Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin/ 10 Maret 2014 Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB
PJP : Syaefudin, SSi, MSi Asisten : Nazula Rahma S
Dwi Ayu Setyaningrum M Maftuchin S
PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE
BRADFORD
Kelompok 21
Yanti Fajarwati G84120054
Arifa Nurahmaputri G84120024 Listia Vidyawati M M G84120086
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PENDAHULUAN
Protein merupakan suatu komponen selular utama yang menyusun tubuh manusia, dan berperan penting dalam struktur, fungsi, dan reproduksi manusia. Protein terdapat di dalam semua sistem kehidupan, dan pada manusia, protein banyak tersimpan di jaringan otot dan beberapa organ tubuh lainnya, sedangkan sisanya terdapat di dalam darah. Istilah protein pertama kali dikemukakan oleh pakar kima Belanda, G.J Mulde pada tahun 1939, berasal dari bahasa Yunani ‘proteios’ yang mempunyai arti “yang pertama” atau “yang paling utama”. Protein tersusun atas asam-asam alfa amino yang susunannya mengandung unsur-unsur seperti karbon, oksigen, hidrogen, dan nitrogen (Sumardjo 2008).
Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya dengan metode Bradford, metode Lowry, dan metode biuret. Metode yang digunakan dalam percobaan kali ini ini adalah metode Bradford. Metode Bradford adalah metode untuk mengukur konsentrasi protein total secara kolorimetri dalam suatu larutan. Metode ini menggunakan pewarna Coomasie Briliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam, sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert-Beer) pada panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak). (Bardford 1976).
Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) digunakan sebagai larutan standar dalam penentuan kadar protein dengan metode Bradford. Percobaan ini dilakukan dengan menambahkan sejumlah NaCl pada larutan BSA, yang berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Penambahan NaCl ini, akan menyebabkan nilai absorbansinya menurun atau semakin kecil, karena pengompleksan protein dan zat warna CBB dalam reagen Bradford akan semakin sedikit. Dengan semakin kecilnya nilai absorban, menunjukkan bahwa protein yang larut semakin banyak (Khopkar 2007).
METODE PRAKTIKUM Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan 1 Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Waktu praktikum yaitu hari Senin, tanggal 10 Maret 2014 pukul 08.00 – 11.00 WIB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gelas piala, tabung reaksi, bulp, pipet Mohr 0,1 mL, kertas alumunium foil, spektrofotometri UV-Vis. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) 0,1 mg/ml, reagen Bradford, larutan NaCl 0,9%
Prosedur Percobaan
Pembuatan kurva standar. Telah disiapkan 12 tabung reaksi yang bersih dan kering. Rangkaian larutan campuran NaCl dan larutan standar BSA dibuat dengan proporsi yang berbeda. Tabung 1 berisi 0 μL BSA dan 100 μL NaCl, tabung 2 berisi 10 μL BSA dan 90 mL NaCL, tabung 3 BSA sebanyak 20 μL dan 80 μL NaCl, tabung 4 BSA sebanyak 30 μL dan NaCl 70 μL, kemudian tabung 5 berisi 50 μL BSA dan 50 μL NaCl, terakhir tabung 6 berisi 100 μL BSA dan 0 μL NaCl. Lalu reagen Bradford ditambahkan sebanyak 5,0 mL ke dalam masing-masing tabung. Tabung kemudian ditutup dengan alumunium foil dan dikocok isinya dengan membalikkan tabung perlahan-lahan beberapa kali. Biarkan selama 5 menit. Kemudian tabung 1 diisi sebagai “blanko”. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm untuk setiap tabung lainnya. Kurva standar dibuat antara absorbans 595 nm rata-rata terhadap konsentrasi protein.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan kadar protein sangat diperlukan untuk mengetahui jumlah protein yang terdapat dalam suatu bahan. Hal ini dilakukan, karena peran protein yang sangat penting bagi tubuh manusia. Analisis kadar protein, dapat menggunakan berbagai macam metode, akan tetapi pada praktikum kali ini, metode yang digunakan adalah metode Bradford dengan penetapan kurva standar. Hasil percobaan tertera pada tabel 1 dan tabel 2 dibawah ini.
Tabel 1 Absorbansi kurva standar BSA
Tabung Absorbansi terukur Absorbansi terkoreksi [BSA] mg/ml
1 0,694 0 0
Sampel Absorbansi terukur Absorbansi terkoreksi Protein mg/ml
1 0,751 0,057 0,1193
Contoh Perhitungan :
Faktor pengenceran = Volume sampel yang diambilVolume total = 5000500μLμL=10
Kadar protein sampel 1 Y = a + bx
Y = -0,1226 + 1,5047 x 0,057 = -0,1226 + 1,5047 x 0,1796 = 1,5047 x
X = 0,1193
Hasil percobaan kurva standar menunjukkan bahwa nilai absorbansi semakin meningkat seiring dengan penambahan volume BSA pada setiap tabung. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa semakin banyak volume NaCl atau semakin sedikit jumlah larutan BSA, jumlah protein yang terlarut akan semakin banyak, sehingga nilai absorbansinya semakin kecil. Data yang diperoleh, tabung 1 berisi 0 μL BSA dan 100 μL NaCl nilai absorbansi terukurnya 0, tabung 2 berisi 10 μL BSA dan 90 mL NaCL, nilai absorbansi terkoreksinya 0,122 , tabung 3 BSA sebanyak 20 μL dan 80 μL NaCl dengan nilai absorbansi terukur 0,170 kemudian tabung 4 BSA sebanyak 30 μL dan NaCl 70 μL nilai absorbansi yang diperoleh 0,231 lalu tabung 5 berisi 50 μL BSA dan 50 μL NaCl nilai absorbansi terukurnya 0,365 dan terakhir tabung 6 berisi 100 μL BSA dan 0 μL NaCl nilai absorbansi terukurnya 1,536. Hasil percobaan sesuai dengan teori, bahwa semakin banyaknya volume NaCl, protein yang terlarut akan semakin banyak, sehingga nilai absorbansinya kecil. Dari grafik, diperoleh persamaan regresinya y = 0.612x + 0.102 dengan ketepatan R² = 0.920 .
Kemudian hasil percobaan analisis kadar protein suatu sampel, didapatkan pada ulangan pertama sebanyak 0,1193 mg/ml, dan pada ulangan kedua 0,1147 mg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa dalam sampel tersebut, kadar proteinnya sangat sedikit.
oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin, triptofan, dan fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Setelah pengikatan tersebut, protein akan berwarna biru sehingga nilai absorbansinya bisa diukur dengan metode spektrofotometri. Jumlah CBB yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein (Wilson dan Walker 2000).
Penambahan NaCl 0,9% pada larutan BSA berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Jika NaCl yang ditambahkan semakin banyak, protein yang akan terlarut pun akan semakin banyak, sehingga pengompleksan antara protein dan zat warna Coomasie Briliant Blue (CBB) pada reagen Bradford semakin sedikit terjadi (Khopkar 2007).
Metode lain yang dapat digunakan untuk menganalisis kadar protein selain metode Bradford adalah metode Lowry dan metode biuret. Metode Lowry-Folin dilakukan untuk menganalisis protein terlarut dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 590 nm (Sumardji dalam Rahayu 2005). Sedangkan metode biuret menggunakan panjang gelombang 520 nm dengan larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) dalam berbagai variasi konsentrasi.
Kelemahan metode Bradford adalah reagen khususnya dapat mengakibatkan perbedaan respon tes untuk jenis protein yang berbeda. Hal tersebut membuat kita harus teliti dalam memilih protein yang akan diujikan. Sebaiknya, protein yang diuji adalah protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel yang akan diujikan. Metode ini kurang akurat untuk asam protein dasar. Selain itu, kelemahan lainnya adalah, kurangnya sensitivitas terhadap sampel yang hanya memilliki sedikit kandungan protein (Bradford 1976).
SIMPULAN
pada praktikum kali ini digunakan metode Bradford, dengan analisis kurva standar spektrofotometri.
DAFTAR PUSTAKA
Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis sukrosa dengan enzim invertase untuk produksi etanol menggunakan Zymomonas mobilis [skripsi]. Surabaya (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh November.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bending. Analitical Biochemistry. 72 :248-254.
Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Pr.
Rahayu A, Suranto, Purwoko T. 2005. Analisis karbohidrat, protein, dan lemak pada pembuatan kecap lamtoro gung (Leucaena leucocephala) terfermentasi Aspergillus oryzae. Bioteknologi. 2(1): 14-20.
Sumardjo, D. 2008. Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta (ID) : EGC. Wilson K, J Walker. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry
