HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil Hasil Karakterisasi Marka SSRSaat ini marka SSR (penanda mikrosatelit) telah digunakan secara luas dalam analisis yang berbasis molekuler. Marka tersebut merupakan salah satu penciri genetik yang ideal untuk analisa genom karena jumlahnya yang cukup banyak dalam genom (Hoetzel 1998), selain itu marka SSR bersifat kodominan dan dapat mendeteksi variasi alel yang tinggi (Wu & Tanskley 1993; Panaud et al 1996). Marka SSR telah banyak digunakan pada berbagai studi keragaman genetik (Blair et al. 1999), identifikasi varietas tanaman (Moeljopawiro 2007; Pabedon et al. 2005 ) dan uji kemurnian benih hibrida (Tamilkumar et al 2009; Liu et al 2007). Informasi detail dari marka SSR yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Table 3.
Tabel 3 Nama lokus, sekuen basa berulang, kisaran basa dan jumlah alel dari 16 marka SSR yang digunakan
Kode Lokus Sekuen basa berulang Kisaran basa (bp) Jumlah alel Total Polimorfis RM104 (GA)9 222 2 0 RM154 (GA)21 183 7 0 RM164 (GT)16TT(GT)4 246 3 2 RM206 (CT)21 147 6 6 RM209 (CT)18 134 - - RM215 (CT)16 148 2 0 RM219 (CT)17 202 1 0 RM250 (CT)17 153 1 0 RM263 (CT)34 199 3 2 RM276 (AG)8A3(GA)33 149 3 3 RM335 (CTT)25 104 4 3 RM346 (CTT)18 175 2 2 RM464 (AT)21 262 2 0 RM475 (TATC)8 235 1 0 RM551 (AG)18 192 - - RM570 (AG)15 208 4 4 Jumlah 41 22 Sumber : http://www.gramene.org
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 16 pasang primer yang digunakan dua primer tidak menghasilkan pita pada gel elektroforesis. Tidak munculnya pita dapat terjadi akibat optimasi yang tidak sesuai sehingga tidak terjadi amplifikasi saat proses PCR. Sebanyak total 41 alel dihasilkan dari 14 primer yang teramplifikasi, dengan rata-rata jumlah alel 2.92 per lokus. Persentase lokus polimorfik adalah 50% dimana terdapat 7 primer yang bersifat polimorfis dengan jumlah alel yang polimorfis sebanyak 22. Rata-rata jumlah alel per lokus polimorfik adalah 5.86.
Tingkat Polimorfisme (Polymorphism Information Content, PIC) Galur Tetua Tingkat polimorfisme (PIC) diperlukan untuk memilih marka yang dapat membedakan antar galur/tetua yang digunakan. Kuantifikasi PIC adalah jumlah alel yang dapat dihasilkan oleh suatu marka dan frekuensi dari tiap alel dalam set genotipe yang diuji. Nilai polimorfisme ditentukan oleh frekuensi kemunculan alelnya (DeVicente & Fulton 2003). Marka yang menghasilkan alel lebih sedikit memiliki kemampuan yang lebih kecil untuk membedakan sampel yang diuji. Nilai PIC yang tinggi ditunjukan pada marka yang menghasilkan banyak alel. Nilai PIC merupakan standar yang baik untuk mengevaluasi marka genetik (Emrani et al 2011).
Marka polimorfis dan informasi tingkat polimorfisme dari marka yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai PIC tertinggi dari marka-marka yang polimorfis ditunjukan oleh RM206 (0.783) dan terendah adalah RM346 (0.195). Nilai PIC diklasifikasikan menjadi tiga kelas yaitu PIC>0.5 adalah sangat informatif, 0.25>PIC>0.5 termasuk sedang dan PIC<0.25 memiliki nilai informatif yang rendah (Botstein et al. 1980). Lima marka termasuk dalam kategori sangat informatif (PIC>0.5), satu marka memiliki nilai PIC sedang yaitu RM263 dan satu marka memiliki tingkat polimorfisme rendah yaitu RM346 (0,195). Nilai PIC rata-rata dari tujuh marka untuk delapan galur tetua adalah 0.528. Dari keseluruhan 16 marka yang digunakan tujuh marka monomorfis dan dua marka tidak menunjukkan hasil amplifikasi (Tabel 3). Marka yang monomorfis memiliki nilai PIC=0.
Tabel 4 Marka SSR polimorfis dan tingkat polimorfisme (PIC)
Kode Lokus Jumlah alel
Tingkat polimorfisme (PIC) Total Polimorfis RM164 3 2 0.555 RM206 6 6 0.783 RM263 3 2 0.455 RM276 3 3 0.505 RM335 4 3 0.675 RM346 2 2 0.195 RM570 4 4 0.530 Rata-rata 0.528
Hasil karakterisasi berdasarkan marka SSR, menunjukan koefisien kemiripan genetik dari persilangan galur tetua hibrida berkisar antara 0.56 – 0.88 atau pada jarak genetik 0.12 - 0.44 (Tabel 5). Semakin besar nilai koefisien kemiripan genetik antara dua galur berarti semakin besar kemiripan genetiknya. Tabel 5 Jarak genetik galur tetua dari lima varietas hibrida
Varietas
Hibrida Tetua Kemiripan genetik Jarak genetik Hipa 6 IR 62829 A x B 8094 F 0.56 0.44 Hipa 7 IR 58025 A x IR 40750 0.80 0.20 Hipa 8 IR 58025 A x BP 51-1 0.88 0.12 Hipa 9 IR 58025 A x S4325 A 0.72 0.28
Hipa 10 IR 68897 A x Bio-9 0.76 0.24
Analisis kelompok (cluster analysis) terhadap galur tetua menggunakan tujuh marka SSR polimorfis menghasilkan dendogram UPGMA dari delapan galur tetua dari lima varietas hibrida (Gambar 3). Kedelapan tetua yang dianalisis dapat dibedakan dengan jelas berdasarkan marka mikrosatelit. Pada tingkat kesamaan 69% terbentuk tiga kelompok, yaitu kelompok-1 terdiri dari IR62829A, kelompok-2 terdiri dari B8094F dan Bio-9 dan kelompok-3 terdiri dari IR58025A, BP51-1, IR68897A, IR40750 dan S4325A.
Gamb T kelom Galur restore kelom restore adalah sama. geneti Jantan Ke pada diman tetuan menin 1998). hampi untuk Hipa 6 denga bar 3 Dendo kemirip Tetua dari pok yang be mandul ja er B8094F y pok yang b er Bio-9 pa h 0.24. Bebe Tetua Hipa k terdekat d n IR58025A eunggulan karakter pot a turunan nya (Pannuth
gkat bila jar . Potensi da r sama yaitu rata-rata ha 6 tidak mem an tetua Hipa ogram analis pan genetik Hipa 6 me erbeda berd antan IR628 yang berada erbeda dim ada kelompo erapa tetua d a 7 dan Hi ditunjukan p berada kelo padi hibrida tensi hasil. pertama su hurai et al. 1 rak genetik d n rata-rata h u berkisar 9 asil (Lampira miliki potensi a 8 yang me sis UPGMA dengan men emiliki nilai asarkan den 829A berad a pada kelom ana GMJ IR ok-2. Jarak dari hibrida pa 9 memil ada tetua H ompok yang a berupa h Heterosis s uatu persilan 984; Yuan e dari kedua t hasil dari hib
.4 – 11.4 t/h an 5 – 9). i dan rata-ra emiliki nilai ja delapan tet nggunakan t jarak gene ndogram ke a pada ke mpok-2. Tetu R68897A be genetik ant yang diuji b liki jarak ge Hipa 8 yaitu sama denga heterosis, di ering diistila ngan lebih et al. 2003). tetua lebih ja brida yang d ha untuk pot Nilai jarak ata hasil yan arak genetik ua hibrida p tujuh marka etik 0.44 da miripan gen elompok-1 b ua Hipa 10 ju erada pada tara tetua H erada dalam enetik 0.20 sebesar 0.1 an restorer B harapkan m ahkan sebag unggul dib Secara teor auh (Melchin digunakan m tensi hasil d genetik tert ng lebih ting terendah padi berdasa SSR polimo an berada netik (Gamba berbeda de uga berada kelompok-3 Hipa 10 ters m kelompok dan 0.28. J 2. Galur Ma BP51-1. muncul teru
gai vigor hib andingkan ri, heterosis nnger & Gu memiliki nilai an 7.6 – 8.1 tinggi yaitu ggi dibandin arkan orfis. pada ar 3). ngan pada 3 dan sebut yang Jarak andul tama brida, galur akan mber yang 1 t/ha tetua gkan
Jarak genetik yang lebih dekat belum tentu menghasilkan hasil persilangan yang lebih tinggi. Hasil penelitian Zainal & Amirhusin (2005) pada galur-galur tetua padi hibrida menunjukan bahwa jarak genetik yang lebih dekat belum tentu menghasilkan turunan dengan tingkat produktivitas yang lebih tinggi. Efek heterosis pada padi juga dikendalikan oleh banyak gen, sehingga heterosis tidak cukup diterangkan hanya melalui jarak genetik. Nilai jarak genetik belum secara tegas memprediksi bobot biji, nilai daya gabung khusus dan heterosis (Pabedon
et al. 2009)
Penentuan jarak genetik antar tetua juga dipengaruhi oleh jenis dan jumlah marka genetik yang digunakan. Semakin banyak jumlah populasi dan marka yang diuji maka hasil yang didapatkan akan semakin akurat (Tsegaye et al. 1996). Pada penelitian kali ini pengelompokan keseragaman genetik hanya menggambarkan jarak genetik dari delapan tetua hibrida dengan tujuh marka SSR polimorfis. Bila digunakan marka yang lebih banyak dan berbeda dapat saja dihasilkan pengelompokan genetik yang berbeda.
Marka SSR Spesifik yang Dapat Membedakan Tetua Hibrida
Sidik jari DNA berdasarkan PCR telah menjadi metode yang sering digunakan untuk karakterisasi plasma nutfah, studi penyebaran dan uji kemurnian varietas. Sejumlah marka DNA saat ini telah tersedia untuk dapat digunakan sebagai sidik jari, maupun untuk marker assisted selection (MAS). Marka mikrosatelit merupakan marka yang sering digunakan karena melimpah, bersifat kodominan dan selain itu juga mudah digunakan ( McCouch et al. 2002). Melalui penelitian ini telah didapatkan beberapa marka SSR yang memiliki potensi untuk membedakan antara tetua padi hibrida (Tabel 6).
Tabel 6 Marka SSR polimorfis untuk tetua hibrida yang digunakan Varietas
Hibrida Tetua Marka SSR polimorfis
Hipa 6 IR 62829 A x B 8094 F RM 346, RM 335, RM 570, RM 206 Hipa 7 IR 58025 A x IR 40750 RM 206, RM 335
Hipa 8 IR 58025 A x BP 51-1 RM 263, RM 206 Hipa 9 IR 58025 A x S4325 A RM 276, RM 335
Berdasarkan hasil elektroforesis, diperoleh tujuh marka SSR polimorfis dari keseluruhan 16 marka SSR yang digunakan. Enam marka dapat digunakan untuk membedakan galur tetua dari lima varietas padi hibrida yang dipelajari. Marka SSR RM164 merupakan marka polimorfis tetapi tidak dapat digunakan untuk membedakan galur tetua dari varietas padi hibrida yang diuji, sehingga walau marka tersebut memiliki nilai PIC yang cukup tinggi (0.555) tetapi tidak polimorfis untuk untuk dapat membedakan galur mandul jantan dengan restorernya (Gambar 4).
Gambar 4 Penampilan pita DNA menggunakan marka SSR RM164
Marka SSR yang dapat menghasilkan pita polimorfis pada galur tetua hibrida, dapat digunakan untuk mengidentifikasi tetua hibrida dan hibrida turunanya. Marka-marka polimorfis tersebut dapat digunakan untuk uji kemurnian benih padi hibrida. Beberapa marka polimorfis untuk identifikasi Hipa 6, Hipa 7, Hipa 8, Hipa 9 dan Hipa 10 dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6.
(a) (b)
(c) (d) Gambar 5 Penampilan pita polimorfis dari tetua hibrida untuk marka SSR
(a) (b) Gambar 6 Penampilan pita polimorfis dari tetua hibrida untuk marka SSR
RM263 (a) dan RM276 (b)
Sterilitas Galur Mandul Jantan
Adanya campuran pada benih hibrida akan dapat menurunkan produksi. Setiap adanya campuran sebesar 1 % pada benih galur mandul jantan akan dapat mengakibatkan penurunan produksi sebesar 100 kg/ha (Mao et al.1996). Peraturan perbenihan di India mensyaratkan kemurnian benih untuk padi hibrida adalah 98% (Verma 1996), sedangkan di China tingkat kemurnian benih untuk padi hibrida yang diperbolehkan minimal adalah 96 % (Yan 2000). Di Indonesia, sertifikasi benih hibrida mensyaratkan kemurnian benih 98 % dan campuran varietas lain yang diperbolehkan maksimal 0.5 % (Direktorat Perbenihan 2009). Untuk dapat menjamin kemurnian dari benih hibrida yang dihasilkan diperlukan tingkat kemurnian dari tetua hibrida yang cukup tinggi, tingkat kemurnian yang sebaiknya dimiliki oleh galur tetua adalah sekitar 99 % (Yashitola et al 2004; Direktorat Perbenihan 2009).
Salah satu sebab adanya campuran yang paling umum selama proses produksi benih hibrida adalah tidak murninya galur pelestari saat memproduksi galur mandul jantan. Sebelum memasuki stadia berbunga akan sangat sulit membedakan antara galur pelestari dengan galur mandul jantannya karena keduanya merupakan isonuclear sehingga memiliki morfologi yang sangat mirip. Penyebab lain adanya campuran pada galur mandul jantan dapat disebabkan
oleh terjadinya selfing yang diakibatkan dari tetua galur mandul jantan yang fertil. Kontaminasi pada galur pelestari atau mandul jantan dapat berakibat pada penurunan hasil dan buruknya pertanaman di lapang.
Kemungkinan adanya campuran pada proses produksi benih padi hibrida, diminimalkan dengan melakukan isolasi dan rouging mulai dari produksi tetua hingga produksi benih F1 hibridanya. Uji sterilitas malai dilakukan untuk melihat kemungkinan terjadinya kontaminasi yang diakibatkan dari tetua mandul jantan yang tidak steril. Malai galur mandul jantan dari hibrida yang diuji disungkup dengan menggunakan kantung kertas dan diamati tingkat sterilitasnya (Tabel 7). Tingkat sterilitas malai dibagi menjadi beberapa tingkatan yaitu steril seluruhnya (100 %), tingkat sterilitas tinggi (99,0-99,9 %), steril (95,0-98,9), parsial steril (70,0-94,9%) dan parsial fertil s/d fertil (<70%) (IRRI 2011). Rata-rata persentase sterilitas malai dari ketiga galur mandul jantan masih termasuk dalam kategori steril karena masih diatas 95 %. Galur mandul jantan dikategorikan sebagal galur yang steril bila memiliki tingkat sterilitas lebih besar 95%, bila tingkat sterilitasnya lebih kecil dari itu maka dianggap sebagai galur yang tidak stabil.
Tabel 7 Status sterilitas malai beberapa galur mandul jantan padi Galur Mandul Jantan Jumlah sampel Sterilitas malai (%) Rata-rata* Kisaran IR58025A 75 98.7 ± 1,59 86.3 – 100,0 IR62829A 75 99.8 ± 0,64 95.9 – 100,0 IR68897A 75 99.9 ± 0,37 97.5 – 100,0 Keterangan : *) x ± sd
Gabah isi masih ditemukan pada beberapa malai dari tiap mandul jantan yang diuji. Gabah isi menunjukkan bahwa peluang terjadinya penyerbukan sendiri masih ada. Tanaman digolongakan sebagai tanaman fertil bila masih ditemukan adanya gabah isi pada malai yang dihasilkan. Pada populasi tanaman yang diamati, galur mandul jantan IR58025A , IR62829A dan IR68897A menunjukkan tanaman fertil berturut-turut sebesar 4%, 8%, 2.7% (Tabel 8).
Persentase tanaman fertil tertinggi ditunjukan oleh galur mandul jantan IR62829A yang merupakan tetua GMJ untuk Hipa 6 dan terendah pada IR68897A (GMJ untuk Hipa 10). Tingkat fertilitas dari galur mandul jantan,selain dilihat dari populasi juga diamati pada tingkat individu malai. Persentase gabah isi per malai dihitung hanya pada malai yang fertil. Pada IR58025A nilai rata-rata gabah isi per malai masih tinggi, yaitu 5.5% dan masih terdapat individu tanaman
yang menghasilkan gabah isi per malai hingga 13.6 %. Untuk IR62829A dan IR68897A rata-rata persentase gabah isi per malai yang dihasilkan cukup rendah, yaitu masih di bawah 3%. Kisaran gabah isi per malai nya pun masih dibawah IR58025A .
Tabel 8 Rata-rata persentase fertilitas beberapa galur mandul jantan padi. Galur Mandul Jantan Tanaman Fertil (%) Gabah isi/malai* (%) Kisaran gabah isi/malai* (%) IR58025A 4.0 5.5 0.6-13.6 IR62829A 8.0 2.1 1.1- 4.1 IR68897A 2.7 2.3 2.1- 2.4
Ket : *)persentase gabah isi hanya dihitung dari malai fertil yang ditemukan
Tanaman dianggap sebagai tanaman fertil bila terdapat gabah isi pada malai yang dihasilkan. Galur mandul jantan yang digunakan dalam produksi benih padi hibrida seharusnya menghasilkan 100% malai yang mandul pada satu rumpun tanaman. Adanya gabah isi berpotensi menghasilkan gabah isi pada galur mandul jantan generasi berikutnya dan menyebabkan kontaminasi pada proses produksi benih F1 hibrida. Dalam kegiatan produksi benih, kegiatan pemurnian perlu dilakukan untuk mendapatkan galur mandul jantan yang baik dimana tingkat sterilitasnya mencapai 100%. Pada kegiatan pemurnian dilakukan
quality control pada galur mandul jantan. Proses quality control yang dimaksud
adalah dilakukan penyungkupan minimal pada dua malai kemudian diamati gabah isi per malainya. Individu tanaman yang masih menghasilkan gabah isi, tidak digunakan untuk kegiatan produksi benih. Untuk mempertahankan kemurnian dari galur mandul jantan, metode terbaik yang digunakan adalah dengan melakukan silang balik berkelanjutan yang dilakukan secara manual (Youssef 2011).
Uji Kemurnian Genetik Benih Padi Hibrida
Menjaga kebenaran dan keseragaman varietas merupakan hal yang sangat penting untuk mempertahankan mutu padi hibrida, oleh karena itu uji kemurnian benih sangat dibutuhkan sebelum benih tersebut didistribusikan dan ditanam secara luas. Identifikasi varietas menjadi sangat penting bila dikaitkan dengan perlindungan varietas tanaman dan hak kekayaan intelektual. Teknologi marka molekuler dapat menjadi dukungan yang kuat bagi pemulia dan
perusahaan penghasil varietas karena dapat menyediakan identifikasi atau bukti yang diakui secara hukum. Oleh karena itu diperlukan marka-marka yang dapat mengidentifikasi kebenaran dan kemurnian dari suatu varietas. Identifikasi kebenaran suatu genotipe tanaman dengan menggunakan marka yang tidak terpaut merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk menilai kemurnian benih hibrida dan satu penanda yang polimorfik sudah cukup untuk pengujian kemurnian benih (Yashitola 2002)
Sifat marka SSR yang polimorfis dapat mendeteksi individu yang heterozigot, karena sifatnya itu maka marka SSR dapat digunakan untuk pengujian kemurnian genetik benih padi hibrida. Saat alel polimorfis dapat terditeksi antara tetua hibrida yaitu galur mandul jantan (A) dan restorernya (R), maka diharapkan kedua alel tersebut akan muncul pada pada individu F1 hibridanya. Pada penelitian ini uji kemurnian benih dilakukan menggunakan dua hibrida yaitu Hipa 6 dan Hipa 7. Pengujian dilakukan pada sampel individu tanaman muda yang diambil dari petak pertanaman di lapang. Marka RM346 digunakan untuk uji kemurnian genetik Hipa 6 dan RM206 untuk Hipa 7. Marka tersebut digunakan karena sifatnya yang polimorfis untuk tetua hibrida Hipa 6 dan Hipa 7.
Terdapat beberapa marka yang polimorfis yang dapat membedakan galur tetua Hipa 6, dan untuk uji kemurnian benih dipilih marka RM346. Pemilihan marka RM346 dikarenakan polimorfisme cukup jelas terlihat pada tetua (antara GMJ dan restorer-nya) (Gambar 5a) dibandingkan marka yang lain (RM570 dan RM206). Marka tersebut menghasilkan satu pita pada masing-masing tetua sehingga akan lebih mudah membedakannya pada uji kemurnian benih. Marka RM 206 dipilih untuk uji kemurnian benih Hipa 7, karena marka tersebut merupakan marka yang polimorfis dan merupakan marka yang spesifik untuk Hipa 7. Marka RM335 tidak digunakan untuk uji kemurnian benih karena walaupun polimorfis antara tetua Hipa 6 dan Hipa 7, tetapi marka tersebut tidak dapat membedakan antara Hipa 6 dan Hipa 7. Galur mandul jantan dan restorer dari Hipa 6 dan Hipa 7 teramplifikasi pada jarak yang sama.
Hasil pengujian molekuler dengan menggunakan marka RM346 pada 40 individu hibrida Hipa 6 menunjukkan 33 individu tanaman menghasilkan pita heterozigot dan tujuh individu tanaman menghasilkan pita homozigot (Gambar 7 dan 8). Individu yang memiliki pita homozigot adalah individu nomor 2, 3, 12,19, 21, 33 dan 38. Individu-individu tanaman tersebut merupakan campuran karena
tidak individ yang i dan lim yaitu p E berdas Gamb L 1 2 Gam memiliki ke du tanaman dentik deng ma tanaman pada individu Evaluasi k sarkan kara L 1 2 2 L 20 21 22 bar 7 Hasil u pada m 3 4 5 6 7 8 mbar 8 Has pad edua pita ya yang meng gan tetua ga n memiliki pi u nomor 3, 1 kemurnian akter morfol 3 4 5 6 2 23 24 25 2 uji kemurnian media elektr 9 101112 13 141
sil uji kemur da media ele ang berasal hasilkan pita lur mandul j ta identik de 12, 19, 21 da genetik di ogi. Hasil p 6 7 8 9 1 26 27 28 29 3 n benih Hipa roforesis gel 15161718 192021 rnian benih ektroforesis g l dari dua t a homozigot antan (A) ya engan tetua an 33. lapang pengamatan 10 11 12 12 30 31 32 33 3 a 6 dengan m agarose 3 % 12223 2425 2627 Hipa 6 den gel polyakril tetua pemb t, dua tanam aitu individu jantan atau (grow-out n morfologi 13 14 15 16 34 35 36 37 menggunaka % 2829 30 313233 ngan mengg amid entuknya. T man memilik nomor 2 da restorer-ny test) dilak mengidentif 6 17 18 19 R 38 39 40 A an RM346 343536 3738 394 gunakan RM Tujuh ki pita an 38 a (R) kukan fikasi 40 A R M346
campuran varietas lain pada tanaman nomor 1, 2, 3, 12, 19 ,37 dan 38 (Tabel 9). Terdapat perbedaan antara hasil uji laboratorium dengan marka SSR dengan identifikasi varietas campuran berdasarkan pengamatan morfologi di lapang. Tabel 9 Identifikasi tanaman campuran pada uji kemurnian genetik menggunakan
SSR dan grow out test pada Hipa 6
Uji Kemurnian Jumlah sampel Tanaman campuran (%) Nomor sampel SSR 40 17,5 2, 3, 12, 19, 21, 33, 38
Grow out test 40 17,5 1, 2, 3, 12, 19, 37, 38
Persentase tanaman campuran pengujian SSR dengan grow out test memiliki nilai yang sama yaitu 17,5%. Sebagian besar individu yang dikenali sebagai campuran, sama antara SSR dan grow out test. Individu tanaman tersebut adalah sampel nomor 2, 3, 12, 19 dan 38. Hasil berbeda didapatkan pada beberapa nomor sampel yaitu pada tanaman nomor 1, 37, 21 dan 33.
Individu nomor 1 dan 37 (Gambar 9) yang diidentifikasi sebagai campuran di lapang ternyata bukan merupakan campuran pada hasil pengujian dengan marka SSR RM346. Individu tersebut memiliki dua pita polimorfis yang menandakan tetua Hipa 6 (Gambar 7 dan 8). Pada pengamatan grow out test individu 1 dan 37 dikategorikan sebagai tanaman campuran karena memiliki jumlah anakan yang lebih sedikit, tinggi tanaman yang lebih rendah dan warna daun yag sedikit lebih gelap dibandingkan tanaman Hipa 6. Sedikitnya jumlah anakan menyebabkan tampilan tanaman terlihat lebih kompak sehingga tanaman dianggap sebagai campuran. Rincian mengenai penyimpangan karekter pada tanaman-tanaman yang dikategorikan sebagai campuran dapat dilihat pada Tabel 10
Individu nomor 21 dan 33 menunjukan hal sebaliknya. Tanaman tersebut di lapang tidak dikategorikan sebagai campuran, ternyata tidak memiliki dua pita yang merupakan identitas dari tetua hibrida. Tanaman nomor 21 dan 33 yang merupakan campuran varietas lain, memiliki penampilan morfologi mirip dengan Hipa 6. Pada uji SSR individu tanaman nomor 21 dan 33 memiliki pita yang identik dengan restorer Hipa 6, tetapi belum dapat dipastikan bahwa tanaman tersebut adalah restorer. Marka RM346 merupakan marka yang polimorfis untuk tetua Hipa 6 tetapi marka tersebut monomorfis dengan galur tetua lain yang
digunakan pada penelitian ini. Sehingga dapat saja tanaman nomor 21 dan 33 yang menurut hasil SSR pitanya identik dengan restorer Hipa 6 adalah tanaman varietas lain yang pitanya tidak dapat dibedakan dengan restorer bila menggunakan marka RM346.
Tabel 10 Penyimpangan karakter pada tanaman sampel yang dinyatakan sebagai campuran pada grow out test Hipa 6
Nomor
sampel Penyimpangan karakter
1 Tanaman lebih pendek, anakan lebih sedikit, tanaman lebih kompak
2 Terdapat malai hampa, lebih rentan terhadap hama
3 Warna merah pada ujung gabah, tanaman sedikit lebih menyebar 12 Umur berbeda lebih dalam, warna daun lebih tua
19 Tanaman lebih tinggi, anakan sedikit, warna daun lebih muda, umur lebih dalam
37 Tanaman lebih pendek, anakan lebih sedikit, tanaman lebih kompak
38 Tanaman lebih pendek dan kompak, lebih rentan terhadap hama dan penyakit
(a) (b)
Beberapa tanaman lain memperlihatkan penyimpangan karakter yang cukup jelas seperti pada tanaman nomor 19. Tanaman tersebut memiliki jumlah
Gambar 9 Identifikasi tanaman nomor 1 dan Hipa 6 (a); Tanaman nomor 37 dan Hipa 6 (b). Tanaman nomor 1 dan 37 yang diidentifikasi sebagai campuran ternyata bukan campuran menurut uji laboratorium
anakan yang jauh lebih sedikit, perbedaan tinggi tanaman dan warna daun. serta umur berbunga yang jauh lebih dalam. Tanaman nomor 3 tidak menunjukkan tampilan yang berbeda jauh pada pertumbuhan tanaman. Perbedaan baru terlihat pada pengamatan generatif akhir dimana terdapat warna merah pada ujung gabah.
Polimorfisme antar tetua HIPA 7 yang dihasilkan oleh marka RM206 pada gel agarose 3% berjarak cukup dekat sehingga pita heterozigot sulit dilihat sebagai dua pita yang terpisah. Identifikasi pita homozigot dilakukan dengan melihat pendaran yang lebih tipis dan diidentifikasi sebagai pita homozigot. Individu-individu tanaman yang bukan hibrida diindikasikan oleh tanaman nomor 4, 14,15, 23 dan agak meragukan pada no 29 (Gambar 11).
22 23 23 24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 37 38 39 40 A R L L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131414 15 16 17 18 19 20 21
Gambar 11 Uji kemurnian benih Hipa 7 dengan menggunakan marka RM206 pada gel agarose 3 %.
Gambar 10 Identifikasi tanaman nomor 19 (kiri) dan Hipa 6 (kanan). Tanaman 19 diidentifikasi sebagai campuran pada uji kemurnian di laboratorium dan di lapang
HIPA 6 CVL
E mengi 29. P pemis (Gamb pita da mengg jantan restore polyak 2007), tampa polyak memp diband P grow-o sebag 15, 23 SSR d dan 3 ternya kedua nomor Gam 1 2 3 Elektrofores dentifikasi in Pada tanam ahan denga bar 12). Tan ari galur res gunakan ma (A) yaitu er (R) yaitu krilamid lebih , dimana p ak polimorfis krilamid leb punyai kema dingkan den Perbandinga
out test pada
ai campuran 3, 29 dan 34 dan grow-ou 4 yang diide ata merupak a tanaman te r 1 waktu b mbar 12. Uji k pada 4 5 6 7 8 9 10 sis denga ndividu hom man nomor an gel Agar naman terse storer. Dari l arka RM206 individu nom u individu n h baik diban roduk PCR s setelah me bih tinggi ampuan lebi gan gel aga
an identifika a Hipa 7 dap n pada grow 4. Terdapat p ut test yaitu entifikasi se kan hibrida ersebut lebi erbunganya kemurnian b a gel polyakr 11 12 1314 15 1 n mengg ozigot yaitu 29 yang rose 3% ter ebut bukan m lima tanama 6, tiga tana mor 4, 15 omor 14, d ndingkan de yang sebe enggunakan dibandingka h besar unt arose (Makau asi tanaman pat dilihat pa w-out test a perbedaan a pada tanam ebagai camp berdasarkan h kompak, a a lebih dalam benih Hipa 7 rilamid 1617 18 19 20 21 22 unakan g pada tanam sebelumny rlihat lebih j merupakan h an homozigo man identik dan 29. Du dan 23. Kem engan meng elumnya did n gel polyak an gel aga tuk mendete ulay et al. 20 campuran a ada Tabel 11 dalah tanam antar penilai man nomor 1 puran berda n uji SSR. anakan lebih m sekitar 2 dengan me 2 23 24 25 26 2728 gel polyak man nomor 4 ya agak m elas pada g hibrida kare ot yang diide k dengan pi ua tanaman mampuan d gunakan ag deteksi seba krilamid. Ting arose, mak eksi sejumla 001). antara hasil 1. Individu y man sampel an tanaman 1 dan 34. Ta sarkan iden Penampilan h sedikit sert hari dari ra enggunakan 8 293031 32 33 34 krilamid d 4, 14, 15, 23 meragukan gel polyakril na tidak me entifikasi de ita galur ma n identik de deteksi pada garose 3% (A agai monom gkat resolus ka gel ters ah alel per l uji SSR de yang diidentif nomor 1, 4 n campuran anaman nom ntifikasi morf n morfologi ta pada tana ata-rata tana marka RM2 35 36 37 38 39 40 A dapat 3 dan pada lamid miliki ngan andul ngan a gel Azrai morfis si gel sebut lokus ngan fikasi 4, 14, pada mor 1 fologi pada aman aman 206 A R L
yang ada pada pertanaman. Penyimpangan karakter dari tanaman-tanaman yang dinilai sebagai campuran pada grow-out test dapat dilihat pada Tabel 12 Tabel 11 Identifikasi tanaman campuran pada uji kemurnian dengan SSR dan
grow out test pada Hipa 7
Uji Kemurnian Jumlah sample Tanaman campuran (%) Nomor sampel SSR 40 12,5 4, 14, 15, 23, 29
Grow out test 40 17,5 1, 4, 14, 15, 23, 29, 34
Beberapa tanaman campuran memiliki penyimpangan morfologi yang cukup jelas dan dengan mudah dapat diidentifikasi. Tanaman nomor 14 memiliki ukuran tinggi tanaman dan lebar daun yang jelas berbeda dibandingkan Hipa 7 (Gambar 13). Pada beberapa tanaman yang diidentifikasi memiliki pita identik dengan galur mandul jantan memiliki malai-malai yang hampa pada rumpun tanamannya. tanaman tersebut adalah individu nomor 4, 15 dan 29
Tabel 12 Penyimpangan karakter pada tanaman sampel yang dinyatakan sebagai campuran pada grow out test Hipa 7
Nomor
sampel Penyimpangan karakter
1 Tanaman lebih kompak, umur berbunga lebih dalam 4 Biji hampa, parsial streril
14 Tanaman lebih tinggi, daun lebar, diameter batang lebih tebal 15 Terdapat malai steril, tanaman lebih kompak, (regestan) 23 Umur berbunga lebih dalam, tanaman lebih kompak, 29 Tanaman lebih kompak, anakan lebih sedikit, 34 Tanaman lebih kompak, anakan lebih sedikit,
Persentase tanaman campuran pada SSR lebih rendah dibandingkan
grow-out test (Tabel 11). Dua tanaman yang dinilai sebagai campuran
berdasarkan pengamatan morfologi, pada hasil elektroforesis terlihat memiliki pita-pita DNA yang berasal dari dua tetua pembentuk hibrida. Penilaian uji kemurnian dengan menggunakan marka SSR dinilai lebih akurat karena pangamatan yang dilakukan tidak bersifat subjektif dan jelas dapat mendeteksi apakah tanaman tersebut benar memiliki pita yang berasal dari tetua pembentuknya.
(a) (b)
Hasil uji kemurnian varietas pada Hipa 6 dan Hipa 7 menunjukkan bahwa penilaian secara morfologi bersifat subjektif dan sangat dipengaruhi pada kondisi lingkungan. Penampilan bentuk tanaman dikendalikan oleh sifat genetik tanaman
CVL Hipa 7
Gambar 13 Indentifikasi tanaman campuran nomor 14 (kiri) dan Hipa 7 (a), perbandingan ukuran dan lebar daun antara campuran dengan Hipa 7 (b)
Hipa 7 CVL
Gambar 14. Campuran dari tanaman parsial steril atau parsial fertil, malai 1, 2 fertil dan malai 3 steril (hampa). Malai 1,2,3 diambil dari satu rumpun tanaman yang sama. Malai no 4 adalah galur mandul jantan.
di bawah pengaruh faktor-faktor lingkungan (Sitompul & Guritno 1995). Faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi terjadinya perubahan morfologi tanaman antara lain iklim, suhu, jenis tanah, kondisi tanah, ketinggian tempat, dan kelembaban. Apabila faktor lingkungan lebih kuat memberikan pengaruh maka akan terjadi variasi pada morfologi tanaman. Pengalaman dan tingkat keahlian dari petugas pemeriksa pertanaman juga menjadi suatu hal yang sangat penting pada akurasi penilaian pada grow-out test.
Pengujian dengan SSR dapat mendeteksi campuran-campuran yang sangat mirip secara morfologi dan membedakannya secara jelas dalam hasil elektroforesis. Beberapa tanaman yang terserang hama penyakit dan berakibat pada perubahan penampilan fisik dan menimbulkan kerancuan pada grow out
test, dapat dengan jelas dikenali kebenarannya menggunakan uji kemurnian
dengan SSR.
Penilaian yang tidak tepat dalam uji kemurnian benih di lapang dapat menyebabkan kerugian besar pada produsen benih. Kerugian tersebut disebabkan oleh tidak akuratnya dalam penilaian tanaman campuran. Tanaman-tanaman yang dinilai sebagai Tanaman-tanaman campuran, dapat saja berbeda secara kasat mata karena dipengaruhi oleh pemupukan dan serangan hama penyakit bukan karena merupakan campuran. Hasil penilaian yang tidak akurat ini dapat berakibat pada tingginya persentase jumlah tanaman campuran dan dapat menyebabkan tidak lulusnya lot benih dalam proses sertifikasi.
Pita Tambahan pada Uji Kemurnian Benih dengan Menggunakan Marka SSR
Hasil uji kemurnian benih di laboratorium dengan menggunakan marka molekuler, menunjukkan terbentuk pita tambahan yang bukan merupakan pita spesifik dari tetua padi hibrida. Pita tambahan tersebut terlihat pada hasil elektroforesis dengan menggunakan gel polyakrilamid (Gambar 8 dan 12). Hal yang sama juga terjadi pada penelitian yang dilakukan oleh Hashemi et al. (2009) dan Xin et al. (2005) dimana muncul pita tambahan pada F1 hibrida padi yang diuji.
Pada tanaman F1, adanya pita tambahan diduga terbentuk akibat pergerakan yang lebih lambat dari pita-pita yang berasal dari kedua tetuanya. Diasumsikan bahwa pita-pita tersebut masih berupa pita yang heteroduplex. Heteroduplex merupakan molekul DNA untai-ganda (double strain) yang terbentuk diantara dua alel yang berbeda, oleh sebab itu maka terjadi
ketidakcocokan (Perez et al. 1999). Heteroduplex juga dapat terjadi akibat adanya penyimpangan, struktur yang rusak akibat adanya gelembung atau tonjolan pada bagian yang tidak cocok tersebut dan menyebabkan pergerakan yang lebih lambat pada gel elektroforesis bila dibandingkan molekul homoduplex (Kozlowski & Krzyzosiak 2001). Lambatnya pergerakan terjadi akibat adanya perubahan (insersi atau delesi) pada salah satu untai DNA double helix dan menimbulkan gelembung pada sisi tersebut. Pita tambahan yang mucul merupakan bukti dari sifat kodominan dari marka tersebut (Wu et al. 2002). Hal yang sama juga terjadi pada penelitian yang dilakukan dengan marka dan tanaman yang berbeda diantaranya marka RAPD kodominan pada kedelai (Zeng
et al 2003), padi (Wu et al. 2002), hibrida krisan (Huang et al. 2000) dan marka
SSR pada jagung (Heckenberger et al. 2002). Keberadaan dari DNA heteroduplex yang bergerak lebih lambat ini, berguna untuk menditeksi individu heterozigot.
Karakter Morfologi Tanaman Hipa 6 dan Hipa 7
Saat ini varietas-varietas padi yang dilepas memiliki tingkat kemiripan yang cukup tinggi sehingga cukup sulit untuk membedakan antar varietas hanya berdasarkan deskripsi umum dari tanaman. Ciri morfologi yang sering digunakan sebagai pembeda kultivar padi adalah tinggi tanaman, jumlah anakan produktif, warna batang, warna daun, permukaan daun, jumlah gabah permalai, bentuk gabah, warna gabah, dan permukaan gabah. Selain itu karakter pembungaan dapat juga dapat dijadikan karakter pembeda pada varietas-varietas padi (Wet et
al. 1986)
Deskripsi varietas untuk tanaman Hipa 6 dan Hipa 7 telah ada (Lampiran 5 dan 6) akan tetapi karakterisasi yang dilakukan belum mengikuti sejumlah karakter untuk pengujian individual kebaruan, keunikan dan keseragaman tanaman padi. Karekterisasi yang belum mengikuti standar dapat menyebabkan kerancuan dalam penilaian suatu varietas. Untuk karakter-karakter kualitatif klasifikasi sebaiknya mengikuti varietas contoh yang telah ditetapkan (PPVT 2010). Adanya varietas contoh akan sangat membantu untuk mengklasifikasikan karakter-karakter yang dimaksud.
Beberapa kerancuan yang yang mungkin timbul salah satunya pada warna gabah. Pada deskripsi varietas, Hipa 6 memiliki warna gabah kuning jerami dan Hipa 7 berwarna kuning. Bila diamati secara visual antara Hipa 6 dan Hipa 7
t ( d u w m d s P s t d tidak memil (Gambar 15 dideskripsika untuk Hipa 7 warna yang Penge menentukan dimaksudka sangat mem Penilaian te saja tetapi j tidak termas dari karakte Ga iki warna g 5). Karakter an berbeda 7. Secara pe sama yaitu enalan atau n apakah y n (true to ty mbantu bila erhadap sua uga harus d suk dalam d r kualitatif da ambar 16 Te Gambar 15 gabah yang r warna telin yaitu tidak enilaian visu warna hijau u identifika yang dihad ype). Karakte terjadi kecu tu varietas dapat dibeda deskripsi va an kuantitaif elinga daun 5 Gabah pad berbeda ke nga daun y berwarna u ual, warna te dan tidak t asi varietas dapi tersebu erisasi secar urigaan ada tidak hanya akan secara arietas telah f (Tabel 13 d pada Hipa 6 da Hipa 6 (k eduanya be yang ada pa untuk Hipa elinga daun erdapat anto s adalah ut adalah ra lengkap d nya campur a bisa dibed a objektif. Be diamati. Ka dan 14). 6 (kiri) dan H kiri) dan Hipa
erwarna kun ada deskrip 6 dan berw menunjukka osianin (Gam suatu tek benar varie dan lebih sp ran pada pe akan oleh p eberapa kar arakter terse Hipa 7 (kanan a 7 (kanan) ning jerami psi varietas warna hijau an karakter mbar 16). knik untuk etas yang esifik akan ertanaman. pemulianya rakter yang ebut terdiri n)
Tabel 13 Deskripsi beberapa karakter kualitatif padi hibrida Hipa 6 dan Hipa 7
No Karakter Hipa 6 Hipa 7
1 Koleoptil
Warna anthocyanin Tidak berwarna Tidak berwarna 2 Daun
Leher daun (Collar) Hijau Hijau Lidah daun (Ligula)
Bentuk, Warna Ada. Cleft (berlekuk) Tidak berwarna Ada Cleft (berlekuk) Tidak berwarna 3 Anak Bunga (Spikelet):
Warna putik (stigma) Putih Putih 4 Batang Warna anthocyanin pada buku Warna anthocyanin pada ruas Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tida ada 5 Lemma Steril
Warna Kuning Jerami Kuning Jerami
6 Malai :
a. Bulu ujung gabah
Warna
(pengamatan awal) (pengamatan akhir) Distribusi bulu ujung gabah Putih kekuning Kuning jerami Hanya diujung malai Putih kuningan Kuning jerami Hanya diujung malai b. Anak bunga: Kepadatan rambut pada lemma Warna Kuat Kuning Jerami Sedang Kuning Jerami c. Karakternya
terhadap batang Agak terkulai Agak terkulai d. Cabang sekunder
perilaku dari cabang malai Ada, kuat Agak tegak Ada, kuat Agak tegak e. Eksersi (pemunculan malai dari leher malai)
Muncul Muncul – muncul sempurna 7 Daun : Gejala penuaan
(senesens)
Sedang Sedang
8 Lema Warna
Reaksi dan intensitas pewarnaan phenol
Kuning jerami Ada, Gelap
Kuning jerami Ada, Gelap 9 Gabah : bentuk Ramping/panjang Ramping/panjang Ket : gambar dari beberapa karakter kualitatif dapat dilihat pada Lampiran 11
Tabel 14 Deskripsi beberapa karakter kuantitatif padi hibrida Hipa 6 dan Hipa 7
Karakter Hipa 6 Hipa 7
Rata-rata Min Max Rata-rata Min Max Lidah daun (cm) 2.25 1.30 3.30 2.00 1.40 2.70 Panjang helai daun
(cm) 61.54 53.00 81.00 73.5 56.00 83.00
Lebar helai daun (cm) 1.91 1.60 2.20 1.60 1.40 1.80 Tebal batang (cm) 0.69 0.61 0.81 0.56 0.51 0.70 Panjang batang (cm) 65.75 41.00 75.00 70.65 57.00 77.60 Leher malai (cm) 1.50 (-)2.00 2.50 2.61 2.10 4.50 Panjang malai (cm) 28.54 26.00 34.50 29.90 24.50 33.50 Tinggi tanaman (vegetatif) (cm) 107.70 96.00 118.00 105.00 93.00 118.00 Tinggi tanaman (generatif) (cm) 118.80 103.00 129.00 115.70 101.00 123.00 Lebar gabah (cm) 0.22 0.21 0.24 0.22 0.21 0.23 Panjang gabah (cm) 0.89 0.75 0.98 0.89 0.88 1.20 Rasio panjang/lebar 4.00 3.40 4.60 4.40 3.80 4.50 Panjang lemma steril
(cm) 0.23 0.20 0.30
0.28 0.22 0.37 Jumlah gabah/malai 303.00 205.00 381.00 242.00 184.00 337.00 Panjang bulu (cm) 0.35 0.18 0.61 0.93 0.28 1.70
Karakter-karakter yang dapat dijadikan penciri tambahan pada Hipa 6 dan Hipa 7 adalah warna koleoptil, bentuk dan ukuran lidah daun, warna putik, warna dan ukuran lemma steril, warna dan ukuran bulu pada ujung gabah, karakter malai terhadap batang, perilaku cabang sekunder, warna lemma dan reaksi lemma terhadap pewarnaan phenol. Dalam mencirikan suatu varietas karakter kualitatif lebih diharapkan dibandingkan dengan karakter kuantitatif. Karakter kualitatif keberadaanya lebih jelas, tidak dipengaruhi lingkungan dan bersifat diskrit sehingga mudah dibedakan. Sebaliknya pada karakter kuatitatif sangat dipengaruhi lingkungan, dan bersifat kontinyu.
Bila dibandingkan antara Hipa 6 dan Hipa 7 karakter morfologi yang dapat dijadikan pembeda adalah karakter warna daun, eksersi malai, tinggi tanaman dan kepadatan rambut pada lemma. Warna daun pada Hipa 6 hijau tua (skala 3 bagan warna daun) sedangkan untuk Hipa 7 berwarna hijau (skala 2 bagan warna daun) (Gambar 17(a)). Karakter eksersi malai pada Hipa 6 sangat pendek atau tidak memiliki leher malai. Rata-rata ukuran leher malai Hipa 6 adalah 1,51 dengan kisaran -2,00 s/d 2,50 cm. Leher malai pada Hipa 7 keluar sempurna
dengan kisaran ukuran 2,00- 4,50 cm. Karakter lain yang dapat membedakan Hipa 6 dan Hipa 7 adalah rambut pada lemma. Pada Hipa 6 rambut pada lemma termasuk lebat sedangkan pada Hipa 7 sedang.
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 17. Karakter warna daun Hipa 6 (a) dan Hipa 7 (b) karakter eksersi malai Hipa 6 (c) dan Hipa 7 (d)
