BAB II TINJAUAN PUSTAKA

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Pembawa Obat

Pembawa obat (drug carrier) adalah substansi yang digunakan untuk peningkatan efektivitas dan pencapaian obat ke sel sasaran.15 Pembawa obat ini digunakan dengan tujuan mengontrol lama kerja aksi obat di dalam sel, menurunkan metabolisme obat, dan mengurangi toksisitas obat.

Contoh-contoh pembawa obat adalah:

 Liposom

 Microspheres, terbuat dari asam polymer poly (lactic-co-glycolic) yang dapat terbiodegradasi

 albumin microspheres

 Polimer sintetik terlarut

 Kompleks protein DNA

 Konjugat protein

 Eritrosit

II.2 Liposom

II.2.1 Struktur Liposom

Liposom merupakan suatu vesikel membran yang dibentuk dengan cara mendispersikan suatu lipid, terutama fospolipid, ke dalam media cair dan memiliki sifat-sifat yang memenuhi persyaratan sebagai pembawa obat (drug-carrier) atau vehikulum.3,6

Struktur liposom pertama kali ditemukan oleh Alec Bangham dari Cambridge pada awal tahun 1960, namun liposom sebagai pembawa obat telah dipatenkan pada tahun 1943 berupa campuran air antara lesitin dan kolesterol. Sebagai pembawa obat,

liposom dapat membawa molekul obat dengan berbagai cara yaitu, terikat dengan membran liposom, terinterkalasi di antara dwilapis lipid, terlarut dalam dwilapis lipid atau terlarut di dalam vesikel.3

Fosfolipid merupakan komponen struktural membran biologik yang terutama terdiri atas fosfstidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin dan fosfatidilinositol.

15-18

.Fosfolipid yang lazim digunakan pada pembutan liposom konvensional adalah lesitin (fofatidilkolin) dari kuning telur (Egg-yolk Phosphatidylcholine = EPC), jaringan otak, kedelai (Soy-bean Phosphatidylcholine = SPC) atau yang dibuat secara sinetik lipid bermuatan seperti fosfatidilserin atau fosfatidilgliserol seringkali di tambahkan sebagai stabilisator. 20 Lipid yang dapat digunakan sebagai stabilisator membran liposom, yang saat ini masih belum banyak digunakan adalah tetra eter lipid (TEL) dari membran sel Archea, yaitu antara lain Thermoplasma acidhopilum

20-21

dan Sulfolobus acidocaldarius.25

Diameter atau ukuran liposom sangat ditentukan oleh beberapa hal, antara lain 1) jenis lipid dan kombinasinya.2) keseimbangan antara energi untuk membuka membran liposom, elastisitas kelengkungan liposom dan jumlah energi yang tersebar , dan 3) cara pembuatan. Ukuran liposom bervariasi antara 20 nm hingga 100 nm dengan ketebalan dwilapis lipid sebesar 4 nm. Untuk aplikasi di bidang kedokteran, digunakan liposom berukuran 80-200 nm dan harus memenuhi persyaratan yang meliputi: konsentrasi lipid dan obat, distribusi ukuran liposom, persentase molekul obat bebas yang tidak terinkoporasi pada membran liposom, pH < osmolaritas, konduktivitas, adanya kemungkinan produk hasil degradasi, endotoksin dan parameter-parameter lainnya.6

Persyaratan lain untuk penggunaan liposom sebagai pembawa obat adalah stabil baik secara fisik, kimia maupun biologi. 15,24

Kelarutan obat dalam air atau dalam lipid berpengaruh pada inkoporasi serta derajat retensi obat di dalam liposom. Obat yang bersifat hidrofil dengan koefisien partisi oktanol terhadap air (log P oct) < 1,7 akan tertahan di dalam fasa air bagian dalam atau di dalam vesikel dan akan dilepaskan secara lambat dalam beberapa jam atau hari. Obat dengan log Poct > 5 atau bersifat hidrofob, akan berada di antara fasa

dalam hidrofob lapisan dwilapis lipid yang diretensi dengan sempurna dalam liposom.27

II.2.2. Penggunaan Liposom

Banyak penelitian menyebutkan keuntungan penggunaan liposom namun dibutuhkan penelitian lanjutan untuk melihat stabilitas liposom tersebut. Berbagai contoh penggunaan liposom sebagai pembawa obat yang di peroleh dari berbagai hasil penelitian :

1). Penyuntikan liposom-metilprednisolon (L-MPL) 2mg/kgBB, IV pada tikus jantan dewasa galur Spraque-Dawley dibandingkan dengan metilprednisolon (MPL) berbentuk larutan pada dosis yang sama menunjukkan, bahwa distribusi obat di berbagai organ, 1 jam setelah penyuntikan, kadar MPL jauh lebih tinggi di limpa, timus, ginjal dan terutama di hepar, dibandingkan dengan L-MPL. Hal ini disebabkan karena kemampuan penetrasi L-MPL ke jaringan lebih lambat akibat besarnya ukuran partikel. Namun, kadar MPL cepat menurun hingga setengahnya dan tidak terdeteksi lagi setelah 6 jam, sedangkan kadar L-MPL tetap tinggi atau menurun secara perlahan-lahan dan masih terdeteksi setelah lebih dari 5 hari di limpa, timus dan hepar. Kadar L-MPL tidak terdeteksi lagi di paru-paru, jantung, otot, dan ginjal setelah 4 jam penyuntikan. Kedua bentuk sediaan tersebut tidak terdeteksi kadarnya di dalam sumsum tulang dan otak 32.

2). Pemberian L-MPL dengan dosis tersebut terbukti memperpanjang waktu paruh dari 0,48 jam untuk MPL menjadi 30,13 jam untuk LMPL, meningkatkan volume distribusi dari 2,1 menjadi 21,87 L/kgg. Kadar obat dalam volume distribusi meningkat dari 339 menjadi 1093 ng/jam/mL. Dosis terapi efektif L-MPL pada tikus pasca transplantasi jantung hanya sebesar 2 mg/kgBB/hari dan cukup diberi 2 kali seminggu.33-35

3). Pada uji multi sentra terhadap kasus medilteranian visceral leishmaniasis pada anak dan dewasa, pemberian liposom-amfoterisin B (AmBisome) sebesar 1-1,38 mg/kg/hari selama 21 hari atau 3 mg/kg/hari selama 10 hari mennunjukan perbaikan gejala tanpa efek samping yang berarti dan tanpa timbul gejala ulangan dalam masa observasi selama 2 tahun. Sebagai perbandingan, angka kejadian (insiden) toksisitas, yang dinyatakan dengan LD pada mencit, adalah LD amfoterisin B dalam bentuk bebas sebesar 1 mg/kgBB, sedangkan AmBisomer 175 mg/kgBB.30-31

4). Pemberian liposom-sikloprosin (L-CsA) sebesar 1,755 mg/kg/hari selama seminggu pada tikus jantan dewasa galur Lewis pasca transplantasi hati, ketahana hidup diperpanjang hingga 92,6 hari. Delapan puluh % di antaranya tetap bertahan hingga 100 hari, dibandingkan dengan kontrol yang hanya mendapat siklosporin dengan dosis yang sama. Ketahanan hidup dari 50% tikus dalam kelompok kontrol, hanya selama 51,33 hari. Ambilan obat L-CsA oleh hati pada 2 jam setelah penyuntikan, lebih tinggi secara bermakna dibandingkan dengan kontrol. Toksisitas siklosporin pad ginjal yang diuji berdasarkan kadar kreatinin serum secar serial menurun secar bermakna pada L-CsA dibandingkan dengan kontrol 5.

5).Liposom juga berfungsi sebagai imunoajuvan yang lebih menguntungkan dibandingkan dengan ajuvan lain 36 karena :

 Tidak toksik , mudah berikatan/ berinteraksi dengan bahan-bahan alami, mudah didegredasi.

 Komposisi liposom dapat diubah-ubah sesuaikebutuhan , bisa bersifat tidak imunogenik atau sebaliknya.

 Bila diperlukan, dapat dikombinasi dengan ajuvan lain untuk meningkatkan respon imun yang sangat kuat.

 Mudah dibuat dan lebih murah dibandingkan dengan Zat pembawa obat lainnya.

 Dapat mengubah zat nonimunogenik menjadi imunogenik sehingga antigen yang dibutuhkan hanya dalam jumlah kecil.

 Dapat berinkoporasi dengan antigen hidrofobk dan antigen multipel.  Dapat menurunkan dan mengeliminasi toksisitas antigen yang bersifat

toksik dan rekasi alergi terhadap protein non-toksik  Dapat mengatur sistem imun dan menginduksi imunitas

 Memproduksi antibodi fungsional yang cukup tinggi sepanjang jangka waktu antibodi yang lazim.

6). Liposom juga sebagai zat pembawa obat yang ideal untuk zat yang berefek sebagai aktivator makrofag atau disebut sebagai imunomodulator pada fase tumorisid, virosid ataupun mikrobisid yang dapat dignakan untuk terapi pada berbagai kanker dan infeksi parasit. Salah satu imunomodulator yang tidak toksik dan digunakan sebagai pemacu respons imun adalah MDP (muramyl dipeptide, suatu fraksi terkecil dari dinding luar mikrobakteri). Kombinasi liposom –MDP (L-MDP) dengan 5-fluroasil (5-FU) atau 5-fluoro-2-deoksi uridin (FEDR) meningkatkan efek kedua antitumor tersebut. L-MDP bekerja secara sinergis dengan keduanya 36. MDP juga dapat meningkatkan efisiensi enkapsulasi, bahkan dapat mengubah respon imun dari timus independen menjadi timus dependen. Aktivator lain yang agak toksik namun toksisitasnya berkurang apabila tersedia dalam bentuk liposom antara lainadalah interleukin 2 (IL2) dan interferon-γ.38

7). Saat ini liposom juga dimanfaatkan sebagai bahan pembawa untuk terapi gen berbagai komposisi liposom dan modifikasinya telah diujikan agar gen yang dimaksud langsung mencapai sel sasaran 39-40.

Namun demikian, liposom sendiri dapat atau dimungkinkan menjadi antigen yang akan dirusak oleh sistem imun apabila di dalam komposisinya, terdapat sfingolipid, kardiopilin, kolestrol dalam jumlah tinggi, lebih dari 71 mol %.36

II.3 Thermoplasma acidophilum dan Tetraeter Lipid II.3.1 Thermoplasma acidophilum

Thermoplasma acidophilum (Th.acidophilum) merupakan archaebacterium asidophilik dengan pertumbuhan optimum pada suhu 590C antara pH 1-2. Membran dari Th.acidophilum terdiri dari 3 fraksi utama: lipid apolar, glikolipid dan glikophospholipid. Struktur dasar dari lipid membran adalah sebuah diphytanylglyceroltetraether berasal dari dua cincin C40 isoprenoid. Membran lipid

bipolar ini membentuk liposom yang stabil hingga diameter minimum (150 nm). Liposom dengan fosfolipid utama dari Thermoplasma acidophilum (Th.acidophilum) ini tidak dihancurkan oleh agen oksidasi dan hidrolisis seperti asam. Resistensi liposom dari fosfolipid utama terhadap keasaman dan impermeabilitas terhadap proton dapat melindungi kandungan yang labil melewati pH asam selama di lambung, seperti protein dan peptida. Liposom sebagai kapsul dapat memungkinkan bahan-bahan yang labil melewati rute gastrointestinal. Pada penelitian yang dilakukan oleh Freisleben, dkk pada sel hidup membuktikan bahwa TEL dari Th.acidophilum tidak bersifat toksik dan antimutagenik.41

II.3.2 Tetraeter Lipid

TEL adalah salah satu produk hasil ekstrasi dari Archaea terutama yang berasal dari Thermoplasma acidophilum21-22, telah teruji tidak toksik dan tidak bersifat mutagenik atau antimutagenik, baik in vitro maupun in vivo41-42. TEL yang berasal dari Sulfolobus acidocaldarius, walaupun sudah digunakan dalam penelitian, namun belum teruji toksisitas seperti pada Thermoplasma acidophilum.

Lipid hasil ekstraksi membran dari Archae ini, misalnya Thermoplasma acidophilum dan Sulfolobus acidocaldarius, berbeda secara nyata bila dibandingkan dengan fosfolipid pada membran sel lain yang membentuk dwilapis lipid (lipid bilayer). Fosfolipid tersebut berupa eter-gliserol atau derivat poliol lain, seperti

nonitol pada membran spesies Sulfolobus, membentuk satu lapisan lipid (lipid monolayer) yang tampak pada gambar.

Struktur membran tanpa ikatan rangkap ini mempunyai gugus metil samping yang sebagian membentuk pentasiklik, tanpa atau dengan residu fosfat yang terikat melalui ikatan ester. Ikatan eter-gliserol sangat resisten terhadap hidrolisis pada pH rendah sehingga memberi keuntungan lain dibandingkan dengan ikatan ester. Ketiadaan ikatan rangkap dalam strukur TEL akan meningkatkan resistensi terhadap oksidasi, sedangkan adanya gugus metil samping akan menambah efek fluiditas. Karena itu, liposom satu lapisan lipid (monolayer) yang dibentuk dari tetraeter lipid (TEL) dari Archaea tersebut, bersifat stabil dengan ikatan yang cukup erat.20-22, 43

Membran Thermoplasma acidophilum terutama terdiri atas cincin dasar tetraeter. Pada suhu tinggi, 59oC, akan terbentuk pentasiklik secara simetris di antara rantai hidrokarbon yang lebih stabil dan menurunkan derajat rotasi bebas membran karena membran menjadi tebal. Perbedaannya dengan Sulfolobus acidocaldarius terletak pada jenis poliol dimana poliol pada Sulfolobus acidocaldarius dikenal sebagai nonitol.43

TEL dari membran Sulfolobus acidocaldarius dapat berupa caldarchaeol dan calditoglycerocaldarchaeol. Bergantung pada kondisi pertumbuhannya, terutama suhu, TEL tersebut dapat mempunyai beberapa gugus pentasiklik. Karakterisasi dengan NMRS dan MS menunjukkan bahwa kalditol pada gugus kalditogliserokaldarkeol dari Sulfolobus acidocaldarius bukanlah nonitol 2-(1’,2’,3’-trihidroksipropil)1,2,3,4,5,6-heksahidroksi-heksan, melainkan 2-hidroksimetil 1-(2,3 dihidroksipropoksi)2,3,4,5 siklopentana tetraol dengan ikatan eter yang resisten terhadap BCl3 (borotrichloride), tetapi sensitif terhadap reaksi degradasi oleh HI

(hydrogen iodide) dan akan membentuk 2-hidroksimetil-1,2,3,4,5-siklopentana pentaol, pada suhu 100oC dalam waktu 50 jam. Kalditol dengan ikatan eter tersebut diperkirakan sangat berperan dalam sifat resistennya terhadap suhu tinggi dan suasana asam. Kedua jenis TEL tersebut dapat dideteksi pada Silica gel 60 HPTLC yang teraktivasi, menggunakan peluruh kloroform-etanol 9:1 dan diwarnai dengan reagen Dittmer.43

Hingga saat ini belum ada satupun bukti tentang mekanisme interaksi TEL dengan membran sel hidup. Dugaan sementara dari hasil penelitian secara in vitro, interaksi TEL dengan membran sel adalah secara fusi membran, pertukaran lipid antarmembran dan endositosis. Demikian pula halnya dengan degradasi TEL di dalam sel yang hingga kini belum dapat dijelaskan dengan baik karena produk standar hasil degradasi TEL belum tersedia.20,43-44

Uji stabilitas liposom yang hanya terdiri atas TEL Thermoplasma acidophilum saja menunjukkan bahwa TEL ini cukup stabil pada pH rendah dibandingkan pada pH netral ataupun alkalis yaitu selama 109 minggu pada suhu 4-8oC dan 10 minggu pada suhu 100oC. Kombinasi TEL dan lesitin telur dari berbagai rasio yaitu 75:25, 50:50 ataupun 25:75 menunjukkan kestabilan yang cukup tinggi hingga hari ke 622 pada suhu 4-8oC. Uji stabilitas liposom TEL diukur berdasarkan ukuran partikel dengan menggunakan particle sizer dan uji penglepasan karboksifluoresens dari membran liposom.44

Ukuran partikel liposom TEL, terutama dari Thermoplasma acidophilum, sangat bervariasi bergantung pada cara pembuatannya. Dengan menggunakan French Pressure Cell, ukuran liposom hanya berkisar antara 120 nm, sedangkan yang dibuat dengan cara pengocokan menggunakan tangan (hand-shaken), ukuran liposom sangat besar hingga mencapai 7500 nm. Liposom hasil pengocokan dengan tangan dapat diperkecil dengan cara a) sonifikasi, menghasilkan liposom berukuran sekitar 600 nm, b) dialisis dengan detergen, membentuk liposom berukuran sebesar 370-450 nm dan c) ekstrusi melalui membran polikarbonat berpori 200 nm, sehingga ukuran liposom akan menjadi sekitar 220 nm.

Hasil penelitian terbaru dari Patel dkk.45 Pada archaeosome, yaitu liposom yang terbuat dari membran Archaea lain yaitu Methanosarcina mazei, Methanobacterium espanolae dan Thermoplasma acidophilum menunjukkan bahwa vesikel multilamellar (multilamellar vesicle=MLV) dari Thermoplasma acidophilum in vitro paling stabil diantara ketiga jenis Archaea tersebut. Uji stabilitas yang dilakukan adalah untuk membuktikan bahwa 1) daya untuk menahan penglepasan

14

2,0; 2,5; dan 6,2 dalam waktu 90 menit, pada suhu 37oC. 2) keutuhan vesikel terhadap paparan lipase pankreas dan zat yang mirip empedu manusia masih berkisar 13% setelah 90 menit pada pH 6,2. Penelitian ini juga membuktikan bahwa MLV dari ketiga jenis membran Archaea lebih stabil daripada bentuk ULV (unilamellar vesicle). Hasil tersebut nantinya akan dikembangkan untuk pembentukan sediaan oral dengan archaeosome sebagai zat pembawa obat.45

Pada beberapa penelitian lain tentang kombinasi TEL Thermoplasma acidophilum dan EPC dibuktikan, bahwa liposom hasil kombinasi tersebut, baik pada rasio 25:75 ataupun 50:50, akan menambah muatan negatif pada permukaan membran liposom, sehingga liposom tetap stabil. Uji stabilitas berdasarkan ukuran partikel dengan nilai batas stabilitas sebesar 50% ini menunjukkan, bahwa pada suhu 4-8oC liposom tetap stabil hingga 622 hari walaupun ukuran partikel liposom membesar hingga 33% dari awal penyimpanan.45

II.4 Keseimbangan Cairan Tubuh

Sekitar enam puluh persen berat total tubuh tersusun oleh cairan.46 Angka ini bervariasi antara individu, bergantung pada seberapa banyak lemak (yaitu jaringan dengan kadar H2O yang lebih rendah) yang mereka miliki. Dua pertiga H2O tubuh

terdapat di cairan intrasel (CIS) dan sepertiga sisanya terdapat di cairan ekstrasel (CES) yang terdistribusi antara plasma (20% dari CES) dan cairan interstisium (80% dari CES).

Karena semua konstituen plasma dapat dipertukarkan secara bebas menembus dinding kapiler, komposisi plasma dan cairan interstisium nyaris identik, kecuali bahwa cairan interstisium tidak mengandung protein plasma. Sebaliknya komposisi CES dan CIS sangat berbeda karena sawar membran sel sangat selektif dalam menentukan bahan-bahan apa yang dapat dimasukkan ke atau dikeluarkan dari sel.

Salah satu komponen CES dan CIS adalah elektrolit. Walaupun terdapat dalam tubuh dengan kadar rendah, elektrolit mempunyai fungsi penting dalam keseimbangan cairan dan asam basa tubuh. Seperti terlihat pada Gambar 1,

komponen elektrolit yang penting untuk homeostasis adalah Na+, Cl-, K+, Mg2+, dan HCO3-.

Gambar 1. Cairan Elektrolit Tubuh47

II.5 Kalsium Klorida (CaCl2)

Kalsium klorida (CaCl2) adalah senyawa ionik yang terdiri dari unsur kalsium

dan klorin. Senyawa ini sangat larut air dan merupakan garam padat pada suhu kamar. CaCl2 dapat diproduksi langsung dari batu kapur.48

CaCl2 dapat digunakan sebagai sumber ion kalsium dalam larutan karena senyawa

kalsium sendiri tidak larut dalam air.48

3 CaCl2(aq) + 2 K3PO4(aq) → Ca3(PO4)2(s) + 6 KCl(aq)

CaCl2 dalam bentuk larutan dapat dielektrolisis untuk mendapatkan logam

kalsium

CaCl2(l) → Ca(s) + Cl2(g)

CaCl2 dapat diinjeksi sebagai terapi intravena pada kasus hipokalsemia, dapat

pula digunakan pada kasus gigitan atau sengatan serangga, reaksi hipersensitivitas (misal urtikaria), intoksikasi magnesium serta pada resusitasi jantung, khususnya setelah open heart surgery. Kalsium parenteral dapat digunakan ketika efinefrin gagal bekerja atau terjadi kontraksi miokardial yang tidak efektif. 48

CaCl2dapat membantu memproteksi miokardium dari tingginya kadar kalium

serum (hiperkalemia). CaCl2 juga dapat digunakan secara cepat mengobati

toksisitas terhadap Calsium Channel Blocker, akibat efek samping obat seperti Diltiazem (Cardizem), sehingga membantu menghindari potensi terjadinya serangan jantung.48

Bentuk cair dari CaCl2 digunakan dalam transformasi genetik sel, yaitu

meningkatkan permeabilitas membran sel.48

Pemberian CaCl2 adalah metode tercepat dalam meningkatkan kadar kalsium

terlarut dalam tubuh. 48

II.6 Alat dan Metoda untuk Mengubah Ukuran Liposom

Ukuran liposom dapat diubah dengan menggunakan beberapa cara, diantaranya adalah dengan metode ekstrusi, menggunakan alat Avestin extruder, dan metoda sonikasi.

II.6.1 Sonikasi

Penghancuran suspensi vesikel multilamelar yang besar (LMV) dengan menggunakan energi suara (sonikasi) biasanya menghasilkan vesikel unilamelar yang kecil (SUV) dengan diameter berkisar antara 15-50 nm. Peralatan yang paling umum untuk persiapan partikel yang akan disonikasi adalah kontainer yang berisi air dan probe tip sonicators. Sonikator tipe cup-horn walaupun jarang digunakan secara luas, berhasil memproduksi SUV. Probe tip sonicators menghantarkan input energi yang tinggi kepada suspensi lemak tetapi panas yang berlebihan membuat suspensi mengalami degradasi. Sonication tips juga cenderung melepaskan partikel-partikel titanium ke dalam suspensi lipid yang harus disingkirkan dengan menggunakan

sentrifugasi. Dengan alasan-alasan ini, bath sonicators merupakan peralatan yang paling sering digunakan dalam preparasi SUV. 49

Gambar 2. Bath Sonicator

Sonikasi partikel LMV dilakukan dengan menempatkan tabung sampel yang mengandung partikel suspensi ke dalam bath sonicators (atau menempatkan tip sonicator dalam tabung sampel) dan disonikasi selama 5-10 menit di atas temperatur transisi dari gel ke cairan. Suspensi lipid harus segera diklarifikasi untuk menghasilkan larutan yang sedikit berkabut. Kabut ini diakibatkan karena penyebaran cahaya yang diinduksi oleh partikel-partikel residu yang besar dalam larutan suspensi. Partikel-partikel ini dapat disingkirkan dengan sentrifugasi untuk menghasilkan suspensi SUV yang jernih. Ukuran rata-rata dan distribusi dipengaruhi oleh komposisi dan konsentrasi, suhu, waktu, dan kekuatan sonikasi, dan volume. Karena sangat tidak mungkin untuk menghasilkan kondisi sonikasi, variasi ukuran yang dihasilkan dalam setiap kali melakukan sonikasi pada waktu yang berbeda sangatlah umum. Partikel-partikel SUV sangat tidak stabil dan akan berubah secara spontan membentuk vesikel yang lebih besar ketika disimpan di bawah temperatur fase transisi.49

II.7 Kerangka Konsep

Kestabilan liposom

Fisik Biologik Kimia

Liposom EPC-TEL 2,5 Liposom lain

Sonikasi 60 menit: CaCl2 pH 7 350

mOsmol

Liposom kontrol

Hari ke-1 Hari ke-7 Bulan

ke-1

Bulan ke-3

Analisis jumlah dan diameter Liposom EPC-TEL 2,5 In Vitro

Bulan ke-2