26 BAB IV
METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian ekperimental dalam mengidentifikasi tingkat iritasi pada sediaan lotion ekstrak daun jambu biji putih (Psidium guajava) dengan variasi konsentrasi 0%, 0,1%, 0,2%, dan 0,3%.
4.2 Variabel Penelitian 4.2.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini yaitu variasi konsentrasi ekstrak daun jambu biji putih yaitu 0,1%, 0,2%, dan 0,3%.
4.2.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah hasil uji iritasi dengan menggunakan metode Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM).
4.3 Tempat dan Waktu Penelitian 4.3.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Sediaan Farmasi Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Waktu Penelitian
Penelitian akan dilaksanakan pada bulan Oktober 2020 sampai Desember 2020
4.4 Alat dan Bahan Penelitian 4.4.1 Bahan
• Bahan pembuatan lotion :
Bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu ekstrak daun jambu biji putih (Psidium guajava L.), Propilenglikol, Tween 80, Paraffin cair, Asam stearate, Setil alcohol, Natrium benzoate, BHT (Butylated hydroxytoluene), Aquadest.
• Bahan pengujian iritasi HET-CAM :
Bahan yang digunakan dalam pengujian iritasi yaitu telur ayam leghorn, larutan asam laktat, larutan SLS, larutan NaCl 0,9%.
4.4.2 Alat
• Alat pembuatan lotion :
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu neraca analitik digital, pH meter, waterbath, mortir dan stamper, gelas beker, gelas ukur, batang pengaduk, pinset, pipet tetes, sendok penyu, inkubator, dan spuit.
• Alat pengujian iritasi HET-CAM :
Inkubator, neraca analitik digital, gunting steril, hotplate, selotip, spuit dan pinset steril.
4.5 Metode Kerja
Penelitian ini akan dilakukan dengan membuat sediaan lotion tanpa bahan aktif (Formula 0) sebagai kontrol negatif dan sediaan yang mengandung bahan aktif ekstrak daun jambu biji putih sebanyak 3 formula dengan masing-masing konsentrasi 0,1% (Formulas 1), 0,2% (Formula 2), dan 0,3% (Formula 3). Keseluruhan formula tersebut kemudian akan di uji dengan menggunakan uji iritasi metode HET-CAM.
Gambar 4.1 Metode kerja penelitian
4.6 Rancangan Formula
Penelitian ini akan digunakan 4 formula yaitu 1 formula yang tidak mengandung bahan aktif (placebo) dan 3 formula mengandung bahan aktif ekstrak daun jambu biji dengan kadar masing-masing 0,1% (Formula 1), 0,2% (Formula 2), dan 0,3% (Formula 3).
Pembuatan sediaan lotion tanpa bahan aktif (placebo) dan dengan bahan aktif ekstrak daun jambu biji putih dengan kadar 0,1%, 0,2%, dan 0,3%.
Pembuatan sediaan lotion tanpa bahan aktif (placebo) dan dengan bahan aktif ekstrak daun jambu biji putih dengan kadar 0,1%, 0,2%, dan 0,3%.
Formula 0 placebo
Formula 0 placebo
Formula 1 mengandung ekstrak daun
jambu biji putih dengan
kadar 0,1%
Formula 1 mengandung ekstrak daun jambu biji putih dengan
kadar 0,1%
Formula 2 mengandung ekstrak daun jambu biji putih dengan
kadar 0,2%
Formula 2 mengandung ekstrak daun jambu biji putih dengan
kadar 0,2%
Formula 3 mengandung ekstrak daun jambu biji putih dengan
kadar 0,3%
Formula 3 mengandung ekstrak daun jambu biji putih dengan
kadar 0,3%
Dilakukan uji iritasi HET-CAM
Dilakukan uji iritasi Analisa Data
Analisis Data
Tabel IV.1 Rancangan Formula Lotion
Nama Bahan Fungsi
Konsentrasi (%) Formula 0
(placebo)
Formula 1
Formula 2
Formula 3 Ekstrak daun
jambu biji putih
Bahan aktif 0% 0,1% 0,2% 0,3%
Propilenglikol Humektan 2,5% 2,5% 2,5% 2,5%
Paraffin cair Basis 1,5% 1,5% 1,5% 1,5%
Tween 80 Emulgator 1,5% 1,5% 1,5% 1,5%
Asam stearat Stabilizer 1,3% 1,3% 1,3% 1,3%
Setil Alkohol Thickening
agent 1,3% 1,3% 1,3% 1,3%
BHT Antioksidan 0,05% 0,05% 0,05% 0,05%
Natrium
benzoat Pengawet 0,05% 0,05% 0,05% 0,05%
Aquadest Solven ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
4.7 Pembuatan Lotion
Pembuatan sediaan lotion ekstrak daun jambu biji putih ini yang pertama membuat fase air terlebih dahulu dengan melarutkan Natrium benzoate ke dalam aquadest panas sebanyak 10ml sampai larut, kemudian mencampurkan larutan tersebut dengan Propilenglikol dan Tween 80 sampai homogen diatas penangas air (waterbath) dengan memantau suhu sampai suhu 70⁰C. Langkah kedua, membuat fase minyak dengan melelehkan asam stearate, setil alcohol dan paraffin cair diatas penangas air pada suhu 70⁰C hingga meleleh tercampur homogen. Kemudian langkah ketiga, mencampurkan fase minyak ke fase air secara perlahan dalam gelas beker di atas penangas air pada suhu 70⁰C sambil terus dilakukan pengadukan sampai terbentuk massa yang homogen. Jika telah terbentuk massa homogen dapat digerus dalam mortir panas atau pengaduk elektrik hingga mencapai suhu kamar. Kemudian menambahan BHT ke dalam campuran yang telah dingin dan dilanjutkan
dengan menambahkan ekstrak daun jambu biji putih sesuai dengan konsentrasi masing-masing formula dan tetap dalam pengadukan secara konstan hingga homogen. Sebelum ditambahkan vanilli oil dapat melakukan pengecekan nilai pH terlebih dahulu, kemudian ditambahkan vanilli oil secukupnya dengan tetap melakukan pengadukan sampai homogen. Sediaan setelahnya dapat dimasukkan ke dalam botol atau wadah dengan netto 100 gram, tutup botol dan beri label.
Gambar 4. 2 Skema Pembuatan Lotion Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
Penentuan fase air (Tween 80, Propilenglikol, Natrium benzoate, Aquadest) dan fase minyak (Setil alkohol, Asam stearat, Paraffin cair)
Pembuatan Fase Air yaitu natrium benzoate dilarutkan dalam aquadest panas sebanyak 10ml hingga larut, kemudian dicampurkan dengan Propilenglikol
dan Tween 80 hingga homogen diatas penanagas air sampai suhu 70⁰C
Pembuatan Fase Minyak yaitu asam stearat, setil alkohol dan paraffin cair dilelehkan diatas penangas air pada suhu 70⁰C hingga meleleh sempurna,
diaduk hingga homogen
Dicampurkan fase minyak ke dalam fase airsecara perlahan pada suhu 70⁰C sambil diaduk sampai homogen dan dinginkan dengan pengadukan konstan
Ditambahkan BHT ke dalam campuran yang telah dingin dilanjutkan dengan ekstrak daun jambu biji putih sesuai konsentrasi, diaduk hingga homogen
Sediaan lotion kemudian ditambahkan vanilli oil sambil di aduk kembali hingga homogen
Sediaan yang telah homogen dimasukkan ke dalam wadah botol dengan netto 100 gram, botol ditutup dan diberi label
4.8 Evaluasi Sediaan
Evaluasi sediaan yang dilakukan pada sediaan lotion adalah uji iritasi secara in vitro menggunakan metode Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) untuk mengetahui apakah sediaan lotion memiliki pengaruh iritasi dengan adanya variasi kandungan bahan aktif ekstrak daun jambu biji putih (Psidium guajava).
4.8.1 Uji Iritasi Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane
Tahapan pengujian dengan metode ini dibagi beberapa fase, yaitu : 1. Fase (I) Persiapan telur :
Telur ayam betina yang telah dibuahi, dilihat untuk mengetahui kerusakannya, kemudian dibersihkan dengan alkohol 70% dan ditempatkan dalam inkubator dengan kelembaban yang terkontrol (37⁰C ± 1⁰C). Pada hari keempat, telur dilihat dibawah cahaya untuk mengetahui keberadaan dan posisi embrio, kemudian dibuka dan setiap membran dibasahi dengan 2-3 mL NaCl 0,9%. Kemudian albumin sebanyak 3,0 mL dikeluarkan dari telur. Bagian cangkang yang terbuka ditutup dengan selotip bening dan telur dikembalikan ke inkubator. Telur diamati setiap hari. Pada hari ke-10, cincin teflon ditempatkan di CAM setiap telur yang berfungsi sebagai reservoir (tempat penyimpanan) untuk mengencerkan sampel uji.
2. Fase (II) Persiapan sampel uji dan kontrol positif :
Sampel dilarutkan dalam air atau minyak nabati atau pelarutnya yang sesuai. Sodium lautil sulfat (SLS) digunakan sebagai kontrol positif, diencerkan dengan air hingga konsentrasi 0,01 M. Sepuluh telur kemudian disimpan tertutup dan diamati setiap hari untuk meninjau daya pertumbuhannya, berfungsi sebagai kelompok kontrol dalam memantau kondisi lingkungan.
3. Fase (III) Pelaksanaan pengujian :
Pada hari ke-10 telur dikeluarkan dari inkubator dan diencerkan 40µL sampel uji diencerkan. Larutan SLS atau pelarutnya ditambahkan ke cincin dalam setiap telur dalam kelompok kontrol 8 hingga 10 telur. Kemudian telur dikembalikan kembali di inkubator
selama 30 menit plus-minus 5 menit. Area di dalam cincin tersebut dievaluasi untuk mengetahui kerusakan vaskular dengan senter dan bagian luar cincin sebagai pembandingnya. Kerusakan yang dihasilkan dapat berupa lisis, perdarahan dan atau pembekuan.
Setelah itu, telur dievaluasi mengenai keparahan reaksi pada menit ke-1 dan menit ke-5. Semua efek yang diamati pada setiap telur untuk setiap kelompok dicatat hasilnya. Jika terdapat efek vaskular pada saat diamati, maka dinyatakan positif. Pernyataan respons positif ataupun negatif pada pengamatan tersebut, ditinjau dari nilai RC50 (persentase produk uji yang dihasilkan sebanyak 50% telur menghasilkan respon positif) akan ditentukan.
4. Fase (IV) Penilaian fase telur :
Telur yang telah selesai diamati kemudian dikeluarkan dari inkubator dan selotipnya dilepas. Untuk memudahkan dalam melihat bagian CAM, telur dapat dikupas bagian cangkangnya. Efek vaskular yang dihasilkan kemudian diklasifikasikan menurut kriteria-kriteria yang telah ditentukan dalam Tabel IV.1.
5. Fase (V) Perhitungan penilaian tingkat iritasi :
Seluruh hasil pegujian kemudian dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut :
Dimana :
Hemorrhage Time = Waktu pertama terjadinya perdarahan (detik) Lysis Time = Waktu pertama terjadinya lisis pada pembuluh (detik) Coagulation Time = Waktu pertama terjadinya pembekuan pada protein (detik)
Hasil perhitungan kemudian dibdaningkan dengan kriteria uji iritasi HET-CAM (Tabel IV.3).
((301 − 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑟𝑟ℎ𝑎𝑔𝑒 𝑇𝑖𝑚𝑒
⁄300) 𝑥 5) + ((301 − 𝐿𝑦𝑠𝑖𝑠 𝑇𝑖𝑚𝑒
⁄300) 𝑥 7) + ((301 − 𝐶𝑜𝑎𝑔𝑢𝑙𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑇𝑖𝑚𝑒
⁄300) 𝑥 9)
Gambar 3. 1 Kerangka konseptual uji iritasi metode HET- CAM((301 − 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑟𝑟ℎ𝑎𝑔𝑒 𝑇𝑖𝑚𝑒
⁄300) 𝑥 5) + ((301 − 𝐿𝑦𝑠𝑖𝑠 𝑇𝑖𝑚𝑒
⁄300) 𝑥 7) + ((301 − 𝐶𝑜𝑎𝑔𝑢𝑙𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑇𝑖𝑚𝑒
⁄300) 𝑥 9)
Tabel IV.2 Nilai Efek Vaskular
Efek Vaskular Nilai Keterangan
0 0 Tidak ada reaksi, CAM normal
Pembuluh darah
bening 1 Tidak terdapat aliran darah pada pembuluh, tampak bening Injeksi pembuluh
darah kecil 2
Hyperemia atau meningkatnya aliran darah dalam pembuluh darah kecil dari CAM
Perdarahan minimal 3
Potensi terjadinya perdarahan yang menutupi seluruh area cincin tidak lebih dari 25%
Perdarahan ringan 4 Tetes darah yang menutupi area dari cincin sekitar 25 - 50%
Perdarahan sedang 5 Tetes darah yang menutup area dari cincin sekitar 50 - 75%
Perdarahan parah 6
>75% area yang terdapat di dalam cincin tertutupi oleh darah, area yang berwarna hitam kemungkinan akan terbentuk cangkang yang keras
(Sumber : (Cazedey et al. 2009) )
Tabel IV.3 Hubungan Nilai dengan Kategori Iritasi HET-CAM Nilai pada HET-CAM Kategori Iritasi
0 – 0,9 Tidak ada reaksi iritasi
1 – 4,9 Iritasi ringan
5 – 8,9 atau 5 – 9,9 Iritasi sedang 9 – 21 atau 10 – 21 Iritasi parah (Sumber : (Cazedey et al. 2009) )
4.9 Analisa Data
Pada pemeriksaan uji iritasi dengan menggunakan metode HET-CAM dapat dilihat menggunakan parameter koagulasi, lisis dan hemoragi secara visual setelah dilakukan pengamatan selama 300 detik. Pada hasil nilai uji iritasi pada masing-masing parameter dilakukan analisis statistik dengan menggunakan uji One-way Anova. Perolehan data yang didapatkan dilakukan analisa statistik dengan derajat kepercayaan α = 0,05. Untuk mengetahui formula manakah yang terdapat perbedaan bermakna dilihat dari signifikan derajat kepercayaan. Apabila hasil yang diperoleh signifikan <0,5 menunjukkan adanya perbedaan bermakna maka dilanjutkan uji Tukey's HSD (Honestly Significant Difference) untuk mengetahui data mana yang berbeda.
