35
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Pendekatan dan Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian eksperimen sesungguhnya (true experimental research) dengan pendekatan kuantiatif. Penelitian ini terdiri dari pengujian daya antagonisme menggunakan uji biakan ganda (dual culture) (Chet, 1987 dalam Barakat, 2014) dan pengamatan mekanisme antagonis antara kapang Trichoderma spp. terhadap kapang patogen
Rhizoctonia solani.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Balai Penelitian Aneka Kacang dan Umbi (BALITKABI) Kendalpayak Malang. Waktu penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus–September 2018.
3.3 Variabel penelitian 3.3.1 Jenis Variabel 1. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah enam jenis isolat kapang
Trichoderma spp. koleksi kebun percobaan BALITKABI Kendalpayak, Malang.
2. Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah daya antagonisme isolat kapang
Trichoderma spp. dalam menghambat pertumbuhan kapang patogen tular tanah Rhizoctonia solani.
36
3. Variabel Kontrol
Variabel yang diusahakan sama untuk tiap perlakuan meliputi suhu inkubasi, jenis medium, umur biakan murni, dan lama inkubasi.
3.3.2 Definisi Operasional Variabel
1. Isolat kapang merupakan biakan murni pertama yang dibuat dari sumber kapang aslinya. Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat
Trichoderma spp. yang terdiri dari TA 1, TA 2, TA 3, TA 4, TA 5, dan TA 6.
2. Kapang patogen tular tanah Rhizoctonia solani yang digunakan dalam penelitian ini merupakan kapang yang sudah teruji kemampuan patogenitasnya terhadap kacang kedelai dan kacang hijau.
3. Daya antagonisme kapang Trichoderma spp. terhadap kapang patogen tular tanah Rhizoctonia solani dilakukan dengan menggunakan metode dual culture (biakan ganda), yaitu dengan menghitung persentase selisih antara jari-jari koloni kapang patogen yang menjauhi kapang antagonis dengan jari-jari koloni kapang patogen yang mendekati kapang antagonis, dibagi dengan jari-jari koloni kapang patogen yang menjauhi kapang antagonis.
4. Jenis medium yang digunakan yaitu media PDA, umur biakan murni kapang
Trichoderma spp. mencapai 5 x 24 jam, dengan suhu inkubasi kapang antara
25-27 0C, sedangkan lama inkubasi biakan ganda yaitu 4 x 24 jam. 3.4 Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian terdiri dari tahap persiapan, rancangan percobaan, dan pelaksanaan penelitian.
37
3.4.1 Persiapan Penelitian
3.4.1.1 Persiapan Alat dan Bahan Penelitian
Persiapan penelitian dilakukan dengan menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan dalam setiap tahap penelitian yang terdiri dari.
1. Alat yang digunakan dalam pembuatan media Potato Dextros Agar (PDA) ialah cawan petri, autoklaf, labu erlenmeyer 100 ml, tabung reaksi, batang pengaduk, kompor listrik, neraca analitik, makropipet. Bahan yang digunakan yaitu ekstrak kentang, antibiotik chloramfenicol, dextrose, agar powder, aquades steril.
2. Alat yang digunakan untuk tahap inokulasi adalah jarum inokulasi, Laminar
Air Flow (LAF), inkubator, lampu spiritus, tabung reaksi, rak tabung. Bahan
yang digunakan yaitu aquades steril, tisu, alkohol 70%, alkohol 95%.
3. Alat yang digunakan untuk pengujian daya antagonis yaitu cawan petri diameter 9 cm, bor gabus, inkubator, LAF. Bahan yang digunakan yaitu medium lempeng PDA.
4. Alat yang digunakan untuk pengamatan mekanisme antagonis Trichoderma spp. yaitu mikroskop, pipet, kaca benda dan kaca pentutup, mikrometer obyektif dan okuler, dan kamera. Bahan yang digunakan yaitu aquades steril, kapas, alkohol 95%, tisu dan larutan lactophenol cotton blue.
3.4.1.2 Pembuatan Medium Pertumbuhan Kapang
1. Pembuatan ekstrak kentang dilakukan dengan mengupas kentang dan menimbangnya sebanyak 200 gram, dan selanjutnya direbus dengan
38
menggunakan aquades sebanyak 500 ml selama 45 menit. Kemudian disaring dan didapatkan ekstrak kentang.
2. Ekstrak kentang ini kemudian ditambah dengan aquades hingga mencapai volume 1 liter. Selanjutnya di tambahkan agar dan dextrose masing-masing sebanyak 20 gram serta ditambkan 2 kapsul antibiotik chloramfenicol. Campuran media PDA ini diaduk hingga homogen.
3. Media ini selanjutnya dituangkan di cawan petri sebanyak 15 ml dengan menggunakan makropipet.
4. Media PDA yang sudah dituang di cawan petri selanjutnya disterilisasikan menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C, tekanan 15 psi, dalam waktu 15 menit.
5. Setelah itu media PDA didinginkan sebelum digunakan, apabila tidak segera digunakan sebaiknya disimpan di dalam almari es.
3.4.1.3 Sterilisasi alat
Sterilisasi alat dilakukan dengan memakai oven kering pada suhu 1500 C selama 2 jam atau juga dapat menggunakan autoklaf seperti halnya sterilisasi media PDA.
3.4.2 Rancangan Percobaan
Bentuk desain eksperimen dalam penelitian ini adalah the only posttest
control group design. Rancangan penelitian ini membandingkan antara kelompok
perlakuan dengan kelompok kontrol. Banyaknya perlakuan dalam penelitian ini adalah 6 kelompok perlakuan eksperimen yaitu jenis isolat Trichoderma spp. yang
39
terdiri dari TA 1, TA 2, TA 3, TA 4, TA 5, dan TA 6. Desain penelitian yang akan dilaksanakan adalah sebagai berikut :
O P1 O1 O P2 O2 O P3 O3 O P4 O4 O P5 O5 O P6 O6 O P0 OK Keterangan:
O : kapang patogen Rhizoctonia solani
P1,2,3,4,5,6 : jenis perlakuan (isolat Trichoderma spp. TA 1, TA 2, TA 3, TA 4, TA 5,TA 6)
P0 : tanpa adanya perlakuan
O1,2,3,4,5,6 : observasi pada kelompok perlakuan OK : observasi pada kelompok konrtrol
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini ialah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan masing-masing pengujian sebanyak 4 kali ulangan. Pada penelitian ini juga dilakukan pengamatan mekanisme antagonisme spesies kapang antagonis Trichoderma spp. terhadap Rhizoctonia solani.
3.4.3 Pelaksanaan Penelitan
Pelaksanaan penelitian dilakukan melalui tahap sebagai berikut.
1. Pengujian daya antagonis kapang Trichoderma uji terhadap R. solani dilakukan dengan metode biakan ganda (dual culture) (Chet, 1987 dalam Barakat, 2014), yaitu dengan cara mengambil masing-masing biakan kapang murni Rhizoctonia
solani dan kapang Trichoderma uji dan diinokulasikan pada cawan petri yang
40
nampak pada Gambar (3.1 a dan 3.1 b). Selanjutnya biakan uji diinkubasi selama 4 x 24 jam dengan suhu 25-27° C.
2. Pengamatan mekanisme antagonis antara kapang Trichoderma spp. dengan kapang Rhizoctonia solani dilakukan dengan langkah kerja sebagai berikut. a. Pengamatan makroskopis
Pertumbuhan dari kedua biakan kapang diamati setiap hari sehingga akan terlihat persaingan/kompetisi dari kedua biakan kapang dalam memperebutkan tempat dan nutrisi yaitu dengan melihat diantara kedua kapang tersebut mana yang lebih cepat tumbuh memenuhi cawan petri.
Gambar 3.1 (Tampak atas) Skema penempatan kapang patogen dengan kapang antagonis uji dengan metode dual culture
Gambar 3.2 (Tampak samping) Skema penempatan kapang patogen dengan kapang antagonis uji dengan metode dual culture
Keterangan:
P = potongan koloni kapang Rhizoctonia solani A = potongan koloni kapang Trichoderma uji
41
b. Pengamatan mikroskopis
Pengamatan mikroskopis dilakukan melalui langkah sebagai berikut.
1) Biakan kapang dipotong pada daerah perbatasan antara koloni kapang
Trichoderma spp. dengan koloni kapang patogen dengan scalpel steril secara
aseptik dengan 1 x 1 cm2.
2) Potongan biakan kapang diletakkan pada kaca benda, ditetesi dengan larutan
Latophenol cotton blue dan ditutup dengan kaca penutup, lalu diamati di bawah
mikroskop.
3) Pengamatan di bawah mikroskop dilakukan dengan perbesaran 10 x 10 dan perbesaran 40 x 10. Hasil pengamatan didokumentasikan dengan menggunakan kamera.
3.5 Metode Pengumpulan Data
Metode pengumpulan data yang digunakan dalam penelitian ini adalah observasi eksperimen, yaitu mengambil data secara langsung di laboratorium dengan melakukan pengamatan dan mencatat aktivitas dari objek perlakuan. Pengambilan data dilakukan dengan cara mengukur jari-jari koloni kapang
Rhizoctonia solani yang menjauhi dan mendekati koloni kapang Trichoderma spp.
Data hasil pengamatan dihitung persentasenya dengan rumus berikut.
Keterangan :
r1 = jari-jari koloni Rhizoctonia solani yang menjauhi koloni kapang antagonis r2 = jari-jari koloni Rhizoctonia solani yang mendekati koloni kapang antagonis
42
Kemudian data persentase daya antagonisme yang diperoleh dimasukkan ke dalam Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Data hasil uji daya antagonisme antara kapang Trichoderma spp. terhadap kapang Rhizoctonia solani
Kode Trichoderma Ulangan H3 H4 R1 R2 Daya antagonisme (%) Rata -rata (cm) R1 R2 Daya antagonisme (%) Rata -rata (cm) 1 2 3 4
3.6 Teknik Analisis Data
Teknik analisis data menggunakan analisis kuantitatif. Pengolahan data menggunakan uji homogenitas (Levene) dan uji normalitas
(Kolmogorof-Smirnov). Apabila variansi data homogen dan data terdistribusi normal, maka
selanjutnya dianalisis menggunakan uji ANOVA satu jalur dengan tingkat signifikansi α = 0,05 (One Way ANOVA). Uji ANOVA satu jalur bertujuan untuk untuk mengetahui perbedaan daya antagonisme dari masing-masing perlakuan.
Hasil analisis data yang menunjukkan perbedaan signifikan akan diuji lanjut menggunakan uji BNT (Beda Nyata Terkecil) tingkat signifikansi α = 0,05 Uji ini bertujuan untuk menentukan persentase daya antagonisme tertinggi dalam menghambat pertumbuhan kapang patogen. Semua analisis tersebut dilakukan dengan menggunakan SPSS (Statistic Program For Social Science) versi 21.
