfungsi sebagai kosolven yang dapat meningkatkan kelarutan dalam air dan minyak dan dapat mengurangi tegangan antarmuka dengan menstabilkan lapisan yang terbentuk diantara dua fasa.
Formulasi mikroemulsi minyak kelapa murni tersebut dijadikan dasar untuk formulasi mikroemulsi dengan kombinasi fasa minyak dl-alfa tokoferol asetat dan minyak kelapa murni. Dl-alfa tokoferol asetat yang digunakan adalah 1% b/b. Mikroemulsi dengan
komposisi minyak kelapa murni 12% b/b dan dl-alfa tokoferol asetat 1% b/b ternyata tidak terjadi dengan komposisi jumlah emulgator dan kosurfaktan yang diperlukan untuk membentuk mikroemulsi minyak kelapa murni.
Tabel 4.4 Orientasi Jumlah Emulgator Mikroemulsi Kombinasi Minyak Kelapa dan dl-Alfa Tokoferol Asetat
Komposisi (%b/b) FG1 FG2 FG3 FG4
dl-Alfa Tokoferol Asetat 1 1 1 1
Minyak Kelapa Murni 12 12 12 6
Cremophor ELP 36 42 48 36
Etanol 12 14 16 12
Gliserin 20 15 10 20
Air ad. 100 100 100 100
Pengamatan Keruh Keruh Keruh Jernih
Gambar 4.2 Diagram pseudoternary kombinasi minyak kelapa murni
dan dl-alfa tokoferol asetat. ( ) = Daerah terbentuknya mikroemulsi.
Komposisi minyak kelapa murni 12% b/b dan dl-alfa tokoferol asetat 1% dengan berbagai variasi surfaktan dan kosurfaktan tidak membentuk mikroemulsi. Oleh karena itu, dilakukan penurunan jumlah minyak kelapa murni yang digunakan. Orientasi dengan dl-alfa tokoferol asetat 1% dan variasi minyak kelapa murni yang diturunkan hingga 11, 10, dan 8% telah dilakukan, namun mikroemulsi tidak terbentuk. Orientasi selanjutnya
dilakukan dengan komposisi minyak kelapa murni 6% dan dl-alfa tokoferol asetat 1%. Mikroemulsi komposisi minyak kelapa murni 6% dan dl-alfa tokoferol asetat 1% dapat terbentuk dengan jumlah emulgator sebesar 36% pada perbandingan Cremophor ELP dan etanol sebesar 3 : 1.
Orientasi jumlah emulgator untuk formulasi mikroemulsi dl-alfa tokoferol asetat 1% tanpa penambahan minyak kelapa murni dilakukan sebagai pembanding dalam uji aktivitas antioksidan. Formulasi mikroemulsi dl-alfa tokoferol asetat 1% b/b tanpa penambahan minyak kelapa murni dapat terbentuk dengan emulgator Cremophor ELP sebesar 20% b/b serta perbandingan Cremophor ELP dan etanol sebesar 2 : 1.
Tabel 4.5 Orientasi Formulasi Mikroemulsi dl-Alfa Tokoferol Asetat tanpa Penambahan Minyak Kelapa Murni
Komposisi (%b/b) FT1 FT2 FT3
dl-Alfa Tokoferol Asetat 1 1 1
Minyak Kelapa Murni 0 0 0
Cremophor ELP 10 15 20
Etanol 95 % 5 7,5 10
Gliserin 20 20 20
Air ad. 100 100 100
Hasil Pengamatan Keruh Keruh Jernih
Gambar 4.3 Diagram pseudoternary mikroemulsi dl-alfa tokoferol asetat. ( ) = Daerah terbentuknya mikroemulsi.
Hasil orientasi-orientasi diatas menjadi dasar untuk pengembangan formula mikroemulsi selanjutnya. Formula akhir dibuat tiga formula yang kemudian dievaluasi stabilitas dan uji aktivitas antioksidan. Pada formula ini juga ditambahkan metil paraben dan propil paraben sebagai pengawet.
Tabel 4.6 Formula Mikroemulsi Akhir
Komposisi (%b/b) FG4 FG4BL FT3
dl-Alfa Tokoferol Asetat 1 0 1
Minyak Kelapa Murni 6 6 0
Cremophor ELP 36 36 20 Etanol 95 % 12 12 10 Gliserin 20 20 20 Metil Paraben 0,18 0,18 0,18 Propil Paraben 0,02 0,02 0,02 Air ad. 100 100 100
Formula FG4 merupakan formula mikroemulsi dengan kombinasi dl-alfa tokoferol asetat dan minyak kelapa murni. Formula FG4BL merupakan kontrol FG4, yaitu mikroemulsi minyak kelapa murni, sedangkan FT3 merupakan mikroemulsi dl-alfa tokoferol asetat tanpa penambahan minyak kelapa murni. Ketiga formula tersebut selanjutnya dievaluasi.
Tabel. 4.7 Evaluasi pH Sediaan Selama Kurun Waktu 8 Minggu Waktu Pengamatan (Minggu) FG4 FG4BL FT3 1 5,27±0,17 5,54 5,04±0,32 2 5,69±0,13 5,59 5,10±0,18 3 5,71±0,02 5,59 5,07±0,07 4 5,48±0,07 5,21 5,06±0,07 5 5,58±0,12 5,44 5,17±0,19 6 5,39±0,04 5,26 5,04±0,13 7 5,42±0,09 5,36 5,24±0,11 8 5,58±0,07 5,34 5,05±0,04 n = 3
Nilai pH dapat terlihat pada tabel 4.7, ketiga sediaan memiliki pH sediaan sekitar 5 karena emulgator Cremophor ELP yang digunakan pada pembuatan akan memberikan pH sekitar 5 s.d. 7. Nilai pH yang sekitar 5 ini cocok untuk digunakan dalam sediaan topikal karena pH kulit berkisar 5,5.
Gambar 4. 4 Stabilitas pH sediaan dalam kurun waktu 8 minggu. ( ♦ ) = FT3, ( ▲ ) = FG4BL, ( ■ ) = FG4.
Gambar 4.4 menunjukkan bahwa pH sediaan tetap stabil selama 8 minggu. Berdasarkan perhitungan statistik dua arah degan aras keberartian 95% (p<95%), dapat diketahui bahwa pada sediaan yang dievaluasi pH nya tidak adaperbedaan berarti antara pH minggu ke ke-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 jika dibandingkan dengan minggu pertama. Hal tersebut menunjukkan bahwa sediaan stabil secara kimia, tidak terjadi reaksi atau interaksi kimia baik dengan wadah penyimpanan maupun antara bahan-bahan yang terkandung dalam sediaan.
Tabel. 4.8 Evaluasi Viskositas Sediaan Viskositas (cPs) Waktu Evaluasi (Minggu) FG 4 FG4BL FT3 1 4840±8,6 3130 20,33±1,9 2 5240±52,9 3400 20,5±1,0 3 6126,7±286,6 3420 33,7±3,8 4 4620±75,5 3470 32,3±4,6 5 6925±91,9 4040 29,3±1,5 6 5580±169,7 3570 22,5±2,5 7 5750±28,3 4940 29,0±1,0 8 5236,7±63,5 4920 27,5±0,5 n = 3
Viskositas dari FG4 dan FG4BL diukur dengan menggunakan viskometer Brookfield DV I+ pada kecepatan 5 rpm menggunakan spindel S21. Sedangkan FT3 yang viskositasnya sangat encer diukur pada kecepatan 100 rpm dengan menggunakan spindel S21. Formula FT3 memiliki viskositas yang rendah dan tidak dapat dioleskan pada kulit. FG4 memilliki viskositas yang lebih tinggi daripada FG4BL.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Waktu Evaluasi (Minggu)
Viskositas (
cPs
)
Gambar 4.5 Viskositas sediaan selama kurun waktu 8 minggu. ( ■ ) = FG4BL, ( ♦ ) = FG4.
Stabilitas fisik sediaan mikroemulsi dilakukan dengan metode freeze-thaw. Sediaan mikroemulsi FG4, FG4BL, dan FT3 tetap stabil selama delapan siklus freeze-thaw. Sediaan tidak mengalami perubahan warna dan tetap homogen. Selain itu sediaan tetap jernih dan tidak mengalami pemisahan fasa.
Tabel 4.9 Hasil Pengamatan Setelah Delapan Siklus Freeze-thaw Pengamatan Siklus ke-
Formula
1 2 3 4 5 6 7 8
FG4 - - -
FG4BL - - -
FT3 - - -
- : Sediaan tetap jernih dan tetap stabil.
Formula FG4 diukur diameter globulnya menggunakan alat Zetasizer Nano. Diameter globul mikroemulsi adalah 17,75 nm dengan sebaran data (polydispersity index) 0,032. Pengamatan menunjukkan bahwa sediaan tersebut adalah mikroemulsi karena memiliki ukuaran globul kurang dari 100 nm.
Gambar 4.6 Distribusi ukuran globul formula FG4.
Kemudian dilakukan penetapan kadar zat aktif dl-alfa tokoferol asetat dalam sediaan mikroemulsi. Sebelum dilakukan penentuan kadar, dilakukan pengukuran spektrum serapan ultraviolet dl-alfa tokoferol asetat untuk menentukkan panjang gelombang maksimumnya. dl- alfa tokoferol asetat dalam etanol proanalisis memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 286 nm. Hubungan konsentrasi dl-alfa tokoferol baku dalam etanol pro analisis terhadap absorbansinya memberikan kurva kalibrasi. Kurva kalibrasi dengan persamaan fungsi regresi Y = 0,0042x–0,0792 dan koefisien regresi (r2) = 0,9997. Kurva kalibrasi ini digunakan pada penentuan kuantitatif perolehan kembali kadar dl-alfa tokoferol asetat dalam sediaan.
Tabel 4.10 Perolehan Kembali Kadar dl-Alfa Tokoferol dalam Sediaan Formula Perolehan Kembali
(%) Koefisien Variansi (%)
FT3 99,37 ± 2,81 2,83
FG4 100,01 ± 1,33 1,33
n = 9
Penelitian dilanjutkan dengan uji aktivitas antioksidan dari sediaan mikroemulsi. Pertama-tama dilakukan optimasi waktu reaksi dl-alfa tokoferol asetat dengan DPPH. Pengamatan menunjukkan waktu reaksi berkisar 30 menit. Selanjutnya uji aktivitas antioksidan dilakukan setelah sampel uji direaksikan dengan DPPH dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.
Tabel 4.11 Optimasi Waktu Reaksi dl-Alfa Tokoferol Asetat 1% b/v dengan Larutan DPPH 50 µg/ml Waktu (Menit) A (519 nm) 5 0,5359 10 0,5339 15 0,5321 20 0,5277 25 0,5266 30 0,5243 35 0,5274
Gambar 4.7 Hubungan waktu reaksi dan absorbansi pada λ = 519 nm.
Pemeriksaan aktivitas antioksidan dilakukan dengan mereaksiakan sediaan yang diencerkan dengan etanol, hingga konsentrasi alfa tokoferol asetat dalam etanol sebesar 1000 bpj dengan larutan DPPH 25 µg/ml. Aktivitas diukur dengan menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan pengurangan konsentrasi larutan DPPH.
Tabel 4.12 Uji Aktivitas Antioksidan Absorbansi ( 519 nm) Sampel Uji C dl-Alfa
Tokoferol Asetat (bpj) A1 A2 A3 Rata-rata Peredaman DPPH ± SD (%) LEBL (Kontrol) 0 0,2750 0,2715 0,2715 0 LE 1000 0,2478 0,2440 0,2474 9,64 ± 0,77 LGBL (Kontrol) 0 0,2788 0,2765 0,2781 0 FG4 1000 0,2393 0,2410 0,2388 13,71 ± 0,42 FG4BL 0 0,2560 0,2635 0,2574 6,78 ± 1,44 LTBL (Kontrol) 0 0,2739 0,2719 0,2728 0 FT3 1000 0,2597 0,2576 0,2583 5,23 ± 0,39
LE
FG
4FG
4BLFT
3Gambar 4.8 Peredaman DPPH pada berbagai sampel uji. Keterangan :
LE : Larutan dl-alfa tokoferol asetat dalam etanol FG4 : Mikroemulsi kombinasi dl-alfa tokoferol asetat dengan basis minyak kelapa murni
FG4BL : Mikroemulsi minyak kelapa murni FT3 : Mikroemulsi dl-alfa tokoferol asetat.
Pemeriksaan aktivitas antioksidan dilakukan dengan mereaksiakan sediaan yang diencerkan dengan etanol, hingga konsentrasi alfa tokoferol asetat dalam etanol sebesar 1000 bpj dengan larutan DPPH 25 µg/ml. Aktivitas diukur dengan menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan pengurangan konsentrasi larutan DPPH.
Pengamatan menunjukkan bahwa sediaan mikroemulsi dengan kombinasi dl-alfa tokoferol asetat dan minyak kelapa murni meredam radikal bebas DPPH lebih besar jika dibandingkan dengan alfa tokoferol asetat bukan dalam sediaan dan mikroemulsi alfa tokoferol asetat saja. Formula FG4 dengan konsentrasi dl-alfa tokoferol asetat 1000 ppm dapat meredam DPPH sebesar 13,71±0,42 %. Sedangkan dl-alfa tokoferol asetat bukan dalam sediaan (LE) meredam DPPH sebesar 9,64±0,77 % sedangkan FT3 meredam DPPH sebesar 5,23±0,39 %. FG4BL memiliki persen peredaman DPPH sebesar 6,78±1,44 %. Hal ini menunjukkan bahwa minyak kelapa murni memiliki aktivitas antioksidan
