i
ABSTRAK
STUDI EFEK ASETONITRIL PADA STABILITAS DAN
MOBILITAS LID LIPASE ISOLAT MANUK DENGAN
PENDEKATAN SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL
Oleh
DIAN HERASARI
NIM : 30512011
Program Studi Doktor Kimia
Lipase adalah salah satu enzim yang tergolong dalam kelas enzim hidrolase yang berperan dalam menghidrolisis lemak. Lipase banyak diaplikasikan dalam berbagai bidang industri, diantaranya pada industri makanan, industri detergen, industri pengolahan limbah, industri tekstil, industri obat-obatan dan juga pada industri pulp atau kertas. Dengan aplikasinya yang sangat luas dan beragam, maka produksi lipase tidak hanya harus diperoleh dalam jumlah banyak, tetapi juga harus memiliki efisiensi katalitik dan stabilitas yang tinggi.
Dari bebagai studi diketahui bahwa komponen pelarut dapat mempengaruhi aktivitas lipase. Salah satu komponen yang mempengaruhi aktivitas lipase secara signifikan adalah kehadiran pelarut organik sebagai ko-pelarut air. Beberapa lipase mengalami kenaikan aktivitas setelah ditambahkan pelarut organik dengan polaritas dan komposisi tertentu. Salah satu pelarut organik yang secara signifikan dapat menaikan aktivitas lipase adalah asetonitril. Pada penelitian ini, akan dipelajari efek penambahan asetonitril pada stabilitas dan aktivitas dari lipase pada level atom dengan pendekatan simulasi dinamika molekul (MD). Lipase yang digunakan pada studi ini adalah lipMNK yang berasal dari bakteri termofilik Geobacillus uzenencis yang diisolasi dari Kawah Manuk, Jawa Barat. Enzim ini telah ditentukan urutan asam aminonya dan diketahui memiliki 416 asam amino yang terdiri dari 28 asam amino signal peptide dan 388 asam amino dari gen struktur lipase. Hasil ekspresi pada studi sebelumnya diketahui bahwa lipMNK mempunyai aktivitas optimum pada pH 7 dan temperatur 85oC, dengan aktivita sebesar 1,23 U/mg. MD untuk mempelajari efek asetonitril pada stabilitas lipMNK dilakukan dengan mengamati perubahan konformasi enzim ini pada berbagai konsentrasi asetonitril. Sedangkan MD untuk mempelajari efek asetonitril pada aktivitas lipMNK dilakukan dengan mengamati mobilitas lid lipMNK pada berbagai konsentrasi asetonitril.
Tahapan awal MD adalah penyiapan strutkur awal dari lipMNK. Tahap ini dilakukan melalui prediksi struktur dengan metode comparative modeling menggunakan struktur cetakan lipase dengan tingkat identitas paling tinggi. Untuk keperluan studi mobilitas lid diperlukan dua struktur awal, yaitu lipMNK
ii
konformasi lid tertutup (c-lipMNK) dan konformasi lid terbuka (o-lipMNK). Untuk prediksi struktur c-lipMNK dan o-lipMNK masing-masing menggunakan lipase L1 (1KU0) dan BTL2 (2W22) sebagai cetakan. Hasil prediksi memperlihatkan lid pada model c-lipMNK dan o-lipMNK masing-masing tersusun atas dua -heliks yang terdiri dari: (1) residu 175 sampai 195 – disebut lid A dan (2) residu 221 sampai 230 – disebut lid B.
Analisis RMSD dan visualisasi struktur lipMNK hasil MD selama 100 ns pada berbagai konsentrasi asetonitril menunjukkan bahwa enzim ini memiliki rentang toleransi yang cukup lebar. Struktur enzim nampak stabil pada rentang konsentrasi asetonitril hingga 70%, dimana nilai RMSD pada keadaan ini sekitar 3 – 6 Å. Kerusakan konformasi baru teramati pada konsentrasi di atas batas ini, dengn RMSD > 4 Å.
Untuk mengamati efek asetonitril pada mobilitas lid, diamati perubahan konformasi lid pada berbagai konsentrasi asetonitril. Visualisasi hasil MD dan pengukuran jarak pergerakan lid menunjukkan bahwa pada konsentrasi asetonitril 0% tidak terlihat gerakan lid membuka dari keadaan awal yang tertutup. Gerakan lid kearah membuka teramati pada konsentrasi asetonitril 20%, 40%, 80%, 90%, dan 100%. Pada konsentrasi asetonitril 60% dan 70% tidak teramati gerakan lid kearah membuka karena asetonitril tidak terdistribusi dengan baik disekitar lid namun air yang terkumpul pada sekitar lid tersebut. Pada konsentrasi asetonitril 80% dan 90% teramati gerakan lid kearah membuka, namun terlihat adanya bagian lain di luar lid (segmen ARC) yang mengalami unfolding. Keadaan unfolding ini ditunjukkan dengan nilai RMSD yang cukup tinggi (5 Å). Gerakan lid kearah membuka teramati pada konsentrasi asetonitril 20%. Pada keadaan ini jarak pergerakan lid mencapai 13 Å dan 3,81 Å masing-masing untuk lid A dan lid B, dengan RMSD masing-masing 2,095 dan 0,894. Hasil pengamatan dan pengukuran sudut interlid juga memperlihatkan bahwa pada awal mekanisme pembukaan lid c-lipMNK, kedua segmen lid baik lid A maupun lid B tidak bergerak secara paralel. Hal ini menyarankan kedua segmen lid bergerak secara independen satu sama lain untuk mengarah pada pembukaan lid.
Selain mengamati gerakan pembukaan lid dari keadaan tertutup, pada penelitian ini juga dilakukan MD untuk mengamati gerakan penutupan lid dari keadaan awal yang terbuka. Hasil pengamatan menunjukkan pada konsentrasi asetonitril 100% tidak terlihat pergerakan lid kearah menutup. Gerakan lid kearah menutup mulai terlihat setelah konsentrasi asetonitril 80% (air 20%). Gerakan lid kearah menutup teramati lebih cepat, yaitu pada MD konsentrasi asetonitril 40%, 20%, dan 0%. Gerakan lid kearah menutup yang paling signifikan, yang dilihat berdasarkan jarak pergerakan lid yang paling jauh, teramati pada konsentrasi asetonitril 20% dan 0%. Hasil pengamatan juga memperlihatkan bahwa segmen lid B menginisisasi gerakan penutupan lid o-lipMNK. Dari pengamatan ini, nampak bahwa konsentrasi asetonitril 20% memiliki efek inhibisi paling minimal pada gerakan penutupan lid lipMNK.
Berdasarkan analisis terhadap interaksi ionik yang terdapat pada perubahan konformasi lid lipMNK diketahui adanya beberapa interaksi penting yang harus
iii
dijaga pada daerah lid, yaitu jembatan garam Asp178 – Lys229 pada bagian interlid, dan dua jembatan garam Asp182 – Arg179, Glu189 – Lys185 pada intralid A, serta satu jembatan garam Glu226 – Lys229 pada intra-lid B. Interaksi intralid B tetap dipertahankan pada perubahan konformasi c-lipMNK menjadi o-lipMNK. Interaksi interlid dan intralid A hanya terdapat pada konformasi c-lip-MNK dan hilang pada o-lipc-lip-MNK. Mutasi pada Lys229Gln, Arg179Gln dan Lys185Gln, baik single mutation maupun triple mutation dapat mempercepat gerakan pembukaan lid, yang terlihat dari perbedaan jarak pergerakan lid dibandingkan dengan wild type. Hasil visualisasi struktur hasil MD mutan dan perubahan jarak beberapa residu referensi menyarankan bahwa mutasi pada tiga residu tersebut menyebabkan unfolding pada segmen lain dari c-lipMNK. Hal ini menyarankan bahwa jembatan garam yang melibatkan ketiga residu mempunyai peran penting dalam menjaga kestabilan struktur lipMNK. Hasil ini menujukkan bahwa intergritas lid tidak hanya penting untuk stabilitas lid tersebut tetapi juga penting untuk stabilitas keseluruhan struktur c-lip-MNK.
Dari hasil studi MD di atas, dapat disimpulkan bahwa konsentrasi asetonitril 20% merupakan konsentrasi terbaik dari sisi stabilitas maupun aktivitas lipMNK. Jembatan garam pada bagian lid merupakan interaksi yang krusial untuk stabilitas dan mobilitas lid lipMNK.
Kata kunci: lid, lipase, simulasi dinamika molekul
iv
ABSTRACT
STUDY OF ACETONITRILE EFFECT IN STABILITY
AND MOBILITY OF lipMNK LID BY
MOLECULAR DYNAMIC APPROACH
By
DIAN HERASARI
NIM: 30512011
Doctoral Program in Chemistry
Lipase is one of the enzymes belonging to the class of hydrolase that play a role in the hydrolyzing of lipid. Lipase is widely applied in various industrial fields, including in the food industry, detergent industry, waste processing industry, textile industry, the pharmaceutical industry and also in the pulp or paper industry. With its very wide and diverse applications, the production of lipase must not only be obtained in large quantities but also must have high catalytic efficiency and stability.
From several studies, it is known that the solvent component can affect lipase activity. One of the components that significantly affect lipase activity is the presence of organic solvents as water-soluble co-solvents. Some lipases increase in activity after organic solvents are added with certain polarities and compositions. One of the organic solvents that can significantly increase lipase activity is acetonitrile. In this study, we will study the effect of acetonitrile addition on the stability and activity of lipase at the atomic level by molecular dynamics (MD) simulation approach. Lipase used in this study was lipMNK derived from thermophilic bacteria Geobacillus uzenencis isolated from Crater Manuk, West Java. This enzyme has determined its amino acid sequence and is known to have 416 amino acids comprising 28 amino acids signals peptide and 388 amino acids from the lipase structure gene. Lip-MNK has optimum activity at pH 7 and temperature 85oC, with 1,23 U/mg activity. To study the effect of acetonitrile on lipMNK stability was performed by observing the change of conformation of this enzyme at various concentrations of acetonitrile. To study the effect of acetonitrile on lipMNK activity was done by observing the mobility of lid lipMNK on various concentrations of acetonitrile.
The first step of MD is preparation of the initial structure of lipMNK. This stage is done through structural prediction using comparative modeling method using lipase mold structure with the highest level of identity. For lid mobility studies, two initial structures were required, ie closed lid conformation (c-lipMNK) and open lid conformation (o-lipMNK). To predict the structure of c-lipMNK and
v
o-lipMNK each using lipase L1 (1KU0) and BTL2 (2W22) as a mold. The predicted results show the lid on the c-lipMNK and o-lipMNK models each composed of two -helices consisting of: (1) residues 175 to 195 - called lid A and (2) residues 221 to 230 - are called lid B.
RMSD analysis and visualization of lipMNK structure of MD results over 100 ns at various acetonitrile howed that this enzyme had a wide tolerance range. The enzyme structure appears stable in the range of acetonitrile concentration up to 70%, where the RMSD value in this state is about 3 - 6 Å. A conformational damage is observed at concentrations above this limit, with RMSD > 4 Å.
To observe the effect of acetonitrile on lid mobility, lid movement were observed from closed to open state and vice versa on various concentrations of acetonitrile. Visualization of MD structure product and lid displacement measurements showed that no lid opening movement at 0% acetonitrile concentration. The lid closing movement is observed at acetonitrile concentrations of 20%, 40%, 80%, 90%, and 100%. At 60% and 70% concentrations of acetonitrile are not observed lid closing movement because acetonitrile is not well distributed. At 80% and 90% concentration of acetonitrile observed lid closing movement, but seen other parts outside the lid (segment ARC) that experienced unfolding. This unfolding state is indicated by a fairly high RMSD value (5 Å). The lid closing movement is observed at 20% acetonitrile concentration. In these circumstances the lid displacement were 13 Å and 3.81 Å respectively for lid A and lid B, with RMSD of 2,095 and 0.894, respectively. Interlid angle observation also show that at the beginning of the opening mechanism of lid c-lipMNK, both lid segments neither lid A nor lid B move in parallel. This suggests both segments of the lid move independently of each other to lead to the opening of the lid.
To observe changes in the effect of acetonitrile on lid mobility, observed lid movement from closed to open state and vice versa on various concentrations of acetonitrile. The MD results show that at 0% acetonitrile concentration no visible lid moves open from the initial closed state. The movement of the lid towards opening is observed at acetonitrile concentrations of 20%, 40%, 80%, 90%, and 100%. At 60% and 70% concentrations of acetonitrile are not observed the lid moves towards opening because acetonitrile is not well distributed around the lid but the water collected around the lid. At 80% and 90% concentration of acetonitrile observed lid opening movement, but seeing other parts outside the unfolding lid. The most significant opening lid movement, seen by the distance of the most distant lid movements, is observed at 20% acetonitrile concentration. The results also show that at the beginning of the opening mechanism of lid c-lipMNK, both lid segments both lid A and lid B move together. This suggests both lid segments move dependently on each other to lead to the opening of the lid. In addition to observing the lid opening movement from a closed state, in this study also conducted MD to observe the lid closure movement of the initial open
vi
state. The observation results showed 100% concentration of acetonitrile not seen lid movement towards closing. The movement of the lid towards closing begins to appear after the concentration of acetonitrile 80% (water 20%). The movement of the lid towards closing is observed more rapidly, ie at concentrations of 40%, 20%, and 0% acetonitrile MD. The lid movements towards closing the most significant, seen by the distance of the most distant lid movements, are observed at acetonitrile concentrations of 20% and 0%. The observation results also show that the lid B segment initiates the closing motion of lid o-lipMNK. From this observation, it appears that the concentration of 20% acetonitrile has the least inhibitory effect on the lipid closure lipid movement.
Further analysis of MD results for mobility of lid lipMNK was found to be important interactions that should be maintained in the lid area, Asp178 - Lys229 salt bridge on the interlid, and two Asp182 - Arg179 salt bridges, Glu189 - Lys185 on intralid A, and one bridge salt Glu226 - Lys229 in intra-lid B. Intralid interaction B is maintained at conformation changes c-lipMNK to o-lipMNK. The interlid and intralid interactions A are present only in c-lip-MNK conformations and are lost in o-lipMNK. Mutations in Lys229Gln, Arg179Gln and Lys185Gln, both single mutation and triple mutation can accelerate the lid opening movement, but cause unfolding in other segments of c-lipMNK. This suggests that a salt bridge involving all three residues has an important role in maintaining the stability of the lipMNK structure. These results indicate that lid integrity is not only important for the stability of the lid but is also important for the overall stability of the c-lip-MNK structure.
From the results of the MD study above, it can be concluded that the concentration of 20% acetonitrile is the best concentration in terms of stability and lipMNK activity. The salt bridge in the lid section is a crucial interaction for the stability and mobility of lipid lipids.
