BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan studi eksperimental untuk mengetahui terdegradasi atau tidaknya TEL dalam liposom EPC-TEL 2,5 oleh hepar mencit secara in vivo.
3.2. Identifikasi Variabel
Variabel bebas : Durasi liposom EPC-TEL 2,5 pada mencit C3H dari injeksi sampai pembedahan.
Variabel terikat : Terdegradasi atau tidaknya TEL dalam liposom EPC-TEL 2,5.
Dalam menentukan variabel bebas, peneliti menggunakan skala nominal (kontrol dan 1 jam). Untuk mengukur variabel terikat, peneliti menggunakan skala nominal (terdegradasi atau tidak).
3.3. Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di laboratorium Departemen Farmasi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia pada bulan Maret 2007 sampai dengan Maret 2008.
3.4. Definisi Operasional
Dalam penelitian ini, ada beberapa istilah yang harus dijelaskan secara eksplisit sehingga tidak menimbulkan salah persepsi dalam pemahamannya, antara lain:
• Degradasi adalah pemecahan suatu senyawa kimia kompleks menjadi senyawa-senyawa yang lebih kecil dan kurang kompleks, yang merupakan senyawa penyusunnya.
• In vivo merupakan suatu istilah untuk menyatakan ‘di dalam suatu organisme yang hidup’.
• Tetraeter lipid adalah suatu jenis lipid hasil ekstraksi dari archaea, yang pada penelitian ini berasal dari Thermoplasma acidophilum.
• EPC-TEL 2,5 adalah formulasi liposom yang mengandung lesitin/fosfatidil kolin kuning telur (egg yolk phosphatidyl choline = EPC) dan TEL 2,5 mol % dari Thermophilus acidophilum.
• Injeksi intraperitoneal adalah suatu metode penyuntikan untuk memasukkan suatu substansi ke dalam rongga peritoneal.
• Mencit merupakan hewan percobaan, yang digunakan dalam penelitian ini, yang berasal dari galur C3H.
• Rf merupakan jarak bercak dari titik awal dibagi jarak titik awal ke batas akhir elusi.
• Terdegradasi adalah jika pada kelompok perlakuan terdapat bercak selain bercak pada kontrol dengan TEL dengan Rf yang berbeda
• Tidak terdegradasi adalah jika seluruh bercak pada kelompok perlakuan mempunyai Rf yang sama dengan bercak pada kelompok kontrol dengan TEL.
3.5. Sampel Penelitian
Sampel penelitian ini adalah mencit galur C3H jantan dan betina hasil breeding di Departemen Patologi Anatomik FKUI.
3.6. Kriteria Inklusi
Kriteria inklusi sampel yang digunakan adalah mencit galur C3H berusia 12- 16 minggu dengan berat 18-24 g.
3.7. Besar Sampel
Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian induk. Penelitian induk merupakan penelitian mengenai stabilitas biologik TEL. Untuk mengetahui degradasi TEL secara kontinu, maka penelitian induk terbagi atas 5 kelompok perlakuan berdasarkan interval waktu yang berbeda yaitu kelompok yang diamati degradasi TELnya dalam hepar 30 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, dan 8 jam setelah injeksi liposom. Ditambah dengan kelompok kontrol, yaitu kelompok yang tidak diinjeksi liposom, maka sampel penelitian terdiri dari 6 kelompok.
Kemudian besar sampel penelitian ini dihitung dengan rumus Federer:
Keterangan:
n = jumlah sampel tiap kelompok t = jumlah kelompok
Dari rumus di atas dapat dilakukan perhitungan besar sampel sebagai berikut: t = 6, maka didapatkan: (n-1) (6-1) ≥ 15 (n-1) 5 ≥ 15 (n-1) ≥ 3 n ≥ 4
Dari hasil perhitungan di atas, jumlah mencit yang akan dijadikan sampel dalam penelitian ini adalah sebanyak 4 ekor untuk setiap kelompok. Sehingga jumlah total sampel pada penelitian induk adalah 24 ekor mencit.
Akan tetapi dalam penelitian yang penulis teliti, penulis hanya menganalisis dan membahas degradasi TEL pada 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan kelompok dengan perlakuan, yang diamati degradasi TELnya dalam hepar 1 jam setelah injeksi liposom. Sehingga jumlah hewan yang digunakan dalam penelitian penulis adalah sebanyak 8 ekor, terbagi dalam 2 kelompok, dengan masing-masing kelompok memiliki sampel 4 ekor mencit yang dipilih secara acak. Adapun kelompok perlakuan yang lain, diteliti oleh rekan peneliti yang lain.
Perlu diketahui bahwasanya kelompok kontrol merupakan kelompok pembanding yang digunakan bersama-sama sehingga kontrol yang digunakan oleh penulis merupakan sampel yang sama dengan yang digunakan oleh rekan peneliti lain yang tergabung dalam penelitian induk.
3.8. Alat dan Bahan Hewan coba:
• Delapan ekor mencit C3H jantan dan betina hasil breeding di Departemen Patologi Anatomik FKUI.
Bahan:
• Liposom EPC-TEL 2,5 (TEL dari Thermoplasma acidophilum diperoleh dari IFB Halle, Jerman; egg-yolk phosphatidylcholine (EPC) dari Lipoid®) • Kloroform • Etanol • Larutan Bufer PBS • Metanol • Etil asetat • NaOH 0,01M • Eter • Larutan NaCl 0,9% • Tembaga asetat 3% • Asam fosfat 8% • Gas N2 Alat: • Labu 250 mL • Beads
• Rotavapor-vacuum pump-waterbath Büchi • Alat sentrifugasi Sorvall Biofuge Primo • Tabung sentrifugasi
• Tabung kimia • Gelas ukur
• Micropipette Socorex
• Microliter Syringes Hamilton • Homogenizer Lurex®
• Kertas saring Whatman • Toples
• Chamber • Pipet
• Set alat bedah minor • Sarung tangan • Spuit 27 G • Timbangan gram • Timbangan milligram
• Timbangan mikrogram Mettler AE 200 • Lembar KLT silica gel 60 F254 Merck • Komputer dan scanner
• Oven • Hairdryer 3.9. Cara Kerja 6,19-21
Penelitian ini terdiri dari 4 gelombang dengan masing-masing gelombang menggunakan 2 mencit yaitu 1 mencit perwakilan dari setiap kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Kelompok kontrol adalah kelompok mencit yang diinjeksi larutan NaCl fisiologis secara intraperitoneal sebanyak 0,5mL dan segera dieuthanasia, kemudian diangkat heparnya. Sedangkan kelompok perlakuan yang penulis teliti adalah kelompok mencit yang diinjeksi TEL secara intraperitoneal sebanyak 0,5 mL dan dieuthanasia 1 jam setelah injeksi, kemudian diangkat heparnya.
Tahap cara kerja terdiri atas preparasi liposom, injeksi liposom pada mencit dan pengambilan hepar, ekstraksi hepar, preparasi kalibrasi, dan kromatografi lapis tipis. Liposom selalu dibuat baru pada setiap gelombang untuk menghindari adanya kesalahan dalam penyimpanan. Pada setiap gelombang dilakukan tahap cara kerja yang sama.
Terdapat beberapa cara kerja yang dilakukan bersama-sama dengan rekan peneliti lain yang tergabung dalam peneliti induk, yaitu tahap preparasi liposom dan kromatografi lapis tipis. Hal ini dilakukan semata-mata untuk alasan efisiensi waktu dan agar dapat mengetahui tingkat degradasi TEL pada setiap kelompok perlakuan secara runtun.
Preparasi liposom EPC-TEL 2,5 menurut metode yang dikembangkan oleh Purwaningsih:8
1. Menyiapkan labu ukuran 250 mL yang telah dicuci dengan air tanpa sabun berulang kali, setelah itu dibilas dengan etanol tehnis dan dikeringkan. 2. Menyediakan EPC dan TEL
EPC dan TEL disiapkan menurut kelompok yang tersedia pada penelitian induk yaitu terdiri dari 24 mencit, terbagi menjadi 6 kelompok (kontrol, perlakuan 1 (30 menit), perlakuan 2 (60 menit), perlakuan 3 (2 jam), perlakuan 4 (4 jam), dan perlakuan 5 (8 jam)). Pelaksanaan penyuntikan dibagi menjadi 4 gelombang, masing-masing terdiri dari 6 mencit yang merupakan perwakilan dari masing-masing kelompok.
Jumlah EPC dan TEL per gelombang dihitung untuk minimal jumlah sampel + (jumlah sampel x 10%), yaitu minimal 6 + (6 x 10%) = 7 mencit. Untuk meminimalisasi kemungkinan kesalahan dalam pengambilan bahan yaitu kurangnya pengambilan bahan, maka jumlah EPC dan TEL dihitung lebih dari sejumlah mencit yang dibutuhkan yaitu menjadi 8 mencit.
Perhitungan jumlah TEL yang dibutuhkan: • Berat molekul TEL ~ 1488,4
• 1 mol = BM / L = 1488,4 g/L • 1 mol = 1488,4 mg/mL • 1 mmol = 1,4884 mg/mL
• 0,1 mmol = 0,14884 mg/mL Maka jumlah TEL yang dibutuhkan per gelombang:
• 8 mencit x @ 0,1 mmol = 8 x 0,14884 mg = 1,1904 mg ≈ 1,2 mg Perhitungan jumlah EPC yang dibutuhkan:
• TEL = 2,5% EPC
• Sehingga mol EPC: mol TEL = 40:1
• TEL yang digunakan yaitu 0,1 mmol, maka EPC yang digunakan adalah 4 mmol @ mencit.
• 1 mmol EPC = 0,78 mg
Maka jumlah EPC yang dibutuhkan per gelombang:
• 8 mencit x @ 4 mmol = 8 x 4 x 0,78 mg = 24,46 ≈ 25 mg
3. Memasukkan EPC dan TEL (sesuai perhitungan), beads, dan campuran kloroform etanol 1:1 sebanyak 10 mL ke dalam labu.
4. Memutar labu dengan Rotavapor buchi.
• Mula-mula dengan kecepatan sedang dan tekanan 200 mBar.
• Setelah volume yang tersisa dalam labu menjadi setengah volume awal, kecepatan ditingkatkan dengan tekanan tetap.
• Ketika cairan sudah mulai kering, tekanan diturunkan bertahap sampai 30-40 mBar dan dibiarkan selama ± 1 jam.
• Saat beads sudah tidak bergerak, dibiarkan selama 1-2 jam.
• Setelah liposom kering, rotavapor dimatikan. Sebelum dimatikan tekanan dinaikkan sampai 960 mBar, kecepatan diturunkan, kemudian dimatikan.
5. Menyiapkan bufer PBS dengan pH 7,4. PBS yang dibutuhkan yaitu 0,5 mL tiap mencit. Sehingga banyaknya bufer PBS yang dibutuhkan per gelombang adalah 0,5mL x 8 = 4mL.
6. Memasukkan PBS ke dalam tabung untuk melarutkan liposom.
Tahap II – Injeksi Liposom pada Mencit dan Pengambilan hepar
1. Mengambil mencit dengan cara random sampling dan diberi nomor untuk identifikasi kelompoknya agar tidak tertukar dengan kelompok lain.
2. Menimbang dan mencatat berat mencit kelompok kontrol dan perlakuan (1 jam).
3. Menginjeksi liposom sebanyak 0,5 mL ke dalam mencit kelompok perlakuan secara intraperitoneal dan mencatat waktu injeksi.
4. Mengeuthanasia mencit kelompok perlakuan dengan eter 1 jam setelah injeksi intraperitoneal.
5. Mengambil hepar mencit dengan membedahnya.
7. Menimbang hepar dan mengambil sebanyak 200 mg tiap sampel, kemudian dikemas dalam alumunium foil lalu disimpan dalam wadah berisi dry ice dan dimasukkan dalam freezer.
8. Menginjeksi NaCl 0,9 % sebanyak 0,5 mL ke dalam mencit kelompok kontrol secara intraperitoneal.
9. Mengeuthanasia mencit kelompok kontrol dengan eter segera setelah injeksi intraperitoneal.
10. Mengambil hepar mencit dengan membedahnya
11. Meneteskan NaCl 0,9 % secukupnya pada hepar selama pembedahan. 12. Menimbang hepar
13. Hepar dipotong dan diambil 2 potongan dengan berat masing-masing 200 mg. Potongan pertama dinamakan kontrol, sedangkan potongan kedua dinamakan kontrol dengan TEL. Kontrol dengan TEL merupakan hepar mencit kelompok kontrol yang akan ditambahkan TEL secara in vitro pada saat proses homogenasi.
14. Hepar dikemas dalam alumunium foil lalu disimpan dalam wadah berisi dry ice dan dimasukkan dalam freezer.
15. Data mengenai berat mencit keseluruhan dan berat heparnya terlampir (Lampiran 2.).
Tahap III -- Ekstraksi hepar
1. Menghomogenasi masing-masing hepar yang telah disiapkan pada tahap II dengan homogenizer Lurex.
2. Khusus pada hepar kontrol dengan TEL, ditambahkan 0,5 mL liposom EPC-TEL 2,5secara in vitro dan kemudian dihomogenasi.
3. Menyiapkan 2 mL metanol, kemudian meneteskannya sedikit demi sedikit ke dalam homogenizer selama proses homogenasi.
4. Melakukan sentrifugasi terhadap hepar yang telah terhomogenasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit.
5. Memisahkan antara supernatan dan residu dari hasil sentrifugasi tersebut, kemudian diberi label supernatan I dan residu I.
7. Menyiapkan 2 mL metanol, kemudian meneteskannya sedikit demi sedikit ke dalam homogenizer selama proses homogenasi pada residu I.
8. Melakukan sentrifugasi residu I dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit.
9. Melakukan pemisahan kembali antara supernatan dan residu, kemudian diberi label supernatan II dan residu II.
10. Mencampurkan supernatan I dan II kemudian dikeringkan dengan gas N2, yang disebut residu III.
11. Melarutkan residu III dengan 1,5 mL etil asetat dan 0,5 NaOH 0,01 M, yang disebut supernatan III.
12. Melakukan sentrifugasi terhadap supernatan III dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit.
13. Melakukan pemisahan kembali antara supernatan dan residu, kemudian diberi label supernatan IV dan residu IV.
14. Mengeringkan supernatan IV dan residu IV dengan gas N2, yang kemudian diberi label supernatan V dan residu V.
Tahap IV -- Persiapan Kalibrasi
1. Pada awalnya, kalibrasi dibuat dengan mengunakan TEL dengan konsentrasi 75 µg, 150 µg, dan 300 µg.
TEL yang tersedia adalah 15,2 mg dalam 10,1 mL, maka untuk mendapatkan konsentrasi 75 µg, 150 µg, dan 300 µg digunakan perhitungan: 15,2 mg TEL dalam 10,1 mL maka
1 mL = 15,2 mg/10,1 mL = 1,504 mg/mL X = volume yang dibutuhkan
X/1mL x 1,504 mg = 75 µg X/1mL x 1,504 mg = 75 mg x 10-3 X = 75/1,504 mL x 10-3
X = 49,8670212 mL x 10-3 X ≈ 50 mL.
Dapat simpulkan bahwa tiap pengambilan 50 µL didapatkan konsentrasi TEL sebesar 75 µg. Maka:
• untuk kalibrasi 75 ug dibutuhkan 50 µL. • untuk kalibrasi 150 ug dibutuhkan 100 µL. • untuk kalibrasi 300 ug dibutuhkan 200 µL.
Sebelum penelitian yang penulis lakukan, terdapat uji pendahuluan. Pada pengujian tersebut TEL dengan konsentrasi 75 µg, 150 µg, dan 300 µg diaplikasikan pada Lembar KLT. Hasil pengujian menunjukkan bercak TEL tidak terlihat jelas. Agar bercak TEL dapat terlihat lebih jelas maka konsentrasi kalibrasi dinaikkan 100 µg, 200 µg, dan 300 µg.
2. Menyiapkan kalibrasi dengan konsentrasi 100 µg, 200 µg, dan 300 µg. TEL yang tersedia adalah 90 mg dalam 4,5 mL campuran kloroform-metanol 2:1, maka untuk mendapatkan konsentrasi 100 µg, 200 µg, dan 300 µg, digunakan perhitungan:
90 mg TEL dalam 4,5 mL maka X = volume yang dibutuhkan X/4,5 mL x 90 mg = 100 µg X/4,5 mL x 90 mg = 100 mg x 10-3 X = 450/90 mL x 10-3
X = 5 mL x 10-3 X = 5 µL.
Dapat simpulkan bahwa tiap pengambilan 5 µL didapatkan konsentrasi TEL sebesar 100 µg. Maka:
• untuk kalibrasi 100 µg dibutuhkan 5 µL. • untuk kalibrasi 200 µg dibutuhkan 10 µL. • untuk kalibrasi 300 µg dibutuhkan 15 µL.
Akan tetapi setelah di aplikasikan pada Lembar KLT, bercak TEL pada konsentrasi 100 µg kurang terlihat jelas pada semua gelombang kecuali pada gelombang 4. Sehingga agar bercak TEL bisa tampak lebih jelas, konsentrasi kalibrasi TEL yang digunakan adalah 200 µg, 300 µg, dan 400 µg.
3. Menyiapkan kalibrasi menggunakan TEL dengan konsentrasi 200 µg, 300 µg, dan 400 µg.
4. TEL yang tersedia adalah 150 mg dalam 1 mL. Lalu TEL diambil 0,1 mL (15 mg), kemudian diencerkan dengan penambahan campuran kloroform-metanol 2:1 sebanyak 0,65 mL. Sehingga didapatkan 0,75 mL = 15 mg. Maka untuk mendapatkan konsentrasi 200 µg, 300 µg, dan 400 µg, digunakan perhitungan:
X = volume yang dibutuhkan X/0,75 mL x 15 mg = 200 µg X/0,75 mL x 15 mg = 200 mg x10-3 X = 200 x 0,75 µL/15 = 10 µL
Dapat disimpulkan bahwa tiap pengambilan 10 µL didapatkan konsentrasi TEL sebesar 100 µg. Maka:
• untuk kalibrasi 200 µg dibutuhkan 10 µL. • untuk kalibrasi 300 µg dibutuhkan 15 µL. • untuk kalibrasi 400 µg dibutuhkan 20 µL Tahap V – Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Untuk melihat ada atau tidaknya degradasi pada TEL, maka dilakukan KLT. Pada tahap V ini, aplikasi KLT dilakukan bersama-sama pada lembar KLT yang sama dengan semua kelompok pada penelitian induk agar ada atau tidaknya degradasi TEL pada semua kelompok dapat terlihat secara berurutan.
1. Menyiapkan lembar KLT dengan ukuran seperti dibawah ini Gambar 4. Lembar KLT Keterangan gambar: a. Sumur 1 : Kalibrasi 1 * b. Sumur 2 : Kalibrasi 2 * c. Sumur 3 : Kalibrasi 3 * d. Sumur 4 : Kontrol*
e. Sumur 5 : Kontrol dengan TEL* f. Sumur 6 : Perlakuan 30 menit g. Sumur 7 : Perlakuan 1 jam * h. Sumur 8 : Perlakuan 2 jam i. Sumur 9 : Perlakuan 4 jam j. Sumur 10 : Perlakuan 8 jam
* Merupakan sumur yang penulis analisis dan akan dibahas di bab selanjutnya.
2. Mengeringkan lembar KLT dengan aliran udara panas (hairdyer).
3. Mengaplikasikan kalibrasi sesuai dengan konsentrasi yang telah ditentukan diatas ke dalam sumur.
4. Melarutkan supernatan V kelompok kontrol, kontrol dengan TEL, dan perlakuan dengan 300 µL campuran kloroform-metanol 2:1.
5. Mengaplikasikan supernatan yang telah dilarutkan sebanyak 20 µL ke dalam sumur yang sesuai menggunakan microliter syringe Hamilton.
6. Menyiapkan chamber dan tutupnya dengan ukuran yang sesuai. 7. Menyiapkan eluen berupa campuran kloroform-etanol 6:4.
Merujuk pada penelitian terdahulu mengenai liposom EPC-TEL 2,5 yang dilakukan oleh Purwningsih, pada awalnya eluen/ fase gerak yang digunakan pada penelitian ini adalah campuran kloroform-etanol dengan perbandingan 9:1. Namun pada pengujian yang dilakukan sebelum penelitian ini didapatkan bahwa dengan perbandingan eluen 9:1, bercak lipid naik terlalu cepat sehingga melewati garis batas akhir elusi. Untuk mengatasnya, maka perbandingan eluen diubah menjadi 6:4.
8. Menyiapkan tembaga asetat 3% dan asam fosfat 8% sebagai pewarna. 9. Memasukkan kertas saring ke dalam chamber dengan posisi diatur
sedemikian rupa agar melapisi alas dan dinding chamber
10. Memasukkan eluen ke dalam chamber lalu tutup chamber dan tunggu hingga kertas saring menjadi jenuh
11. Memasukkan dan memposisikan lembar KLT sedemikian rupa kedalam chamber sehingga sumur-sumur yang berisi kalibrasi dan sampel tidak tercelup.
12. Menutup chamber dengan rapat dan mengamati dengan seksama pergerakan eluen pada lembar KLT.
13. Mengangkat lembar KLT ketika eluen telah mencapai garis akhir yang ditentukan
14. Mengeringkan lembar KLT
15. Mencelupkan lembar KLT ke dalam pewarna selama 10 detik 16. Mengeringkan lembar KLT pada suhu ruangan hingga kering
17. Memasukkan lembar KLT ke dalam oven selama 10 menit dengan suhu 180°C. Karena berdasarkan penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Purwaningsih, bercak TEL tidak muncul sebelum dipanaskan dengan suhu 180°C.
18. Mengeluarkan lembar KLT dari dalam oven.
19. Melakukan pemindaian lembar KLT dengan menggunakan scanner.
20. Mengolah data yang diperoleh dari hasil pemindaian dengan menggunakan program Adobe Photoshop 7.0.
21. Menilai hasil yang tampak pada lembar KLT dan menganalisisnya.
3.10. Manajemen dan Analisis Data Tabel 2. Manajemen dan Analisis Data
Langkah Jawaban
1 Variabel yang dihubungkan Variabel yang dihubungkan adalah durasi liposom pada mencit (nominal) dan terdegradasi atau tidaknya TEL (nominal)
2 Jenis hipotesis Komparatif
3 Masalah skala variabel Kategorik
4 Berpasangan / tidak berpasangan Tidak berpasangan
5 Jenis tabel B x K 2 x 2
Kesimpulan: Jenis tabel pada penelitian ini adalah 2 x 2. Uji yang digunakan adalah uji chi square bila memenuhi syarat. Bila tidak memenuhi uji chi square, maka akan dilakukan Fisher.
Akan tetapi pada penelitian ini hasil yang diperoleh tidak dapat dianalisis secara statistik sehingga tidak ada uji hipotesis yang digunakan.
3.11. Masalah Etika
Sampai saat ini di Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI) belum terdapat komisi etik yang menangani penelitian yang menggunakan subjek hewan. Di FKUI hanya terdapat komisi etik yang menangani penelitian dengan objek manusia. Sehingga surat persetujuan etik untuk penelitian ini belum dapat diperoleh.
