MAKALAH BIOMOLEKULER DAN SEL STUDI PUSTAKA
PENGGUNAAN METODE PCR SEBAGAI ALTERNATIF DAN/ATAU PENUNJANG METODE KONVENSIONAL UNTUK DIAGNOSIS TB
PADA PASIEN TB HIV DAN PASIEN TB ANAK
RONALD PRATAMA A. (011514253002)
Pembimbing
Prof. RETNO HANDAJANI, dr., MS, PhD Prof. Dr. HARIANTO NOTOPURO, dr., MS
Prof. SOETJIPTO, dr., MS, PhD
S2 ILMU KEDOKTERAN TROPIS FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
DAFTAR ISI
Halaman Judul………..1
Daftar Isi………...2
Pendahuluan……….3
Tinjauan Pustaka………..5
Pembahasan dan Kesimpulan………...38
BAB I
PENDAHULUAN 1. 1 LATAR BELAKANG
WHO(World Health Organization) telah menetapkan strategi DOTS di tahun 1993 yang bertujuan menanggulangi penularan global tuberculosis(TB). Strategi ini menekankan desentralisasi diagnosis dan terapi dengan tujuan untuk meningkatkan akses masyarakat akan layanan kesehatan, sembari mempertahankan kualitas pelayanan kesehatan melalui supervisi, kontrol kualitas dan monitoring.
Sasaran WHO adalah deteksi 70% pasien-pasien TB aktif, dengan keberhasilan terapi setidaknya 85% dari kasus yang terdeteksi. Negara-negara yang mencapai implementasi strategi DOTS pada level tinggi berhasil meningkatkan laju keberhasilan terapi dengan rentang 60%-82%, namun deteksi kasus masih stabil pada kisaran 43%.
Peningkatan keberhasilan deteksi kasus TB paru menjadi sasaran tambahan pada periode 2006-2009. Mayoritas studi yang mengevaluasi teknik-teknik biologi molekuler untuk diagnosis TB sudah dilakukan pula di negara-negara maju, namun hanya beberapa dari studi-studi tersebut yang mengevaluasi kemanfaatan klinis dari teknik-teknik biomolekuler untuk prosedur rutin.
Negara-negara berkembang sendiri belum terlalu memprioritaskan analisis teknik biologi molekuler untuk ranah diagnostik, sebagian besar disebabkan karena masalah biaya, kesukaran-kesukaran teknis dan operasional bahkan di laboratorium rujukan sekalipun. Kurangnya informasi mengenai relevansi klinis dan efesiensi biaya menjadi hambatan utama.
Evaluasi penggunaan metode-metode molekuler baru untuk diagnosis TB oleh negara-negara berkembang didasarkan pada kriteria diagnostik laboratoris dan informasi klinis untuk mengevaluasi hasil-hasil yang bertentangan, terlebih lagi beberapa laboratorium tidak secara konsisten mengaplikasikan biosafety controls. Data mengenai rasio cost-effectiveness dari metode-metode ini untuk prosedur rutin hanya baru-baru ini dideskripsikan oleh suatu studi di Afrika. Hasil studi ini menyatakan bahwa penggunaan PCR lebih cost-effective dibandingkan metode-metode tradisional.
menggunakan berbagai jenis spesimen baik berupa sputum penderita, darah, maupun jenis spesimen lainnya. Pemeriksaan PCR dapat menjadi kandidat untuk prosedur diagnostik TB yang akurasinya diteliti dan dibandingkan dengan prosedur diagnostik rutin TB.
1.2 POKOK BAHASAN
Aplikasi metode PCR untuk diagnosis TB dalam populasi pasien TB khusus (pasien TB dengan HIV dan pasien anak).
1.3 RUANG LINGKUP KAJIAN
1. Apakah TB itu?
2. Apa sajakah karakteristik epidemiologi TB?
3. Apa saja kriteria diagnosis TB?
4. Bagaimanakah diagnosis TB pada pasien HIV/AIDS?
5. Bagaimanakah diagnosis TB pada pasien anak?
6. Apa saja diagnosis penunjang (non konvensional) TB?
7. Bagaimana aplikasi metode PCR untuk diagnosis TB pada pasien HIV/AIDS?
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tuberkulosis
Tuberkulosis adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi Mycobacterium tuberculosis complex. (Kemenkes RI, 2011)
Tuberkulosis (TB) merupakan masalah kesehatan masyarakat yang penting di dunia. Pada tahun 1992 World Health Organization (WHO) telah mencanangkan tuberkulosis sebagai « Global Emergency ». Laporan WHO tahun 2004 menyatakan bahwa terdapat 8,8 juta kasus baru tuberkulosis pada tahun 2002, 3,9 juta adalah kasus BTA (Basil Tahan Asam) positif. Sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi kuman tuberkulosis dan menurut regional WHO jumlah terbesar kasus TB terjadi di Asia tenggara, 33 % dari seluruh kasus TB di dunia. Apabila dilihat dari jumlah penduduk terdapat 182 kasus TB per 100.000 penduduk. Di Afrika hampir 2 kali lebih besar dari Asia tenggara yaitu 350 per 100.000 penduduk.
2.2 Karakteristik Epidemiologis TB
Karakteristik epidemiologis TB terdiri dari:
a. Agen penyakit TB
1. Morfologi dan Strukur Bakteri M.tb
Agen penyakit TB adalah Mycobacterium tuberculosis (M.tb). M.tb berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung, tidak berspora dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 – 0,6 mm dan panjang 1 – 4 mm. Dinding M. tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%).
Komponen penyusun utama dinding sel M.tb ialah asam mikolat, lilin kompleks (complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord factor, dan mycobacterial sulfolipids yang berperan dalam faktor virulensinya. Asam mikolat merupakan asam lemak berantai panjang (C60 – C90) yang dihubungkan dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid dan dengan peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri tersebut adalah polisakarida seperti arabinogalaktan dan arabinomanan (Kemenkes RI,2011).
Komponen antigen ditemukan di dinding sel dan sitoplasma yaitu komponen lipid, polisakarida dan protein. Karakteristik antigen M. tuberculosis dapat diidentifikasi dengan menggunakan antibodi monoklonal. Saat ini telah dikenal purified antigens dengan berat molekul 14 kDa (kiloDalton), 19 kDa, 38 kDa, 65 kDa yang memberikan sensitivitas dan spesifisitas yang bervariasi dalam mendiagnosis TB. Ada pula literatur yang menggolongkan antigen M. tuberculosis dalam kelompok antigen yang disekresi dan yang tidak disekresi (somatik). Antigen yang disekresi hanya dihasilkan oleh basil yang hidup, contohnya antigen 30.000 a, protein MTP 40 dan lain sebagainya (Kemenkes RI, 2011).
2. Aspek Biomolekuler M.tb
Genom M. tuberculosis mempunyai ukuran 4,4 Mb (mega base) dengan kandungan guanin (G) dan sitosin (C) terbanyak. Dari hasil pemetaan gen, telah diketahui lebih dari 165 gen dan penanda genetik yang dibagi dalam 3 kelompok. Kelompok 1 gen yang merupakan sikuen DNA mikobakteria yang selalu ada (conserved) sebagai DNA target, kelompok II merupakan sikuen DNA yang menyandi antigen protein, sedangkan kelompok III adalah sikuen DNA ulangan seperti elemen sisipan.
Gen pab dan gen groEL masing masing menyandi protein berikatan posfat misalnya protein 38 kDa dan protein kejut panas (heat shock protein) seperti protein 65 kDa, gen katG menyandi katalase-peroksidase dan gen 16SrRNA (rrs) menyandi protein ribosomal S12 sedangkan gen rpoB menyandi RNApolimerase.
Sikuen sisipan DNA (IS / Insertion Sequence) adalah elemen genetik yang mobile. Lebih dari 16 IS ada dalam mikobakteria antara lain IS6110, IS1081 dan elemen seperti IS (IS-like element). Deteksi gen tersebut dapat dilakukan dengan teknik PCR dan RFLP (Kemenkes RI, 2011).
b. Lingkungan
cm. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa risiko terjadinya TB Paru jauh lebih tinggi pada penduduk yang tinggal pada rumah yang tidak memenuhi standar kepadatan hunian (IPH, 2015).
Faktor lantai terkait dengan dengan tingkat kelembaban ruangan, sehingga pada kondisi lantai rumah terbuat dari tanah, cenderung mempengaruhi viabilitas kuman TBC di lingkungan yang pada akhirnya dapat memicu daya tahan kuman TBC di udara semakin lama (IPH, 2015).
Faktor Ventilasi akan terkait dengan sirkulasi pergantian udara dalam rumah serta proses pengurangan tingkat kelembaban. Standar luas ventilasi sesuai Kepmenkes Nomor 829/Menkes/SK/VII/1999 adalah 10% dari luas lantai. Ventilasi selain berperan sebagai tempat masuk sinar matahari, juga mempengaruhi dilusi udara, yang dapat mengencerkan konsentrasi kuman TBC atau kuman lain, yang dapat terbawa keluar ruangan, yang pada akhirnya dapat mati oleh sinar ultra violet matahari (IPH, 2015).
Faktor Pencahayaan. Menurut penelitian semua cahaya pada dasarnya dapat membunuh kuman TBC, tergantung jenis dan intensitasnya. Pencahayaan yang tidak memenuhi syarat berisiko 2,5 kali terkena TBC dibanding yang memenuhi syarat Rumah memerlukan cahaya cukup, khususnya sinar matahari dengan ultra violet nya. Pemenuhan pencahayaan rumah selain dipenuhi dari sumber buatan seperti lampu, juga oleh keberadaan ventilasi dan genteng kaca di rumah kita (IPH, 2015).
Faktor Kelembaban. Tingkat kelembaban masih terkait erat dengan tingkat kepadatan dan ventilasi rumah. Kelembaban merupakan sarana yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme, termasuk TBC. Namun kelembaban juga dipengaruhi oleh topografi sehingga wilayah lebih tinggi cenderung memiliki kelembaban yang lebih rendah. Menurut penelitian, penghuni rumah menempati rumah dengan tingkat kelembaban ruang lebih besar dari 60% berisiko terkena TB Paru 10,7 kali dibanding yang tinggal pada rumah dengan kelembaban lebih kecil atau sama dengan 60% (IPH, 2015).
c. Penderita
1. Jenis kelamin (gender)
Masniari dkk. (2007) memaparkan bahwa secara epidemiologi dibuktikan terdapat perbedaan antara laki-laki dan perempuan dalam hal prevalensi infeksi, perburukan gejala sakit, angka insidensi dan mortalitas akibat TB. Progresivitas penyakit juga mempunyai perbedaan antara laki-laki dan perempuan yaitu perempuan cenderung mempunyai penyakit yang lebih berat pada saat datang ke rumah sakit. Perempuan lebih sering terlambat datang ke pelayanan kesehatan dibandingkan dengan laki-laki. Hal ini mungkin berhubungan dengan aib dan rasa malu lebih dirasakan pada perempuan dibanding laki-laki. Perempuan juga lebih sering mengalami kekhawatiran akan dikucilkan dari keluarga dan lingkungan akibat penyakitnya. Hambatan ekonomi dan faktor sosioekonomi kultural turut berperan termasuk pemahaman tentang penyakit TB paru.
2. Usia
Di negara berkembang mayoritas individu yang terinfeksi M.tb adalah golongan usia di bawah 50 tahun, sedangkan di negara maju prevalensi TB sangat rendah pada mereka yang berusia di bawah 50 tahun namun masih tinggi pada golongan yang lebih tua.Masniari dkk. (2007) melaporkan bahwa di RS Persahabatan penderita TB paru yang paling banyak adalah usia produktif kerja yaitu kelompok usia 15 – 40 tahun. Pada usia tua, TB mempunyai tanda dan gejala yang tidak spesifik sehingga sulit terdiagnosis.
3. Diabetes Mellitus (DM)
Diabetes melitus merupakan salah satu keadaan yang mempermudah reaktivasi infeksi TB paru dengan risiko relatif berkembangnya TB paru bakteriologik positif sebesar 5 kali lebih tinggi. Disamping itu DM secara bermakna juga berkaitan dengan MDR TB (Masniari dkk., 2007).
Hiperglikemi kronik oleh karena DM akan menyebabkan gangguan fungsi paru melalui mekanisme glikosilasi dan glikasi asam amino dan lemak. Glikosilasi dan glikasi akan mengakibatkan penebalan serta perubahan struktur jaringan ikat membran basalis sehingga terjadi gangguan migrasi serta diferensiasi sel radang. Gangguan ini akan diperberat apabila terjadi asidosis karena kemampuan mobilisasi PMN, kemampuan fagositosis yang ditunjukkan melalui indeks kemotaktik pada penderita DM menurun. Pada penderita DM didapatkan defisiensi cell mediated immunity (imunitas selular) dan paling banyak berpengaruh dengan abnormalitas lekosit polimorfonuklear (PMN), monosit, dan limfosit. Kadar gula darah yang tinggi akan memicu terjadinya defek imunologis yang akan menurunkan fungsi netrofil, monosit maupun limfosit.
4. HIV
TB merupakan infeksi oportunistik yang potensial untuk penderita HIV/AIDS. TB sering merupakan manifestasi dini dari AIDS. HIV atau AIDS adalah penyakit infeksi yang gejalanya mencerminkan defisiensi imunitas selular akibat infeksi retrovirus. Ciri utama dari infeksi HIV adalah menurunnya serta terjadinya disfungsi sel-sel CD4 secara
progresif dibarengi dengan terjadinya defek fungsi makrofag dan monosit. Diketahui bahwa sel-sel CD4 dan makrofag
(bidirectional pathogenic interaction) yang memperburuk prognosis penderita.
2.3Diagnosis TB
2.3.1. Kriteria Diagnosis TB Paru
Kriteria diagnosis TB Paru terdiri dari (Kemenkes RI, 2011):
1. Gejala Klinis
Gejala klinis tuberkulosis dapat dibagi menjadi 2 golongan, yaitu gejala respiratorik (atau gejala organ yang terlibat) dan gejala sistemik.
a. Gejala respiratorik • batuk ≥ 3 minggu • batuk darah • sesak napas • nyeri dada
Gejala respiratorik ini sangat bervariasi, dari mulai tidak ada gejala sampai gejala yang cukup berat tergantung dari luas lesi.
Kadang penderita terdiagnosis pada saat medical check up. Bila bronkus belum terlibat dalam proses penyakit, maka penderita mungkin tidak ada gejala batuk. Batuk yang pertama terjadi karena iritasi bronkus, dan selanjutnya batuk diperlukan untuk membuang dahak ke luar.
Gejala tuberkulosis ekstra paru tergantung dari organ yang terlibat, misalnya pada limfadenitis tuberkulosa akan terjadi pembesaran yang lambat dan tidak nyeri dari kelenjar getah bening, pada meningitis tuberkulosa akan terlihat gejala meningitis, sementara pada pleuritis tuberkulosa terdapat gejala sesak napas & kadang nyeri dada pada sisi yang rongga pleuranya terdapat cairan.
b. Gejala sistemik • Demam
2. Pemeriksaan Fisik
Pada tuberkulosis paru, kelainan yang didapat tergantung luas kelainan struktur paru. Pada permulaan (awal) perkembangan penyakit umumnya tidak (atau sulit sekali) menemukan kelainan. Kelainan paru pada umumnya terletak di daerah lobus superior terutama daerah apex dan segmen posterior , serta daerah apex lobus inferior. Pada pemeriksaan jasmani dapat ditemukan antara lain suara napas bronkial, amforik, suara napas melemah, ronki basah, tanda-tanda penarikan paru, diafragma & mediastinum.
Pada pleuritis tuberkulosa, kelainan pemeriksaan fisik tergantung dari banyaknya cairan di rongga pleura. Pada perkusi ditemukan pekak, pada auskultasi suara napas yang melemah sampai tidak terdengar pada sisi yang terdapat cairan.
Pada limfadenitis tuberkulosa, terlihat pembesaran kelenjar getah bening, tersering di daerah leher (pikirkan kemungkinan metastasis tumor), kadang-kadang di daerah ketiak. Pembesaran kelenjar tersebut dapat menjadi “cold abscess”.
3. Pemeriksaan Bakteriologis a. Bahan pemeriksaan
Pemeriksaan bakteriologik untuk menemukan kuman tuberkulosis mempunyai arti yang sangat penting dalam menegakkan diagnosis. Bahan untuk pemeriksaan bakteriologik ini dapat berasal dari dahak, cairan pleura, liquor cerebrospinal, bilasan bronkus, bilasan lambung, kurasan bronkoalveolar (bronchoalveolar lavage/BAL), urin, faeces dan jaringan biopsi (termasuk biopsi jarum halus/BJH).
b. Cara Pengumpulan dan Pengiriman Spesimen
Cara pengambilan spesimen dahak sebanyak 3 kali, setiap pagi 3 hari berturut-turut atau dengan cara:
• Sewaktu/spot (dahak sewaktu saat kunjungan) • Dahak Pagi ( keesokan harinya )
• Sewaktu/spot ( pada saat mengantarkan dahak pagi)
berpenampang 6 cm atau lebih dengan tutup berulir, tidak mudah pecah dan tidak bocor. Apabila tersedia fasilitas pemeriksaan yang memadai, spesimen tersebut dapat dibuat sediaan apus pada gelas objek (difiksasi) sebelum dikirim ke laboratorium.
Bahan pemeriksaan hasil BJH, dapat dibuat sediaan apus kering di gelas objek atau untuk kepentingan biakan dan uji resistensi dapat ditambahkan NaCl 0,9% 3-5 ml sebelum dikirim ke laboratorium.
Spesimen dahak yang ada dalam pot (jika pada gelas objek dimasukkan ke dalam kotak sediaan) yang akan dikirim ke laboratorium, harus dipastikan telah tertulis identitas penderita yang sesuai dengan formulir permohonan pemeriksaan laboratorium.
Bila lokasi fasilitas laboratorium berada jauh dari klinik/tempat pelayanan penderita, spesimen dahak dapat dikirim dengan kertas saring melalui jasa pos.
Cara pembuatan dan pengiriman dahak dengan kertas saring: • Kertas saring dengan ukuran 10 x 10 cm, dilipat empat agar terlihat bagian tengahnya
• Dahak yang representatif diambil dengan lidi, diletakkan di bagian tengah dari kertas saring sebanyak + 1 ml
• Kertas saring dilipat kembali dan digantung dengan melubangi pada satu ujung yang tidak mengandung bahan dahak
• Dibiarkan tergantung selama 24 jam dalam suhu kamar di tempat yang aman, misal di dalam dus
• Bahan dahak dalam kertas saring yang kering dimasukkan dalam kantong plastik kecil
• Kantong plastik kemudian ditutup rapat (kedap udara) dengan melidahapikan sisi kantong yang terbuka dengan menggunakan lidi
• Di atas kantong plastik dituliskan nama penderita dan tanggal pengambilan dahak
• Dimasukkan ke dalam amplop dan dikirim melalui jasa pos ke alamat laboratorium.
Pemeriksaan bakteriologik dari spesimen dahak dan bahan lain (cairan pleura, cairan serebrospinal, bilasan bronkus, bilasan lambung, kurasan bronkoalveolar (BAL/BronchoAlveolar Lavage), urin, faeces dan jaringan biopsi, termasuk Biopsi Jarum Halus) dapat dilakukan
2. Mikroskopik fluoresens: pewarnaan auramin-rhodamin (khususnya untuk screening).
Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dahak dipekatkan lebih dahulu dengan cara sebagai berikut :
• Masukkan dahak sebanyak 2 – 4 ml ke dalam tabung sentrifus dan tambahkan sama banyaknya larutan NaOH 4% • Kocoklah tabung tersebut selama 5 – 10 menit atau sampai dahak mencair sempurna
• Pusinglah tabung tersebut selama 15 – 30 menit pada 3000 rpm
• Buanglah supernatan dan tambahkan 1 tetes indicator fenol-merah pada sedimen yang ada dalam tabung tersebut, warnanya akan berubah menjadi merah
• Netralkan reaksi sedimen itu dengan berhati-hati meneteskan larutan HCl 2% ke dalam tabung sampai tercapainya warna merah jambu ke kuning-kuningan
• Sedimen ini selanjutnya dipakai untuk membuat sediaan pulasan (boleh juga dipakai untuk biakan M.tuberculosis).
lnterpretasi hasil pemeriksaan mikroskopik dari 3 kali pemeriksaan ialah:
1) Tuberkulosis paru BTA positif.
a) Sekurang-kurangnya 2 dari 3 spesimen dahak SPS hasilnya BTA positif.
b) 1 spesimen dahak SPS hasilnya BTA positif dan foto toraks dada menunjukkan gambaran tuberkulosis.
c) 1 spesimen dahak SPS hasilnya BTA positif dan biakan kuman TB positif.
hasilnya BTA negatif dan tidak ada perbaikan setelah pemberian antibiotika non OAT.
2) Tuberkulosis paru BTA negatif
Kasus yang tidak memenuhi definisi pada TB paru BTA positif.
Kriteria diagnostik TB paru BTA negatif harus meliputi: a) Paling tidak 3 spesimen dahak SPS hasilnya BTA negatif b) Foto toraks abnormal sesuai dengan gambaran tuberkulosis.
c) Tidak ada perbaikan setelah pemberian antibiotika non OAT, bagi pasien dengan HIV negatif.
d) Ditentukan (dipertimbangkan) oleh dokter untuk diberi pengobatan.
ad 2) Pembiakan/Kultur
Pemeriksaan biakan M.tuberculosis dengan metode konvensional ialah dengan cara :
• Egg base media (Lowenstein-Jensen, Ogawa, Kudoh)
• Agar base media : Middle brook
Melakukan biakan dimaksudkan untuk mendapatkan diagnosis pasti(sebagai pemeriksaan baku emas), dan dapat mendeteksi Mycobacterium tuberculosis dan juga Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT). Untuk mendeteksi MOTT dapat digunakan beberapa cara, baik dengan melihat cepatnya pertumbuhan, menggunakan uji nikotinamid, uji niasin maupun pencampuran dengan cyanogen bromide serta melihat pigmen yang timbul.
4. Pemeriksaan Radiologis
oblik, CT-Scan. Pada pemeriksaan foto toraks, tuberkulosis dapat memberi gambaran bermacam-macam bentuk (multiform).
Gambaran radiologik yang dicurigai sebagai lesi TB aktif : • Bayangan berawan / nodular di segmen apikal dan posterior lobus atas paru dan segmen superior lobus bawah
• Kaviti, terutama lebih dari satu, dikelilingi oleh bayangan opak berawan atau nodular
• Bayangan bercak milier
• Efusi pleura unilateral (lebih sering didapatkan) atau bilateral (jarang).
Gambaran radiologik yang dicurigai lesi TB inaktif:
• Fibrotik pada segmen apikal dan atau posterior lobus atas • Kalsifikasi atau fibrotik
• Kompleks ranke (terdiri dari lesi Ghon dan kalsifikasi hilus ipsilateral)
• Fibrotoraks/Fibrosis parenkim paru dan atau penebalan pleura
Luluh Paru (Destroyed Lung ) :
Gambaran radiologik yang menunjukkan kerusakan jaringan paru yang berat, biasanya secara klinis disebut luluh paru . Gambaran radiologik luluh paru terdiri dari atelektasis, multikaviti dan fibrosis parenkim paru. Sulit untuk menilai aktivitas lesi atau penyakit hanya berdasarkan gambaran radiologik tersebut. Perlu dilakukan pemeriksaan bakteriologik untuk memastikan aktivitas proses penyakit.
Luas lesi yang tampak pada foto toraks untuk kepentingan pengobatan dapat dinyatakan sbb (terutama pada kasus BTA dahak negatif) :
• Lesi minimal , bila proses mengenai sebagian dari satu atau dua paru dengan luas tidak lebih dari volume paru yang terletak di atas chondrostemal junction dari iga kedua depan dan prosesus spinosus dari vertebra torakalis 4 atau korpus vertebra torakalis 5 (sela iga 2) dan tidak dijumpai kaviti
• Lesi luas Bila proses lebih luas dari lesi minimal.
2.3.2. Diagnosis TB pada ODHA(Orang Dengan HIV/AIDS)
Pada ODHA, diagnosis TB paru dan TB ekstra paru ditegakkan sebagai
1. TB Paru BTA Positif, yaitu minimal satu hasil pemeriksaan dahak positif.
2. TB Paru BTA negatif, yaitu hasil pemeriksaan dahak negatif dan gambaran klinis & radiologis mendukung Tb atau BTA negatif dengan hasil kultur TB positif.
3. TB Ekstra Paru pada ODHA ditegakkan dengan pemeriksaan klinis, bakteriologis dan atau histopatologi yang diambil dari jaringan tubuh yang terkena.
2.3.3. Diagnosis TB anak
Diagnosis TB pada anak sulit sehingga sering terjadi misdiagnosis baik overdiagnosis maupun underdiagnosis. Pada anak-anak batuk bukan merupakan gejala utama. Pengambilan dahak pada anak biasanya sulit, maka diagnosis TB anak perlu kriteria lain dengan menggunakan sistem skor.
IDAI telah membuat Pedoman Nasional Tuberkulosis Anak dengan menggunakan sistem skor (scoring system), yaitu pembobotan terhadap gejala atau tanda klinis yang dijumpai. Pedoman tersebut secara resmi digunakan oleh program nasional pengendalian tuberkulosis untuk diagnosis TB anak.
Batuk dimasukkan dalam skor setelah disingkirkan penyebab batuk kronik lainnya seperti Asma, Sinusitis, dan lain-lain.
· Jika dijumpai skrofuloderma (TB pada kelenjar dan kulit), pasien dapat langsung didiagnosis tuberkulosis.
· Berat badan dinilai saat pasien datang (moment opname).--> lampirkan tabel berat badan.
· Foto toraks bukan alat diagnostik utama pada TB anak
· Semua anak dengan reaksi cepat BCG (reaksi lokal timbul < 7 hari setelah penyuntikan) harus dievaluasi dengan sistem skoring TB anak.
· Anak didiagnosis TB jika jumlah skor > 6, (skor maksimal 14) · Pasien usia balita yang mendapat skor 5, dirujuk ke RS untuk evaluasi lebih lanjut.
pungsi pleura, foto tulang dan sendi, funduskopi, CT-Scan, dan lain lainnya.
2.4 Metode non konvensional Diagnosis TB
Metode non konvensional TB terdiri dari beberapa metode diagnosis, yaitu (Kemenkes RI, 2011):
1. Polymerase chain reaction (PCR)
Pemeriksaan PCR adalah teknologi canggih yang dapat mendeteksi DNA, termasuk DNA M.tuberculosis. Salah satu masalah dalam pelaksanaan teknik ini adalah kemungkinan kontaminasi.
Cara pemeriksaan ini telah cukup banyak dipakai, kendati masih memerlukan ketelitian dalam pelaksanaannya. Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk menegakkan diagnosis sepanjang pemeriksaan tersebut dikerjakan dengan cara yang benar dan sesuai standar.
Pada pemeriksaan deteksi M.tb tersebut diatas, bahan / spesimen pemeriksaan dapat berasal dari paru maupun luar paru sesuai dengan organ yang terlibat.
Visualisasi produk PCR terdiri dari beberapa metode yaitu:
a. Elektroforesis Gel Agarosa atau Gel Agarosa Poliakrilamida
horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal.
Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis.
Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Indikator yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan.
b. Pemeriksaan serologi, dengan berbagai metoda antara lain:
1). Enzym linked immunosorbent assay (ELISA)
Teknik ini merupakan salah satu uji serologi yang dapat mendeteksi respon humoral berupa proses antigen-antibodi yang terjadi. Beberapa masalah dalam teknik ini antara lain adalah kemungkinan antibodi menetap dalam waktu yang cukup lama.
2). Mycodot
(LAM) yang direkatkan pada suatu alat yang berbentuk sisir plastik. Sisir plastik ini kemudian dicelupkan ke dalam serum penderita, dan bila di dalam serum tersebut terdapat antibodi spesifik anti LAM dalam jumlah yang memadai yang sesuai dengan aktivitas penyakit, maka akan timbul perubahan warna pada sisir yang dapat dideteksi dengan mudah.
3). Uji peroksidase anti peroksidase (PAP)
Uji ini merupakan salah satu jenis uji yang mendeteksi reaksi serologi yang terjadi.
4). ICT
Uji Immunochromatographic tuberculosis (ICT) adalah uji serologik untuk mendeteksi antibodi M.tuberculosis dalam serum. Uji ICT tuberculosis merupakan uji diagnostik TB yang menggunakan 5 antigen spesifik yang berasal dari membran sitoplasma M.tuberculosis, diantaranya antigen M.tb 38 kDa.
Kelima antigen tersebut diendapkan dalam bentuk 4 garis melintang pada membran immunokromatografik (2 antigen diantaranya digabung dalam 1 garis) di samping garis kontrol. Serum yang akan diperiksa sebanyak 30 µl diteteskan ke bantalan warna biru, kemudian serum akan berdifusi melewati garis antigen.
c. Pemeriksaan BACTEC
Dasar teknik pemeriksaan biakan dengan BACTEC ini adalah metode radiometrik. M tuberculosis memetabolisme asam lemak yang kemudian menghasilkan CO2 yang akan dideteksi growth indexnya oleh mesin ini. Sistem ini dapat menjadi salah satu alternatif pemeriksaan biakan secara cepat untuk membantu menegakkan diagnosis.
d. Pemeriksaan Cairan pleura
Pemeriksaan analisis cairan pleura & uji Rivalta cairan pleura perlu dilakukan pada penderita efusi pleura untuk membantu menegakkan diagnosis. Interpretasi hasil analisis yang mendukung diagnosis tuberkulosis adalah uji Rivalta positif dan kesan cairan eksudat, serta pada analisis cairan pleura terdapat sel limfosit dominan dan kadar glukosa rendah.
e. Pemeriksaan Histopatologis
Bahan histopatologi jaringan dapat diperoleh melalui biopsi paru dengan trans bronchial lung biopsy (TBLB), trans thoracal biopsy (TTB), biopsi paru terbuka, biopsi pleura, biopsi kelenjar getah bening dan biopsi organ lain diluar paru. Dapat pula dilakukan biopsi aspirasi dengan jarum halus (BJH =biopsi jarum halus).
f. Pemeriksaan Darah
Hasil pemeriksaan darah rutin kurang menunjukkan pewarna yang spesifik untuk tuberkulosis. Laju endap darah ( LED) jam pertama dan kedua sangat dibutuhkan. Data ini sangat penting sebagai pewarna tingkat kestabilan keadaan nilai keseimbangan biologik penderita, sehingga dapat digunakan untuk salah satu respon terhadap pengobatan penderita serta kemungkinan sebagai predeteksi tingkat penyembuhan penderita. Demikian pula kadar limfosit bisa menggambarkan biologik/ daya tahan tubuh penderida , yaitu dalam keadaan supresi / tidak. LED sering meningkat pada proses aktif, tetapi laju endap darah yang normal tidak menyingkirkan tuberkulosis.
g. Uji Tuberkulin
Pemeriksaan ini sangat berarti dalam usaha mendeteksi infeksi TB di daerah dengan prevalensi tuberkulosis rendah. Di Indonesia dengan prevalensi tuberkulosis yang tinggi, pemeriksaan uji tuberkulin sebagai alat bantu diagnostik kurang berarti, apalagi pada orang dewasa. Uji ini akan mempunyai makna bila didapatkan konversi dari uji yang dilakukan satu bulan sebelumnya atau apabila positivitas dari uji yang didapat besar sekali atau bula.
2.5 Aplikasi metode PCR untuk diagnosis TB dalam populasi pasien TB khusus (pasien TB dengan HIV dan pasien anak).
2.5.1 Studi-studi mengenai aplikasi metode PCR untuk diagnosis TB dalam populasi pasien TB-HIV
1. Comparison of PCR with the Routine Procedure for Diagnosis of Tuberculosis in a Population with High Prevalences of Tuberculosis and Human Immunodeficiency Virus
Studi oleh Ndugga et. al. yang dilakukan di Nairobi, Kenya, Afrika pada kurun waktu Maret 2000 sampai Maret 2001 adalah studi prevalensi dengan tujuan diagnostik, yaitu untuk membandingkan akurasi PCR dengan prosedur diagnostik rutin untuk menegakkan diagnosis TB, di daerah endemis TB dengan prevalensi HIV/AIDS yang cukup tinggi. Prosedur diagnostik rutin TB yang dimaksud ini adalah pemeriksaan BTA mikroskopis, dan rontgen toraks untuk pasien dengan hasil pemeriksaan BTA mikroskopis negatif. Pemeriksaan ini semuanya akan dibandingkan dengan pemeriksaan baku emas yaitu kultur pada media Lowenstein-Jensen(LJ).
Populasi studi ini adalah seluruh pasien TB di Nairobi. Sampel studi adalah 1.398 individu suspek TB di Rhodes Chest Clinic, suatu pusat diagnostik yang besar di Nairobi. Kriteria inklusi adalah suspek TB yaitu batuk lebih dari 2 minggu dan/atau adanya hemoptysis. Pasien-pasien suspek TB tersebut kemudian diminta menyerahkan tiga spesimen sputum, yang pertama adalah saat pasien datang pertama kali di klinik, yang kedua adalah spesismen sputum pagi hari, dan yang ketiga adalah spesimen sputum yang diambil saat pasien datang kembali klinik untuk menyerahkan spesimen sputum yang kedua.
Pasien-pasien suspek TB tersebut juga diminta persetujuan untuk diambil sampel darah untuk tes HIV secara sukarela. Pasien-pasien yang tidak bersedia untuk dites HIV tetap diikutkan dalam studi ini.
Studi ini mendapatkan persetujuan etik dari komite etik The Kenya Medical Research Institute(KEMRI). Informed consent juga telah didapatkan dari semua partisipan studi ini.
HASIL
apusan-negative. 490(57%) dari 867 suspek ini hasil kulturnya positif, sedangkan 377(43%) negatif. 217 dari 1.398 individu ini setuju untuk dilakukan pemeriksaan HIV, dengan 77(35%) HIV positif, dan 140(65%) HIV negatif.
Hasil pemeriksaan prosedur diagnostik rutin didapatkan 302 suspek TB apusan-positif dan 278 suspek TB apusan-negatif. 2.3% dari suspek TB dengan apusan-positif dan 44.2% dari suspek TB dengan apusan-negatif didapatkan hasil kultur yang negatif (overdiagnosis). Sedangkan 40(13.9%) dari 287 suspek dengan label bukan TB ternyata hasil kulturnya positif (underdiagnosis).
Tabel 1. Perbandingan diagnosis rutin (pengecatan BTA ZN diikuti rontgen toraks) dengan hasil kultur sebagai merode baku emas.
Tabel 2. Perbandingan diagnostik PCR pada ketiga spesimen dengan kultur sebagai metode baku emas.
Hasil PCR diperoleh dari Jumlah(%)yangPCR
Jumlah(%) hasil yang diperoleh dari kultur
Positif Negatif
Positif 514(59.3) 454(88.39) 60(11.7)
Negatif 353(40.7) 36(10.2) 317(89.8)
Total 867(100) 490(56.5) 377(43.5)
Perbandingan prosedur diagnostik rutin dan PCR, PCR memiliki sensitivitas yang lebih baik(98%) daripada pemeriksaan ZN(60%) maupun kombinasi ZN dan rontgen toraks. Spesifisitas PCR(84%) lebih rendah daripada ZN(98%) namun lebih baik daripada spesifisitas kombinasi ZN dan rontgen toraks(pada apusan-negatif) yang hanya 66%. PCR dengan tepat mengidentifikasi 294(99.7%) dari 295 apusan-positif sejati(positif baik kultur maupun dan ZN).
Tabel 3. Sensitivitas dan spesifisitas PCR dan prosedur diagnostik rutin.
Prosedur Diagnostika Sensitifitas(%)b Spesifisitas(%)c
Pemeriksaan ZN saja pada 3 apusan(TB-apusan positif)
60(57-63) 98(97-99)
Pemeriksaan ZN dan rontgen toraks(TB apusan-positif dan TB apusan-negatif)
92(90-94) 66(62-69)
Pemeriksaan PCR
pada 3 apusan. 93(91-94) 84(82-87)
aTes dilakukan pada 867 suspek, 490 di antaranya memberikan hasil
kultur positif dan 377 memberikan hasil kultur negatif.
b95% IK(Interval Kepercayaan).
Studi yang dilakukan oleh Torrea et.al. di Burkina Faso tahun 2000 sampai 2001 menganalisis metode otnPCR(one tube nested PCR) dengan sampel urin pada 331 pasien TB dari 4 center di Burkina Faso yaitu: Pusat Tuberkulosis Regional dan Unit Pneumologi Rumah Sakit Nasional Sanou Sourou di kota Bobo-Dioulasso(kota terbesar kedua di Burkina Faso), serta Pusat Tuberkulosis Nasional dan Departemen Pneumologi di Rumah Sakit Nasional Yalgado Ouedraogo di Ouagadougou(ibukota Burkina Faso).
Burkina Faso termasuk salah satu negara di Afrika dengan beban sakit TB yang besar, dengan rata-rata 2000 kasus baru TB setiap tahun(menurut Register Program Nasional Kontrol TB Burkina), dengan kasus TB-smear negatif sebanyak 12% (World Health Organization, 2004). Data tahun 2001 diperkirakan sebanyak 7.2% populasi di Burkina Faso terinfeksi HIV (data dari Register Program Nasional Kontrol HIV/AIDS, 2001).
Metode mikrobiologis klasik untuk mendiagnosis PTB(Pulmonary TB) dan Extrapulmonary TB(EPTB) memiliki kelemahan yang mencolok dalam hal sensitivitas dan spesivisitasnya. Sensitivitas pemeriksaan smear mikroskopis berkisar antara 50-60%, sedangkan kultur membutuhkan waktu 3-6 minggu untuk mendeteksi spesimen yang positif.
Hasil smear negatif pada individu suspek TB menjadi sangat problematik terutama pada situasi tidak tersedianya metode diagnosis yang lain. Terlebih lagi PTB dengan pengecatan BTA memiliki assosiasi kuat dengan infeksi HIV (Torrea, 2001). Pada pasien-pasien ini bahkan abnormalitas foto rontgen toraks maupun gejala klinis yang klasik sering tidak nampak. Atas dasar inilah pengobatan pada pasien-pasien ini sering terlambat karena penegakan diagnosis yang sering juga terlambat.
EPTB sendiri juga sangat sulit dideteksi tanpa pemeriksaan sitologis dan histologis, yang sering tidak tersedia di Burkina Faso. Penggunaan metode-metode diagnostik molekuler yang sederhana untuk mendeteksi sedikit BTA dari M. tb complex sangat bermanfaat untuk medeteksi kasus-kasus semacam ini.
Eukariota(inang). Sementara itu sampel urin lebih mudah diperoleh dan basili dapat dikonsentrasikan dengan sentrifugasi. Terlebih lagi penelitian sebelumnya oleh Sechi et. al.(1997) dan Aceti et. al. (1999) melaporkan bahwa M. tuberculosis dapat dideteksi pada sampel urin dengan otnPCR menggunakan sekuens IS6110 sebagai target.
Tujuan studi ini adalah untuk evaluasi sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif(NPP), dan nilai prediksi negatif(NPN) dari analisis otnPCR dengan sampel urin. Populasi studi ini adalah pasien TB baik PTB dan EPTB di RS Nasional dan Pusat Tuberkulosis Regional di dua kota terbesar di Burkina Faso. Sampel studi ini adalah sampel urin pasien-pasien TB tersebut yang terpilih sebagai sampel, yaitu sebanyak 301 pasien.
Kriteria inklusi adalah pasien dengan suspek PTB dari hasil pemeriksaan mikrobiologis pengecatan BTA dari sampel sputum positif 2 dari 3 sampel sputum (kelompok pasien PTB smear-positif), dan/atau 1 dari 3 sampel sputum didapatkan hasil positif pada pengecatan BTA, namun setidaknya satu sampel sputum memberikan hasil kultur positif (kelompok pasien PTB smear-negatif). Kriteria eksklusi adalah pasien yang sedang mendapatkan pengobatan TB sebelum dimulainya studi ini. Dari setiap pasien diambil tiga sampel urin pagi selama tiga hari berturut-turut (untuk pemeriksaan otnPCR) dan dua sampel sputum pagi (satu untuk pemeriksaan mikroskopis dan satu lagi untuk kultur) serta 5 ml darah (untuk pemeriksaan antibodi HIV).
Studi ini mendapatkan persetujuan etik dari komite etik Center Muraz, Burkina Faso. Informed consent tertulis telah didapatkan dari setiap pasien sebelum diikutkan dalam studi ini.
METODE
1. Analisis Mikrobiologis
Pengecatan BTA(Basil Tahan Asam) dikerjakan dengan metode ZN pada dua spesimen sputum yang diperoleh dua hari berturut-turut.
Kultur mikobakteria dikerjakan pada media Lowenstein Jensen dan uji-uji identifikasi biokimiawi untuk M. tuberculosis complex dilakukan pada isolat yang dikultur tersebut.
2. Uji-uji Serologis
imunoasai enzim komersial (Murex HIV-1.2,O dari Abbott). Pada kasus di mana hasil uji ini reaktif, pembedaan infeksi oleh HIV-1 atau HIV-2 dilakukan dengan menggunakan dua uji monospesifik komersial, Wellcozyme HIV Recombinant dari Abbott untuk HIV-1 dan Murex HIV-2 untuk HIV-2.
3. Analisis otnPCR
Meliputi beberapa tahapan yaitu: I. Pengolahan sampel urin
Tiga spesimen urin ditampung dan disentrifus pada kecepatan 3000 g selama 20 menit. Supernatan dihilangkan dan nedapan yang timbul diresuspensi dalam 1 volume NaOH 4%. Setelah diinkubasi selama 15 menit pada suhu 3 C, 30 ml PBS77 ditambahkan dan sampel-sampel tersebut disentrifus pada kecepatan 3000 g selama 20 menit. Endapan yang timbul diresuspensi dalam 1 ml PBS, dan alikuot sebanyak 500 µL disimpan dalam suhu -2 C sampai digunakan untuk analisis.07
II.Ekstraksi DNA kromosomal
Alikuot pada ad.I diinaktivasi pada suhu 10 C selama 1007 menit. Debris yang timbul dicuci sekali dengan air suling steril dan disentrifus pada kecepatan 16000g selama 5 menit. Supernatan yang timbul disingkirkan dan endapan yang ada diresuspensi dalam 50 µL 0.5% Tween 20 dalam air suling steril. Kemudian dilanjutkan pemanasan pada 10 C dan pendinginan07 pada -8 C selama 5 menit sebanyak dua kali, untuk selanjutnya07 dipanaskan kembali pada suhu 10 C selama 5 menit.07
Selanjutnya sampel-sampel tersebut disentrifus pada kecepatan 9000 g selama 5 menit dan supernatan yang timbul dipindahkan ke tabung mikrosentrifus. Satu volume kloroform ditambahkan pada sampel kemudian dicampur dengan vortexing selama 2 menit. Setelah sentrifugasi pada 9000 g selama 2 menit, 10 µL dari supernatan digunakan untuk prosedur amplifikasi DNA.
III. otnPCR(one tube nested PCR)
Pasangan primer eksternal adalah TB290 GGCGGGACAACGCCGAATTGCGAA-3’) dan TB856 (5’-CGAGCGTAGGCGTCGGTGACAAG-3’), sedangkan primer internalnya adalah TB431 (5’-TACTACGACCACATCAACCG-3’) dan TB740c (5’-GGGCTGTGGCCGGATCAGCG-(5’-TACTACGACCACATCAACCG-3’). Campuran reaksinya terdiri dari 20mM Tris/HCl (pH8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.3 mM (masing-masing) dATP, dGTP,
dCTP, dan dTTP, 0.01 µM primer eksternal, 0.1 µM primer internal, dan 2 U Taq DNA polymerase (Invitrogen) dalam volume reaksi total 30 µL. untuk reaksi amplifikasi, kondisi siklus temperatur terdiri dari 4 tahap yang berurutan yaitu:
1. satu siklus dalam 9 C selama 5 menit; 47
2. 40 siklus dalam 9 C selama 40 detik; 6 C selama 40 detik;47 47 kemudian 7 C selama 1 menit;27
3. 25 siklus dalam 9 C selama 40 detik, 5 C selama 40 detik47 47 dan 7 C selama 1 menit;27
4. Siklus terakhir yaitu 7 C selama 10 menit.27
Kontrol positif dan negatif disertakan pula dalam setiap tahap, dan tindakan kehati-hatian untuk mencegah kontaminasi juga dikerjakan dengan saksama. Produk PCR divisualisasikan dalam 2% gel agarosa dalam buffer Tris-Borate-EDTA. Pita-pita target dengan ukuran sekitar 500 dan 300 bp divisualisasikan dengan indikator EtBr(Ethidium Bromida).
4. Analisis Statistik
Data dikumpulkan dan diolah menggunakan program Epi Info6 versi 6.04. Sensitivitas, spesifisitas, NPP(Nilai Prediksi Positif) dan NPN(Nilai Prediksi Negatif) dengan interval kepercayaan sebesar 95% juga dikalkulasi. Proporsi-proporsi yang ada diperoleh dengan metode Binomial Eksak(IK 95%) dan uji statistik yang digunakan adalah chi square dan korelasi momen produk Pearson.
HASIL
1. Kasus
(termasuk 82 kasus terinfeksi HIV) dan tujuh diantarnya BTA smear-negatif dan kultur-positif (termasuk empat pasien yang terinfeksi HIV).
Lokasi infeksi selain paru-paru juga didapatkan pada beberapa pasien PTB, seperti 2 dari 210 pasien PTB yang merupakan kelompok dengan hasil pengecatan BTA-smear positif dan kultur positif (1 kasus TB milier, 1 kasus pleural TB), dan 2 dari 7 pasien yang merupakan kelompok dengan pengecatan BTA-smear negatif dan kultur positif (keduanya pleural TB). Sedangkan kelompok PTB dengan hasil pemeriksaan mikrobiologis negatif (pengecatan BTA dan sputum negatif) terdiri dari 30 pasien (16 diantaranya terinfeksi HIV), 7 dari 30 pasien ini juga terkena infeksi EPTB selain juga PTB (4 kasus pleural TB, 1 TB milier, 1 penyakit Pott’s, dan 1 peritonitis TB).
160 pasien PTB adalah laki-laki (dari 247 pasien PTB), dan 87 pasien wanita. Rerata usia pasien PTB laki-laki adalah 36.8 tahun; rentang usia 15-75 tahun. Sedangkan rerata usia pasien PTB wanita adalah 35.6 tahun, rentang usia 15-70 tahun.
2. Kontrol
74 pasien(termasuk 31 pasien terinfeksi HIV) dikategorikan sebagai kelompok kontrol, namun 19 pasien dalam analisis lanjutan dikeluarkan dari kelompok kontrol karena beberapa alasan berikut: 5 pasien hilang dalam periode follow-up, 12 pasien positif TB, satu pasien tinggal dengan penderita TB, dan satu pasien lagi meninggal karena efusi pleura sugestif TB. Akhirnya 55 pasien kontrol(termasuk 22 terinfeksi HIV) yang dimasukkan dalam analisis.
M. tuberculosis complex otnPCR positif didapatkan pada 88(40.6%) sampel urin dari 217 pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB positif, 20 dari 30 pasien(66.7%) dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB negatif dan 48 dari 84 pasien dengan EPTB. Deteksi M. tuberculosis lebih pada pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis TB negatif dan kelompok EPTB daripada kelompok dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB positif (chi-square test, P=0.003). Perbedaan antara kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB negatif dengan kelompok EPTB tidak signifikan (P>0.05).
yaitu 6 dari 7 hasil positif pada sampel urinnya (3 pasien HIV positif dan 3 pasien HIV negatif).
Kelompok pasien EPTB juga menunjukkan tingkat deteksi otnPCR dengan sampel urin yang baik, dengan 6 dari 7 sampel terdeteksi positif pada kelompok dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB negatif dan 3 dari 4 sampel urin pada kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB positif.
Sensitivitas otnPCR dengan sampel urin berkisar antara 40.6% (95% IK, 34.0-47.4) pada kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB positif sampai dengan 66.7% (95% IK, 47.1-82.1) pada kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis TB negatif. Spesifisitas uji ini pada seluruh kelompok pasien adalah 98.2% (95% IK, 89.9-99.9).
Nilai Prediksi Positif (NPP) pada seluruh kelompok pasien didapatkan di atas 95%. Nilai Prediksi Negatif (NPN) didapatkan lebih rendah yaitu 29.5% (95% IK, 23.1-36.8) pada kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB positif sampai dengan 84.4% (95% IK, 72.7-91.9) pada kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis TB negatif.
Sensitivitas uji ini lebih tinggi pada pasien-pasien dengan infeksi HIV daripada pasien-pasien tanpa infeksi HIV pada kelompok pasien dengan pemeriksaan mikrobiologis PTB positif (53.5% versus 32.1%, 95% IK, 42.4-64.2). Sensitivitas pada kelompok pasien EPTB juga cukup baik yaitu sebesar 67.4% (95% IK, 51.3-80.5) daripada kelompok pasien PTB yaitu 46.3%. (95% IK, 31.0-62.4).
Kesimpulan yang didapatkan dari studi ini adalah bahwa teknik pemeriksaan otnPCR dengan sampel urin tidak direkomendasikan untuk deteksi rutin kasus TB baru, namun teknik pemeriksaan ini dapat berguna untuk konfirmasi diagnosis M. tuberculosis pada pasien-pasien suspek TB dengan hasil pemeriksaan mikrobiologis PTB negatif (baik pengecatan smear BTA yang negatif dan/atau hasil kultur negatif) dan kelompok pasien EPTB di mana temuan klinis maupun bakteriologis kurang konklusif khususnya pada kelompok pasien TB dengan ko-infeksi HIV.
Berikut ini beberapa studi untuk mengetahui efektivitas metode PCR dalam mendeteksi kasus TB pada pasien anak.
1. Performance of Nested PCR in The Specific Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex in Blood Samples of Pediatric Patients
Studi ini dilakukan di Brazil, tepatnya di rumah sakit umum milik pemerintah di kota Recife, Brazil. Rentang waktu studi ini adalah mulai Januari 2003 sampai dengan Agustus 2005. Populasi studi ini adalah seluruh pasien anak di rumah sakit umum Recife dengan suspek TB, dan sampel studi ini adalah pasien-pasien anak suspek TB di rumah sakit umum Recife yang terpilih sebagai sampel. Kriteria inklusi adalah seluruh pasien di bawah umur 15 tahun saat mulai didiagnosis suspek TB oleh dokter-dokter anak staf rumah sakit Recife dengan pedoman diagnosis yang dikeluarkan oleh American Thoracic Society. Kriteria eksklusi adalah: pasien dengan penyakit kronis, pasien dalam terapi kortikosteroid atau immunosupressan lebih dari 15 hari, pasien diketahui terinfeksi HIV, dan pasien dengan penyakit paru-paru kronis yang lain.
Spesimen darah diambil dari 120 pasien anak dengan diagnosis awal suspek TB. Diagnosis awal suspek TB ini didasarkan pada beberapa kriteria yaitu temuan klinis dan/atau radiologis, riwayat kontak dengan pasien TB dewasa atau hasil tes tuberkulin positif(> 10 mm untuk pasien-pasien yang divaksinasi BCG lebih dari 2 tahun yang lalu dan > 15 mm untuk pasien-pasien yang divaksinasi BCG kurang dari 2 tahun). 120 pasien-pasien anak ini kemudian dikelompokkan menjadi 2 grup, yaitu:
1. Suspek TB(dengan kriteria seperti disebutkan sebelumnya) yang terdiri dari:
a. TB aktif: temuan klinis dan radiologis konsisten dengan TB aktif, isolasi M.tuberculosis pada sampel biologis maupun perbaikan klinis setelah terapi spesifik (untuk TB).
b. TB laten: tanpa tanda-tanda klinis maupun radiologis; tes-tes bakteriologi negatif (apabila memungkinkan); namun hasil tes tuberkulin positif dan adanya riwayat kontak dengan penderita TB dewasa yang infeksius.
2. “Bebas” TB(TB-free): tanpa riwayat kontak dengan pasien TB dewasa, temuan klinis dan laboratorium inkonsisten dengan TB laten maupun aktif; adanya bekas jaringan parut vaksinasi BCG(BCG vaccination scar).
Studi ini mendapatkan persutujuan dari Komite Etik Pusat Riset Aggeu Magalhães Yayasan Oswaldo Cruz, kota Recife, Brazil. Orang tua pasien dan pendamping legal pasien setuju memberikan informed consent untuk partisipasi studi dan pengambilan darah.
METODE
Untuk kepentingan standardisasi dan hasil yang lebih efektif, digunakan DNA genomik dari referensi strain M.tuberculosis (H37Rv), dengan menggunakan kit ekstraksi produksi Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA, dengan instruksi sesuai manufaktur. Serial dilusi kurva faktor 10, dengan rentang dari 10 ng sampai 0.01 fg, digunakan dengan tujuan untuk menetukan ambang deteksi nPCR. Selanjutnya DNA yang telah dimurnikan ini ditambahkan ke spesimen darah individu yang sehat. DNA dari strain ini digunakan sebagai kontrol positif pada reaksi amplifikasi.
2-4.5 ml darah diambil dari tiap pasien dengan punksi vena menggunakan spuit produksi Becton and Dickson, Oxford , England, mengandung ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) dan disimpan pada suhu C.47
dalam PCR. Sekuens insersi IS6110, yang ditemukan pada strain kompleks M. tuberculosis, digunakan sebagai target amplifikasi.
DNA M. TBC dalam sampel biologis diperkuat dengan thermocycler otomatis (model 4800; Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). Campuran reaksi amplifikasi pertama terdiri dari 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2.5 mM MgCl2, 200 µM dari setiap dNTP, 25 pmol dari setiap oligonucleotide (IS1-5 'CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG3' dan IS2-5' CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG3') dan 2.5 U Taq DNA polimerase, dalam volume akhir 50 μL. Tahap denaturasi ini dilaksanakan di 94ºC untuk 30 detik, tahap annealing dilaksanakan di 68ºC untuk 1 menit, dan tahap ekstensi ini dilaksanakan di 72ºC untuk 1 menit, berjumlah 30 siklus. Dalam reaksi kedua (nPCR), 2 μL produk reaksi pertama ditambahkan, konsentrasi yang sama digunakan dalam reaksi sebelumnya. Kondisi amplifikasi, dalam langkah-langkah yang dijelaskan di atas, masing-masing, 94ºC untuk 30 detik, 57ºC untuk 30 detik, dan 72ºC untuk 30 detik, menggunakan Oligonukleotida IS3 dan IS4 (5' GGTGACAAAGGCCACGTAGG3 'dan 5' CCAGCACCTAACCGGCTGT3') untuk 30 siklus.
Produk yang telah diamplifikasi, 10 μL dianalisis pada gel agarose 2.0% dan diwarnai dengan ethidium bromida. Utas DNA dipisahkan melalui elektroforesis divisualisasikan dalam transilluminator UV dan difotografi dengan kamera.
Analisis deskriptif digunakan untuk menunjukkan hasil yang diperoleh, dan variabel-variabel yang diukur dipresentasikan dalam tabel. Uji chi-square dipilih untuk menganalisis variabel-variabel, dan uji Fischer’s exact digunakan seperlunya. Untuk memvalidasi uji-uji tersebut, sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif, dan nilai prediksi negatif, bersama dengan interval kepercayaannya masing-masing dikalkulasi. Seluruh kesimpulan dibuat dengan level signifikansi 5%. Pogram pengolahan data statistik yang digunakan adalah Epi Info, versi 6.04d, dan SPSS, versi 8.0.
HASIL
120 pasien dievaluasi pada studi ini; 93 pasien dengan kecurigaan awal TB dan 27 pasien adalah kelompok kontrol. Median usia adalah 7.00 + 0.42 tahun. Tidak didapatkan perbedaan signifikan pada gender dari pasien-pasien tersebut. Pasien-pasien-pasien tersebut menurut diagnosis akhir dikelompokkan menjadi beberapa kategori, yaitu: TB aktif; TB laten; TB pilah-keluar(ruled out); dan kontrol (individu-individu yang tidak terinfeksi).
Berikut ini disajikan data-datanya dalam tabel,
TB ekstrapulmoner 9 21.0
*Tanpa TB (kontrol original) ditambah Suspek TB namun dalam perjalanannya dilakukan pilah-keluar (ruled out), sehingga juga dikategorikan sebagai grup kontrol.
93 individu yang awalnya diduga TB, sebagian besar (69.89%) adalah TB aktif atau TB laten. Tampilan klinis TB pulmoner lebih banyak didapatkan pada grup pasien yang terinfeksi, sebanyak 78.57%. Tampilan TB ekstrapulmoner yang terdeteksi adalah kelenjar limfe perifer (n=3), tulang (n=2), abdominal (n=1), pleural (n=1), milier (n=1) dan meningitis (n=1). Tidak ditemukan perbedaan terkait umur yang signifikan dalam hubungannya dengan keberadaan atau tampilan klinis penyakit TB.
nPCR memberikan hasil positif pada 22.58% pada grup kecurigaan awal TB. Konkordansi antara nPCR dengan diagnosis akhir sebesar 52.38% di antara kasus TB aktif dan 28.57% pada kasus TB laten.
Sensitivitas dan spesifisitas nPCR untuk memilah kelompok infeksi TB dengan kelompok non-infeksi adalah sebesar 26.15% dan 92.73%. Sensitivitas untuk kasus TB ekstra pulmoner adalah sebesar 55.56%, dan untuk TB pulmoner adalah sebesar 18.18%.
2. Akurasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dibandingkan uji tuberkulin untuk diagnosis tuberkulosis pada anak
Penelitian oleh Kaswandani et.al. (2007) ini merupakan suatu uji diagnosis yang mengevaluasi akurasi PCR untuk mendiagnosis penyakit TB pada anak, dibandingkan dengan pemeriksaan uji tuberkulin yang telah lama digunakan sebagai pemeriksaan penunjang.
pasien yang orangtuanya menolak berpartisipasi dalam penelitian. Baku emas uji diagnosis ini adalah hasil yang positif pada pemeriksaan sediaan langsung basil tahan asam dan/atau biakan Mycobacterium tuberculosis positif.
Seluruh orangtua pasien telah menyatakan persetujuannya untuk mengikuti penelitian ini secara tertulis dan telah mendapat ijin dari komite etik masing-masing rumah sakit. Data yang diperoleh diolah dan disajikan dengan menggunakan program SPSS 17.
METODE
1. Pengambilan sampel
Seluruh pasien yang memenuhi kriteria inklusi menjalani pengambilan spesimen dari dahak / bilasan lambung / cairan pleura / aspirasi kelenjar getah bening (dengan jarum halus) atau cairan serebrospinal.
2. Uji tuberkulin
Uji tuberkulin dikerjakan pada seluruh subyek. Pemeriksaan uji tuberkulin dilakukan dan dibaca oleh dokter yang menangani pasien tanpa mengetahui hasil pemeriksaan PCR dan BTA serta hasil kultur, sebaliknya ahli mikrobiologi yang melakukan pemeriksaan tidak mengetahui data klinis pasien. Uji tuberkulin dikerjakan dengan menggunakan PPD(Purified Protein Derivates) RT23 2TU yang diproduksi oleh Staten Serum Institute, Copenhagen, Denmark. Petugas yang melakukan uji tuberkulin adalah perawat yang sudah dilatih secara khusus. Setelah 48 – 72 jam penyuntikan, dokter peneliti membaca hasil uji tuberkulin dengan metode “ballpoint”. Uji tuberkulin dinyatakan positif apabila didapatkan diameter indurasi 10mm atau lebih (tanpa melihat status BCG).
3. Pemeriksaan PCR
Protokol pemeriksaan PCR menggunakan deteksi molekular IS6110. IS 6110 tidak dapat membedakan strain maupun MOTT (mycobacterium other than tuberculosis). Prosedur PCR meliputi isolasi DNA dan amplifikasi IS6110 untuk diagnosis Mycobacterium tuberculosis. Pembacaan produk PCR dilakukan dengan metode elektroforesis gel agarosa dengan pewarna EtBr.
Pewarnaan sediaan langsung untuk mendeteksi BTA menggunakan dua cara yaitu Auramin dan Ziehl Neelsen. Hasil positif pada Auramin akan dikonfirmasi dengan Ziehl Neelsen untuk konfirmasi diagnosis TB.
5. Pemeriksaan mikrobiologis kultur
Seluruh spesimen dikultur pada media solid Lowenstein-Jensen dan dikonfirmasi sebagai Mycobacterium tuberculosis complex melalui uji konfirmasi serial seperti uji Niasin, reduksi nitrat dan uji katalase.
HASIL
181 pasien didapatkan dengan diagnosis tersangka tuberkulosis yang dievaluasi dengan anamnesis, pemeriksaan fisik dan pemeriksaan penunjang berupa uji tuberkulin, PCR, BTA dan kultur. Sebagian besar spesimen berupa bilasan lambung. Dari 181 pasien yang diperiksa, terdapat 13 pasien yang sediaan BTA langsung dan/atau biakan positif Mycobacterium tuberculosis. Terdapat empat spesimen dengan hasil sediaan BTA langsung positif tetapi pada kultur tidak tumbuh. Karakteristik subyek penelitian ini diuraikan dalam tabel 5.
Tabel 5 Karakteristik subyek penelitian
Karakteristik n (persentase)
Jenis kelamin
Laki-laki 80 (44.2)
Perempuan 101 (55.8)
Rerata usia (bulan) 49.7
Diagnosis kerja
Limfadenitis TB 19(10.5)
TB milier 3 (1.6)
Spondilitis TB 3 (1.6)
Meningitis TB 2 (1.2)
Confirmed TB 13 (7.2)
Apusan BTA positif
10 (5.5) Kultur M. tb complex positif 7 (3.9)
Kultur MOTT positif 5 (2.8)
Prevalensi diagnosis TB pasti pada studi ini adalah 7,2%. Spesimen yang diperiksa sebagian besar adalah bilasan lambung. Bilasan lambung diperiksa dua hari berturut-turut. Hasil pemeriksaan uji tuberkulin pada subyek dibandingkan dengan hasil pulasan BTA dan/atau biakan Mycobacterium tuberculosis tertera pada Tabel 6.
Tabel 6
Hasil pemeriksaan uji tuberkulin dibandingkan dengan BTA/kultur Uji tuberkulin BTA/kultur positif BTA/kultur negatif
Positif 10 76
Negatif 3 92
Hasil pemeriksaan PCR pada subyek dibandingkan dengan hasil pulasan BTA dan/atau biakan Mycobacterium tuberculosis tertera pada Tabel 7.
Tabel 7 Hasil pemeriksaan PCR dibandingkan dengan BTA/kultur
PCR BTA/Kultur
Positif
BTA/Kultur Negatif
Positif 9 72
Perhitungan sensitivitas dan spesifisitas terhadap PCR dan uji tuberkulin, serta penilaian terhadap nilai-nilai diagnostik lainnya tertera pada Tabel 8.
Tabel 8 Perbandingan nilai diagnostik uji tuberkulin dan PCR
Nilai Diagnostik Uji Tuberkulin PCR
Hasil penelitian Kaswandani et. al. (2007) ini ditemukan bahwa untuk mendiagnosis TB pada anak, PCR tidak menunjukkan keunggulan dalam nilai-nilai diagnostik (sensitivitas, spesifisitas, dan lainnya) dibandingkan dengan uji tuberkulin. Diperlukan penelitian uji diagnosis dengan skala yang lebih besar dengan kriteria inklusi yang lebih ketat untuk memperoleh kekuatan penelitian yang lebih tinggi. Bahwa direkomendasikan untuk melakukan anamnesis yang cermat, pemeriksaan fisik yang seksama, dan melakukan pemeriksaan penunjang yang penting seperti uji tuberkulin dan foto radiologik untuk menegakkan diagnosis TB pada anak.
BAB III
PEMBAHASAN DAN KESIMPULAN
Diagnosis dini diikuti oleh terapi yang adekuat adalah sangat penting untuk mencegah morbiditas dan mortalitas akibat TB. Meskipun teknik konvensional dengan pengecatan ZN(Ziehl Neelsen) relatif mudah dilakukan dan murah, salah satu kerugian yang mencolok dari teknik ini adalah sensitivitasnya yang rendah. Hal ini dibuktikan dari laporan Perkins dkk. yang menemukan bahwa pengecatan ZN hanya mendeteksi 30-60% dari suspek TB dengan kultur positif sebagai diagnosis baku emas. Hal yang lebih menyulitkan adalah bahwa sampel sputum perlu diambil 3 hari berturut-turut, yang berdampak pada komplians pasiens.
Metode diagnostik TB dengan PCR terbukti lebih efisien di mana hanya dibutuhkan satu sampel sputum untuk mencapai sensitivitas sebesar 86%, dan sensitivitas sebesar 93% untuk mendeteksi kasus TB kultur positif dengan 3 sampel sputum. Hal ini sebanding dengan tingkat sensitivitas 92% yang diperoleh dengan pemeriksaan mikroskopis dengan pengecatan ZN. Namun PCR memiliki spesifisitas lebih baik (84%) dibandingkan ZN(66%). Saat pemeriksaan sputum pertama saja yang diperhitungkan, sensitivitas pemeriksaan PCR turun hanya menjadi 86%, namun spesifisitasnya meningkat menjadi 90%.
Sensitivitas PCR yang tinggi pada 3 sampel (93%) dan bahkan pada sampel pertama (86%), membuka peluang ke arah suatu metode diagnostik untuk skrining yang lebih sederhana di mana kedua pemeriksaan ZN dan rontgen toraks dapat dihindari. Terlebih lagi, terdapat beberapa kelebihan metode PCR dibandingkan kedua metode konvensional yaitu:
1. Sensitivitas metode PCR tidak dipengaruhi oleh status HIV pasien. Sementara itu, sensitivitas metode konvensional (ZN dan rontgen toraks) sangat dipengaruhi oleh status HIV Pasien. Hal ini dibuktikan pada studi ini di mana sensistivitas PCR untuk pasien TB HIV positif (n=36) adalah 89%, dibandingkan dengan 95% pada pasien TB HIV negatif (n=79). Sementara itu sensitivitas untuk pemeriksaan ZN lebih rendah secara signifikan untuk pasien TB HIV positif (44%) daripada untuk pasien TB HIV negatif (63%).
2. Sensitivitas ZN sangat bergantung pada tipe dan kualitas sampel sputum, dengan sensitivitas yang tertinggi pada sputum pagi hari. Sementara itu sensitivitas PCR tidak bergantung pada waktu pengambilan sputum.
untuk positivitas pemeriksaan mikrobiologis sputum menjadi problem tersendiri. Metode diagnostik PCR, salah satunya otnPCR(one tube nested PCR) dengan menggunakan sampel urin penderita dapat menjadi alternatif sarana diagnosis penunjang yang nyaman karena tidak invasif dengan sensitivitas dan spesifisitas yang cukup baik, namun tidak serta-merta dapat menjadi baku emas pemeriksaan untuk konfirmasi kasus TB baru.
Kasus TB anak merupakan marker dari kualitas sistem pelayanan kesehatan suatu Negara, yang merupakan indikasi bahwa kasus-kasus TB infeksius dewasa tidak berhasil dideteksi dini, sehingga menimbulkan penyebaran penyakit TB pada anak.
Sekitar sepertiga kasus TB aktif dewasa terdiagnosis setelah konfirmasi penyakit TB anak dengan riwayat kontak. Hal ini menandakan bahwa terdapat cukup besar jumlah kasus TB aktif dewasa yang dapat nampak asimtompmatis untuk periode waktu yang lama dan menjadi sumber penularan termasuk pada anak.
Metode konvensional untuk penegakan diagnosis TB pada anak memiliki kesulitan tersendiri, khususnya pada pemeriksaan mikroskopis ZN yang menjadi standar diagnosis. Penggunaan metode PCR, khususnya pada kasus sulit maupun paucibasiller, memungkinkan sebagai suatu metode diagnosis yang kurang traumatis, dapat dilakukan dalam setting rawat jalan, di mana alternatif lainnya seperti lavase gastrik (untuk memperoleh sampel pemeriksaan mikroskopis) memerlukan rawat inap dan sedasi.
Walaupun sensitivitas nPCR untuk mendiagnosis TB pada individu di bawah 15 tahun menggunakan spesimen darah perifer bernilai rendah (26.15%), namun spesifisitasnya sangat memuaskan (92.73%). Hal ini menjadi penting untuk menegakkan diagnosis bagi kelompok pasien dengan kecurigaan TB yang belum terdiagnosis, maupun pasien suspek TB yang telah menjalani terapi tanpa konfirmasi diagnosis penyakit TBnya.
pemeriksaan fisik yang seksama, dan pemeriksaan penunjang yang penting seperti uji tuberkulin dan foto radiologik untuk menegakkan diagnosis TB pada anak. Sehingga walaupun spesifisitas nPCR baik, nPCR saja tak dapat digunakan menjadi metode eksklusi pada grup pasien anak dengan TB paucibasiller.
3.2 KESIMPULAN
Metode PCR dapat dipertimbangkan sebagai alternatif metode penegakan diagnostik TB, dilihat dari beberapa keunggulannya yaitu sensitivitas dan spesivisitas yang relatif lebih baik dibandingkan metode diagnostik TB konvensional. Namun, studi-studi tentang efektivitas biaya dan operasional masih sangat diperlukan untuk memperkuat data-data yang dapat mendukung aplikasi metode PCR khususnya di Negara-Negara dengan beban penyakit TB yang tinggi disebabkan biaya dan keterampilan petugas serta standardisasi metode.
Sebagai catatan, sensitivitas dan spesifisitas penggunaan metode PCR untuk diagnosis TB pada anak umumnya tidak sebaik pada penggunaannya pada pasien TB dewasa. Hal ini disebabkan oleh,
1. Kesulitan pengambilan sampel yang ideal pada anak, yaitu pengambilan spesimen sputum, yang lebih sulit daripada pada pasien TB dewasa.
2. Berbeda pada tampilan klinis TB pada pasien dewasa yang umumnya pulmoner, tampilan klinis TB pada anak didominasi TB ekstrapulmoner. Hal ini berdampak pada keputusan pemilihan spesimen yang ideal untuk pemeriksaan mikrobiologis, maupun dengan metode PCR.
Sementara pada penderita TB-HIV, beberapa kepustakaan menyebutkan bahwa yield untuk pemeriksaan mikrobiologis pengecatan sputum BTA memang rendah. Selain itu gambaran radiologis maupun gejala klinis untuk populasi penderita ini sering tidak khas, di samping diagnosis baku emas TB yaitu kultur yang membutuhkan waktu lama, 3-6 minggu sedangkan penurunan kondisi penderita TB-HIV khususnya TB milier(blood stream) berlangsung cepat dan angka mortalitasnya tinggi. Pemeriksaan PCR dapat menjadi sarana diagnosis penunjang yang baik dalam membantu menegakkan diagnosis TB pada penderita TB-HIV.
Costa Lima JFD, Montenegro LML, Montenegro RDA, Cabral MML, et al. 2005. Performance of Nested PCR in The Specific Detection of Mycobacterium
tuberculosis Complex in Blood Samples of Pediatric Patients. J. bras. Pneumol. Vol. 35. No. 7, Sao Paulo, Brazil. 2009. (diunduh dari:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-37132009000700011&lng=en&nrm=iso&tlng=en pada 3 oktober 2015,16.53)
IPH. 2015. Faktor lingkungan pada penularan TB paru. Indonesian Public Health. (diunduh dari:
http://www.indonesian-publichealth.com/2015/08/faktor-lingkungan-pada-penularan-tbc.html pada 4 Oktober 2015,16.08)
Kaswandani N, Setyanto DB, Rahajoe NN. 2007. Akurasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dibandingkan uji tuberkulin untuk diagnosis tuberkulosis pada anak. Sari Pediatri, Vol. 12, No. 1, Juni 2010.(diunduh dari:
http://saripediatri.idai.or.id/pdfile/12-1-8.pdf pada 4 Oktober 2015,16.08)
Kemenkes RI. 2011. Pedoman Nasional Pengendalian Tuberkulosis. Jakarta (diunduh dari:
https://id.scribd.com/doc/161273999/DEPKES-RI-NEW-Pedoman-Nasional-Penanggulangan-TBC-2011 pada 6 Oktober 2015,16.08)
Masniari L, Priyanti ZS, Aditama TY. 2007. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Kesembuhan Penderita TB Paru. Departemen Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FKUI – RSUP Persahabatan, Jakarta (diunduh dari:
http://www.klikpdpi.com/jurnal-warta/jri-07-07/dr.linda.html pada 5 oktober 2015,
15.41)
Ndugga KL, Cleff MV, Juma E, Kimwomi J, et al. 2004. Comparison of PCR with the Routine Procedure for Diagnosis of Tuberculosis in a Population with High Prevalences of Tuberculosis and Human Immunodeficiency Virus. J. Clin. Microbiol. Vol. 42, No. 3, Maret 2004. (diunduh dari:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC356878/ pada 3 Oktober
2015,16.42)
Torrea G,Van de Perre P, Ouedraogo M, Zougba A, et al. 2005. PCR-based Detection of The Mycobacterium tuberculosis complex in Urine of HIV-infected and uninfected pulmonary and extrapulmonary tuberculosis patients in Burkina Faso. Journal of Medical Microbiology (2005), 54, 39–44. (diunduh dari:
http://www.researchgate.net/profile/Leonardo_Sechi2/publication/8137270_PCR- based_detection_of_the_Mycobacterium_tuberculosis_complex_in_urine_of_HIV-infected_and_uninfected_pulmonary_and_extrapulmonary_tuberculosis_patients_i
n_Burkina_Faso/links/00463525171b85f12b000000.pdf pada 3 Oktober
