2 TINJAUAN PUSTAKA
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)Penamaan untuk E. sakazakii diberikan untuk menghormati ahli bakteriologi Jepang yang bernama Riichi Sakazaki. Penemuan E. sakazakii sebagai E. cloacae yang berpigmen kuning berawal dari laporan infeksi yang mengakibatkan sepsis dan meningitis di Inggris yang dilaporkan oleh Urmenyi dan Franklin pada tahun 1961 dan kasus meningitis yang terjadi di Denmark tahun 1965. Dalam kasus-kasus ini, bakteri E. cloacae berhasil diisolasi dari jaringan otak, sumsum tulang belakang dan spesimen lainnya. Pada tahun 1972 untuk pertama kalinya keluar bukti-bukti bahwa bakteri-bakteri yang digolongkan kedalam spesies E. cloacae ini masih beragam, ada yang menghasilkan pigmen kuning dan ada pula yang tidak menghasilkan pigmen kuning dan hubungan kekerabatannya hanya 50%. Nama E. sakazakii pertama kali digunakan pada pertemuan tahunan American Society for Microbiology pada tahun 1977, dan dideskripsikan E. sakazakii sebagai spesies baru oleh Farmer et al. (1980).
E. sakazakii mula-mula digolongkan sebagai anggota dari famili Enterobacteriaceae, genus Enterobacter (Nazarowec-White dan Farber 1997a). Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif, tidak membentuk spora, berbentuk batang, bersifat anaerob fakultatif, sel motil dengan flagela peritrichous, serta memiliki ukuran dengan panjang 3 μm dan lebar 1 μm (Shaker et al. 2007; Adams dan Moss 2000; Kandhai 2010).
Sumber kontaminasi bakteri ini adalah dari klinis, lingkungan dan bahan pangan. E. sakazakii diisolasi dari cairan otak, darah, air ludah, kerongkongan, hidung, peralatan klinis, usus, kulit, luka, sumsum tulang belakang, mata dan telinga (Farmer et al. 1980). Keberadaan E. sakazakii pada lingkungan seperti tikus, serangga, air, tanah dan sampah (Iversen dan Forsythe 2003). Bakteri ini ditemukan juga pada produk-produk olahan pangan seperti susu UHT, keju, daging, sayuran, biji-bijian ataupun produk fermentasi (Gassem 1999, 2002; Iversen dan Forsythe 2003, 2004; Leclercq et al. 2002; Muytjens et al., 1988; Skaldal et al. 1993 dalam Shaker et al. 2007).
Bakteri ini dapat menginfeksi semua umur terutama bayi yang terlahir prematur kurang dari 36 minggu, berat lahir rendah, sistem kekebalan tubuh rendah dan bayi yang terlahir dari ibu yang terinfeksi HIV (Fiore et al. 2008). Kontamiasi E. sakazakii dapat terjadi secara intrinsik pada susu formula maupun secara ekstrinsik (Van Acker et al. 2001; Muytjens et al. 1983). Sifat invasif oleh E. sakazakii dapat mengakibatkan penyakit berbahaya seperti septis, meningitis dan necrotizing enterocolitis. Angka kematian untuk necrotizing enterocolitis berkisar antara 10-55% dan meningitis pada rentang antara 40-80% (Fiore et al. 2008).
Kasus yang diakibatkan oleh E. sakazakii dapat diatasi dengan perlakuan antibiotik chloramphenicol dan ampicillin (Farmer et al. 1980). Akan tetapi Oonaka et al. (2010) menyatakan bahwa E. sakazakii tahan terhadap ampicilin dan lincomycin, namun sensitif terhadap antimikroba cefotaxime, ceftriaxone, cefoperazone, ceftazidime, cefpirome, cefozopran, gentamicin, meropenem, ciprofloxacin.
Cronobacter spp. merupakan nama lain (sinonim) dari E. sakazakii. Bakteri ini digolongkan ke dalam genus baru Cronobacter, yang terdiri atas
spesies-spesies C. sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii dan C. dublinensis (Iversen et al. 2007b). Metoda deteksi dan isolasi E. sakazakii
dapat juga digunakan untuk bakteri Cronobacter. Metoda isolasi Cronobacter spp. dari susu formula seperti pada Tabel 1.
Tabel 1 Prosedur isolasi Cronobacter spp. dari susu formula
FDA (2002)a ISO/TS 22964 (2006)b
Ukuran Sampel Pra-pengayaan
Pengayaan (inkubasi 24 jam)
Isolasi (inkubasi 24 jam)
Identifikasi Konfirmasi
100 g, 10 g, 1 g
Air destilata steril (inkubasi suhu 36˚C, 24 jam)
EE broth (suhu 36˚C)
VRBG agar (suhu 36˚C), koloni menggumpal
berwarana ungu bergradasi ke orange/kuning/kecoklatan. TSA (inkubasi 25˚C, 48-72 jam), koloni berwarna kuning. API 20E 30 g BPW (inkubasi suhu 37˚C, 18 jam) modifikasi LST broth+vancomycin (suhu 44˚C)
ESIA (suhu 44˚C), koloni biru/hijau
TSA (inkubasi 25˚C, 44-48 jam), koloni berwarna kuning.
Uji oksidase.
a FDA (2002b)
b ADRIA DEVELOPPEMENT (2012)
Klasifikasi Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi merupakan pengelompokan organisme berdasarkan tingkat kemiripannya, sehingga dapat dikelompokkan ke dalam tingkatan taksonomi (seperti kingdom, phylum, class, order, family, genus dan spesies). Tujuan klasifikasi ini yaitu : (1) membuat kriteria untuk identifikasi. Identifikasi merupakan kegiatan menentukan persamaan dan perbedaan antara dua organisme, (2) menata organisme sejenis ke dalam sebuah grup dan (3) memperoleh informasi penting tentang bagaimana organisme tersebut berkembang. Untuk organisme macroscopic, klasifikasi dapat dilakukan berdasarkan karakterisasi struktural, namun untuk organisme microscopic seperti bakteri memiliki struktural yang hampir mirip. Pengklasifikasian bakteri mengacu kepada Bergey’s manual, yang pada awalnya dapat membedakan genus dan spesies berdasarkan deskripsi dan bentuk sel. Karena perbedaan morfologi bakeri lebih minor dibandigkan terjadinya rekombinasi genetik (akibat transfer gen lateral), maka perkembangan klasifikasi berdasarkan Bergey’s manual dilakukan berdasarkan filogeni (dengan
analisis sekuensing 16s rDNA) (Black 2012). Secara umum kriteria klasifikasi bakteri seperti terlihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Kriteria untuk klasifikasi bakteri
Kriteria Contoh Kegunaan
Morfologi ukuran dan bentuk sel; sel tersusun berpasangan, mengelompok atau filament; keberadaan flagella, pili, endospora,kapsul.
pembeda utama antara genus dengan
beberapa spesies. Pewarnaan gram positif, gram negative memisahkan
eubacteria ke dalam divisi
Pertumbuhan karakterisasi pada kultur cair atau padat,morfologi koloni,
pengembangan pigmen
membedakan spesies dengan genus
Nutrisi autrotropik,heterotropik, fermentasi dengan produk-produk
berbeda,sumber energi, sumber karbon, sumber
nitrogen,membutuhkan nutrisi khusus.
membedakan spesies, genus dan grup yang lebih tinggi.
Fisiologis temperature (optimum dan rentang); pH (optimum dan rentang),
memerlukan oksigen, garam, tahan tekanan osmotic,sensitifitas dan resisten terhadap antibiotic.
membedakan spesies, genus dan grup yang lebih tinggi.
Biokimia Komponen alami sel seperti dinding sel, molekul RNA, ribosom, pigmen, antigen, uji biokimia.
membedakan spesies, genus dan grup yang lebih tinggi.
Genetik persentase basa nukleotida (rasio G +
C), hibridisasi DNA. membedakan kekerabatan dalam genus dan family. Serologi penggumpalan, antibodi yang dilabel
dengan fluorescent. membedakan strain dan beberapa spesies. Tipe phage kerentanan terhadap kelompok
bagteriophage identifikasi dan membedakan strain. Sekuensing
basa pada rRNA
sekuensing rRNA menguji hubungan
dalam kehidupan Profil protein pemisahan protein dengan dua
dimensi PAGE (elektroforesis)
membedakan strain
Klasifikasi Biokimia Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi bakteri oleh Bergey’s manual dibedakan berdasarkan pewarnaan dan morfologi sel. Enterobacteriaceae merupakan kelompok bakteri gram negatif dan berbentuk batang. Famili Enterobacteriaceae dapat dibedakan dari Aeromonas, Pseudomonas dan Vibrio melalui pengujian oksidase. Bakteri yang tergolong ke dalam famili Enterobacteriaceae memiliki karakteristik negatif terhadap uji oksidase. Spesies-epesies di dalam famili Enterobacteriaceae dibedakan dengan pengujian fermentasi laktosa, produksi indol, uji MR-VP dan lisin decarboxylase seperti yang tertera pada Lampiran 1 (Holt 2000).
Farmer et al. (1980) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi 15 biogrup berdasarkan produksi indol, motilitas pada suhu 36 ˚C, produksi asam
inositol, dulsitol, α-methil-D-glukosidase, pemanfaatan malonat, ornitin, methyl red dan Vogas-Prokauer (VP). Nazarowec-White dan Farber (1999) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi 3 biotipe berdasarkan profil biokimia menggunakan perangkat cepat API 20E. Biotipe 1 memiliki karakteristik yang sama dengan E. sakazakii ATCC 29544. Biotipe 2 memiliki perbedaan pada uji inositol negatif dibandingkan dengan biotipe 1. Sedangkan untuk biotipe 3 memiliki karakteristik reaksi positif untuk uji VP. Iversen et al. (2006) menambahkan biogrup 16 dari pengelompokan yang dilakukan Farmer et al. (1980) dengan profil positif untuk reaksi inositol dan dulsitol positif tetapi menunjukkan reaksi negatif untuk indol. Iversen et al. (2007b) menggunakan 4 reaksi biokimia (dulsitol, produksi asam dari methyl-α-D-glucoside, produksi indol dan pemanfaatan malonat) untuk mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensii, C. turicensis (Tabel 3).
Klasifikasi Genetik Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi Cronobacter spp. secara genetik oleh Nazarowec-White dan Farber (1999) dilakukan berdasarkan ribotyping, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) dan randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Klasifikasi berdasarkan ribotyping tersebut, dapat mengelompokan E. sakazakii menjadi 10 ribotipe dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease EcoR1.
Isolat yang tidak bisa dibedakan menggunakan metoda ribotyping dapat dibedakan berdasarkan RAPD. Cronobacter spp. terbagi atas 17 kelompok berdasarkan RAPD menggunakan primer UBC 245 (5’-CGC GTG CCA G-3’) dan 18 kelompok menggunakan primer UBC 282. Produk yang dihasilkan dari
Tabel 3 Uji biokimia untuk membedakan spesies Cronobacter
Dulsitol Indol Malonat AMGa
Cronobacter sakazakii - - - + Cronobacter malonaticus - - + + Cronobacter muytjensii + + + - Cronobacter dublinensii - + v + Cronobacter turicensis + - + + Cronobacter genomospesies 1 + - + + ametil-α-D-glukosida
analisis dengan RAPD yakni berukuran 0.3-2.5 kb (Nazarowec-White dan Farber 1999). Analisa RAPD oleh Kim et al. (2008) menyatakan bahwa Cronobacter spp. menghasilkan 5 grup berdasarkan primer UBC 245 dan 6 grup berdasarkan primer UBC 282. Produk DNA yang dihasilkan oleh kedua primer tersebut berukuran 0.2-2.0 kb.
Klasifikasi berdasarkan PFGE dilakukan menggunakan enzim endonuklease Xba1 (5’-TCT AGA-3’) dan Spe1 (5’-ACT AGT-3’). Cronobacter spp. dapat dikelompokkan menjadi 18 kelompok menggunakan enzim endonuklease Xba1 dan 17 kelompok menggunakan enzim endonuklease Spe1 (Nazarowec-White dan Farber 1999). Klasifikasi oleh Kim et al. (2008) membagi Cronobacter spp. menjadi 8 grup berdasarkan PFGE. Keragaman genetik Cronobacter spp. menggunakan RAPD dan PFGE lebih diskriminatif dibandingkan menggunakan metoda ribotyping.
Iversen et al. (2004b) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi klaster 1, 2, 3 dan 4 berdasarkan gen parsial 16S rDNA dan hsp60. Sekuensing gen hsp60 menggunakan pasangan primer GGT AGA AGA AGG CGT GGT TGC-3’ dan 5’-ATG CAT TCG GTG GTG ATC ATC AG-3’. Berdasarkan gen 16S rDNA isolat Cronobacter spp. memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan Citrobacter koseri (97.8%) dibandingkan dengan spesies Enterobacter lainnya. Pengelompokan isolat-isolat Cronobacter spp. berdasarkan gen 16S rDNA, disimpulkan bahwa klaster 1 dan 2 dapat dibedakan sebesar 1.6-1.9%. Klaster 2 memiliki hubungan yang lebih dekat dengan E. sakazakii. Klaster 3 memiliki hubungan yang dekat dengan E. pyrinus, E. hormaechei dan Citrobacter koseri. Klaster 4 memiliki hubungan sebesar 96.5% dengan E. sakazakii. Berdasarkan gen hsp60 klaster 1 memiliki hubungan sebesar 97.6-99.4% dengan E. sakazakii, klaster 2 sebesar 89.2-90.4%, klaster 3 sebesar 95.2% dan klaster 4 sebesar 88.8%.
Iversen et al. (2006) membandingkan sifat genotip dengan karakteristik biokimia sehingga menyatakan bahwa klaster 1 terdiri atas biogrup 1-5, 7-9,11,13 dan 14. Klaster 3 dengan biogrup 15 dan klaster 4 dengan biogrup 6, 10 dan 12, sedangkan klaster 2 terdiri atas bigrup baru 16. Iversen et al. (2007b) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensis, C. turicensis dan Cronobacter genomospesies 1.
Golongan C. sakazakii, C. malonaticus merupakan strain pada grup 1. C. muytjensii merupakan strain pada grup 3. C. dublinensis merupakan strain pada
grup 4. C. turicensis merupakan strain pada grup 2. Cronobacter genomospesies 1 yaitu strain NCTC 9529 dan E680 yang tergolong kedalam grup 2, namun memiliki perbedaan dengan C. turicensis berdasarkan Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). AFLP merupakan teknik molekuler yang digunakan sebagai penanda genetik terhadap hasil amplifikasi DNA dari fragmen-fragmen DNA yang terbentuk akibat aktivitas enzim restriksi tertentu.
Peran Gen infB dan Ketahanan Panas
Gen infB merupakan penyandi protein IF2. IF1, IF2 dan IF3 dimiliki oleh bakteri sebagai faktor inisiasi (Shazand et al. 1993). Inisiasi merupakan tahap awal proses translasi untuk mensintesis protein (Laursen et al. 2005).
Proses translasi tersebut dimulai dengan pemisahan ribosom sub unit besar (50S) dan sub unit kecil (30S). IF3 akan berikatan dengan sub unit 30S yang mendukung pemisahan kedua sub unit tersebut. IF1 akan menstimulasi kerja IF3. Setelah kedua sub unit ribosom terpisah, asam amino metionin akan berikatan dengan inisiator tRNAfMet, sehingga fMet-tRNA dan mRNA akan saling berikatan dan masuk ke ribosom sub unit 30S. Inisiator tRNA tersebut berikatan langsung dengan kodon awal (sisi-P). Ikatan ini dipengaruhi juga oleh kerja IF1, yakni dengan memblok sisi-A. Tahapan translasi inisiasi ini, akan membuat interaksi antara kodon-antikodon sehingga terjadi perubahan konformasi sub unit 30S. IF1 dan IF3 bersifat relatif tidak stabil terhadap perubahan komformasi tersebut, sehingga IF1 dan IF3 terlepas dari 30S, selanjutnya IF2 membawa triplet mRNA, sub unit 30S dan tRNA-met secara bersamaan kemudian bergabung dengan sub unit 50S hingga terbentuk ribosom komplek 70S (Laursen et al. 2005; Madison et al. 2012).
Shazand et al. (1990) menyatakan gen infB pada bakteri Bacillus subtilis mengandung 2 148 pb (716 asam amino) dengan ATG sebagai kodon awal dan TGA sebagai kodon akhir. Pada Escherichia coli, dimana gen infBnya terletak pada operon yang sama dengan inisiator tRNA (metY), terminasi transkripsi (nusA) dan tiga protein open reading frame (ORF) yang fungsinya tidak diketahui. Pada Bacillus subtilis, gen infB tidak diikuti oleh nusA tetapi diapit oleh dua ORF (polC dan pscB). Gen infB terletak pada 145˚ kromosom Bacillus subtilis. Gen tersebut mengkode dua protein, IF2α dan IF2β yang homolog dengan IF2 pada Escherichia coli.
Hedegaard et al. (1999) menggunakan gen infB untuk mengkonfirmasi hasil klasifikasi dan untuk melihat keragaman pada level spesies di dalam genus Enterobacteriaceae. Isolat E. aerogenes diklasifikasikan sebagai isolat E. cloacae (EclAU9604) berdasarkan gen infBnya. Isolat Hafnia alvei (HalAU9601) juga diklasifikasikan ke dalam grup Escherichia coli berdasarkan analisis sekuen infB. Berdasarkan pohon filogeni, gen infB dapat memisahkan Escherichia coli menjadi dua klaster. Gen ini juga dapat memperlihatkan keragaman spesies dengan memisahkan Citrobacter diversus dan Citrobacter freundii, Klebsiella pneumonia dan Klebsiella oxytoca, E. cloacae dan E. aerogenes serta Erwinia herbicola dan Morganella morganii.
Baldwin et al. (2009) menyatakan bahwa lokus gen infB beserta 6 lokus gen lainnya (atpD, fusA, glnS, gltB, gyrB dan pps) digunakan untuk membedakan spesies C. sakazakii dan C. malonaticus menggunakan metoda multilocus sequence typing (MLST). C. sakazakii terdiri dari 12 kelompok sedangkan C. malonaticus terdiri atas 3 kelompok berdasarkan profil filogeni ketujuh lokus gen tersebut. Isolat yang tergolong C. sakazakii merupakan isolat-isolat pada biotipe 1, 2, 2a, 3, 4, 4a, 5, 7, 13 dan 13a, adapun C. malonaticus merupakan isolat-isolat di dalam biotipe 2a, 4a, 5, 5a, 8c, 9, 13a, 13b dan 14b. Hasil analisis MLST menunjukkan gen infB memiliki ukuran fragmen 441 bp.
Gen infB dilaporkan memiliki hubungan dengan perilaku Cronobacter spp. terhadap ketahanan panas. Karakterisasi genetik ketahanan panas Cronobacter spp. berdasarkan gen groEL, hnsB dan infB telah dilakukan oleh Asakura et al. (2007) dan menyatakan bahwa gen groEL dan hnsB tidak spesifik dalam membedakan isolat tahan panas (kelas R) dan isolat sensitif panas (kalas S), namun gen infB spesifik membedakan isolat kelas R dan kelas S. Berdasarkan respon ketahanan
panasnya, Cronobacter spp. terdiri dari 3 kelompok yaitu heat-resisten (kelas R), heat-sensitive (kelas S) dan intermediate (kelas M). Pengelompokkan ini dilakukan berdasarkan konsentrasi sel yang bertahan hidup setelah mendapatkan perlakuan pemanasan. Sel yang bertahan hidup lebih dari 104 sel/ml digolongkan ke dalam kelas R, kurang dari 102 sel/ml dikelompokkan ke dalam kelas S dan sel yang bertahan antara 102-104 sel/ml merupakan kelas M (Asakura et al. 2007).
Analisis terhadap Cronobacter spp. baik digunakan pada saat bakteri ini berada di fase stasioner, karena alasan kompetitif antara bakteri. Fase stasioner Cronobacter spp. berada pada suhu media 58˚C. Nilai D untuk Cronobacter spp. yang diperoleh pada suhu ini berada pada rentang 0.39-0.6 menit (Breewer et al. 2003). Menurut Edelson-Mammel dan Buchanan (2004) menyatakan bahwa nilai D untuk Cronobacter spp. bervariasi yaitu antara 0.51 hingga 10.4 menit pada suhu 58˚C. Ghassem et al. (2011) menyatakan bahwa rentang nilai D untuk isolat C. muytjensii strain ATCC 51329 dan isolat-isolat C. sakazakii dari bahan pangan berkisar antara 42.92 menit pada suhu 52˚C hingga 1.86 menit pada suhu 60˚C. Nazarowec-White dan Farber (1997b) menyatakan nilai D untuk Cronobacter spp. yaitu 4.2 menit pada suhu 58˚C. Nilai ini menindikasikan bahwa Cronobacter spp. merupakan bakteri yang tahan panas dibandingkan Enterobactericeae lainnya pada produk susu. Iversen et al. (2004a) menyatakan bahwa nilai D untuk Cronobacter spp. pada suhu 54˚C yaitu 10.2-16.4 menit. Al-Holy et al. (2009) menyatakan bahwa nilai D pada suhu 55˚C memiliki rentang yang jauh yakni 14.8 menit untuk isolat E. sakazakii ATCC 29004 hingga 1.5 menit untuk isolat E. sakazakii 55. Nilai D suhu 60˚C pada susu bubuk dilaporkan oleh Iversen et al. (2004a) sebesar 1.1 menit, dan nilai D pada suhu 62˚C yaitu antara 0.2-0.4 menit. Al-Holy et al. (2009) melaporkan bahwa nilai D pada suhu 63˚C yakni 0.88 menit.
Berdasarkan analisis nilai-nilai D tersebut, Iversen et al. (2004a) memperkirakan nilai D suhu 71.2˚C yakni 0.7 detik. Dengan demikian, Cronobacter spp. tidak mampu bertahan pada suhu pasteurisasi, karena suhu pasteurisasi yaitu 71.7 ˚C selama 15 detik. Pasteurisasi dengan metoda HTST (High Temperature Short Time) dapat mereduksi 6 log Cronobacter spp., sedangkan pemanasan selama 50 detik pada suhu 86.5˚C mampu mereduksi seluruh Cronobacter spp. (Al-Holy et al. 2009).
Berdasarkan nilai D pada suhu 52˚C beberapa isolat lokal Cronobacter spp. memiliki waktu reduksi yang lebih besar jika dibandingkan dengan isolat luar. Semakin tinggi nilai D menunjukan isolat lebih tahan terhadap panas. Nilai D52˚C untuk isolat lokal berkisar antara 17.92-114.94 menit. , sedangkan nilai D58˚C berkisar antara 1.72-3.55 menit dan terdapat 3 dari 7 isolat yang diuji tidak mampu bertahan hidup pada suhu ini (Seftiono 2012).
