PROSEDUR PERBANYAKAN GEN PT2 MENGGUNAKAN

(1)

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS PADJADJARAN

DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI

PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN

BIOINFORMATIKA

Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874

e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id

PROSEDUR PERBANYAKAN GEN

PT2

MENGGUNAKAN METODE PCR

DAN KARAKTERISASINYA

A. PCR

Alat : Eppendorf mastercycler gradient, Micropipette eppendorf 0,1-2,5 µL; 0,5-10 µL; dan 2-20 µL, rak tabung.

Bahan : Gen PT2-pJET1.2,Gen PT2, Primer forward EcoRI, Primer reverse

PT2-SacII, Nuclease Free Water, DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), tabung mikro 0,6 mL, tip putih (0,1-10 µL) dan tip kuning (10-200 µL).

Prosedur:

1. Templat untuk reaksi PCR adalah 1 µL gen PT2-pJET1.2 dan 1 µL gen PT2 (sebagai kontrol positif)

2. Masukkan 12,5 µL DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) kedalam tabung mikro 0,6 mL, tambahkan Primer Forward PT2-EcoRI 1 µL, tambahkan Primer Reverse PT2-SacII 1 µL, tambahkan 9,5 µL Nuclease Free Water serta tambahkan 1 µL gen PT2-pJET1.2 (sebagai templat DNA sampel) atau 1 µL gen PT2 (sebagai templat DNA kontrol positif)

Catatan:

 Pada saat pemipetan semua reagen disimpan di atas es agar berada dalam keadaan dingin.

 Enzim harus disimpan pada -20o_{C dan hanya dikeluarkan dari freezer sesaat}

sebelum digunakan

 Ketika menambahkan reagen harus selalu dilakukan resuspensi.

(2)

PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN

BIOINFORMATIKA

3. Set-up mesin PCR atau siapkan program file PCR untuk 25 siklus dengan masing-masing siklus terdiri atas:

Tahapan Suhu Waktu Jumlah_siklus

Denaturasi awal 95°C 2 menit 1

Denaturasi 95°C 1 menit

25 siklus

Annealing 55,5°C 1 menit

Elongasi 72°C 1 menit

Elongasi akhir 72°C 10 menit 1

4. Letakkan tabung mikro di dalam mesin PCR kemudian start reaksi PCR

5. Setelah selesai (tahap HOLD 4°C), klik enter. Saat suhu mencapai 25°C, sampel dapat diambil dan alat PCR dimatikan.

B. Elektroforesis Agarosa

Alat : Elektroforesis horizontal mini subTM_{DNA electrophoresis cell (Biorad),}

Labu erlenmeyer 250 mL, Micropipette eppendorf 0,1-2,5 uL; 0,5-10 uL; dan 2-20 uL, UV-transiluminator

Bahan : Agarosa, bufer TAE 1x (Tris-asetat 0,04 M, EDTA 0,001 M pH 8,0),

Loading buffer (Sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8,0, bromfenol biru 0,1% pH 8,0), Marka DNA 1 kb, GelRed.

Prosedur:

(3)

PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN

BIOINFORMATIKA

1. Timbang 0,35 gram agarosa dalam labu erlenmeyer 250 mL, tambahkan 35 mL bufer TAE 1x.

2. Panaskan larutan tersebut hingga semua agarosa larut, lalu dinginkan hingga suhu larutan mencapai 50-60o_C.

3. Siapkan gel tray dengan memasang penyumbat dan pembentuk sumur gel. 4. Tuang larutan gel ke dalam gel tray, tunggu sampai membeku (sekitar 1 jam). 5. Ambil pembentuk sumur dan penyumbat gel dengan hati-hati. Masukkan gel tray

ke dalam electrophoresis chamber yang telah berisi bufer TAE 1x (sampai gel terendam).

6. Campurkan 5 µL produk PCR dengan 1 µL GelRed kedalam tabung mikro 0,6 mL.

7. Untuk pembuatan marka, campurkan 1 µL DNA 1 kb, 1 µL loading buffer, 4 µL Nuclease Free Water, dan 1 uL GelRed ke dalam tabung mikro 0,6 mL.

8. Pasang penutup chamber, atur alat pada tegangan 80 volt selama 45 menit. 9. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV-transiluminator.

Catatan:

 Sinar UV dapat merusak mata dan menyebabkan kanker kulit, pemakaian transiluminator harus dalam keadaan tertutup kaca dan menggunakan kacamata khusus.