2011011007 Angaria Murti Kelas A tugas 4 mikfar

Nama : Angaria Murti NIM : 2011011007 Kelas : A

Dosen pengampu : prof. Dr. Marlina, Apt

Mikrobiologi Farmasi

Pewarnaan bakteri

Sejarah Singkat Pewarnaan Gram

 

Pewarnaan dilakukan untuk dapat membedakan jenis bakteri berdasarkan sifat kimiawi dan sifat fisik dinding sel peptidoglikan. Perbedaan ini akan membagi 2 jenis bakteri yaitu Bakteri Gram Positif (+) dan Gram Negatif (-).

Hans Christian yang merupakan ahli mikrobiologi Denmark menemukan metode pewarnaan pada tahun 1884 Gram untuk membedakan bakteri Pneumococcus dan Klebsiella pneumoniae. Pewarnaan yang dilakukan yaitu dengan menggunakan Crystal Violet dan Safranin.

Crystal Violet akan memberian warna ungu apabila diaplikasikan pada bakteri gram positif sedangkan pada gram negatif akan memberikan warna merah dan safranin akan memberi warna merah.

Staphylococcus aureas

Staphylococcus aureas

1. Pewarnaan sederhana (simple strain) yang bertujuan untuk melihat bentuk dan morfologi sel

2. Pewarnaan diferensial (differensial strain) terdiri dari pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam yang bertujuan untuk membedakan jenis-jenis sel melalui perbedaan warna

3. Pewarnaan spesial atau khusus (pecial strain) yang digunakan untuk mewarnai bagian-bagian tertentu dari sel atau  mikroba yang sukar diwarnai dengan menggunakan teknik pewarnaan sederhana.

Jenis-jenis pewarnaan

1.

Pewarnaa n

sederhan a (simple

strain)

Pewarnaan Tahan Asam

Tujuannya untuk melihat bentuk sel. Morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.

Kebanyakan bakteri mudah

bereaksi dengan pewarna-pewarna

sederhana karena sitoplasmanya

bersifat basofilik (suka basa)

sedangkan zat warna yang digunakan

dalam pewarnaan sederhana

umumnya bersifat alkalin (komponen

kromoforik bermuatan positif).

Prosedur Pewarnaan

1. Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai.

2. Secara aseptis ambil 1 ulasan jarum ose kultur bakteri pada permukaan kaca preparat yang telah ditetesi akuades steril lalu ratakan.

3. Lalu lakukan fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api bunsen sebanyak 3 kali. (Berfungsi untuk mematikan bakteri namun tetap mempertahankan bentuk dan komponen sel).

4. Teteskan pewarna sederhana diseluruh permukaan dengan memilih salah satu pewarna sesuai dengan kebutuhan dan tunggu pewarna meresap ke dinding sel bakteri. Methylene Blue (60 detik), Crystal Violet (30 detik) dan Carbol Fuchsin (20 detik).

5. Bilas pewarna dengan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering atau dapat diserap dengan tissue.

6. Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan sampel siap diamati dibawah mikroskop.

Methylene blue –Biru

Methylene Blue 3 g, Potasium Hidroksida 10% 1 ml, Etanol 95%

300 ml.

Crystall violet-Ungu

Kristal Violet 2 g, Etil Alkohol 95%

20 ml, Amonium Oksalat 0,8 g, Akuades Steril 100 ml.

Karbol fuchsin-Merah

Fuchsin dasar 0,3 g, etanol 95%

10 ml, Fenol 5 ml, Akuades steril 95 ml. 

Jenis Pewarna

Pewarnaan diferensial (differensial

strain)

2.

Teknik noda Gram

dikembangkan oleh

Bakteriologis Denmark Hans Christian Gram pada tahun 1884.

Ini adalah salah satu metode pewarnaan yang paling berguna karena mengklasifikasikan bakteri ke dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif.

Prinsip kerja Pewarnaan

Gram

Langkah Kerja Pewarnaan Gram

 Langkah 1: Olesan panas tetap ditutupi dengan pewarna ungu dasar, Contoh: Ungu kristal. Noda ini memberikan warnanya ke semua sel. Ini disebut sebagai noda utama, karena diterapkan terlebih dahulu.

Langkah 2: Setelah beberapa saat, slide dibersihkan dan noda ditutupi dengan yodium, mordant. Pada tahap ini bakteri negatif Gram positif dan Gram muncul ungu gelap.

Langkah 3: Selanjutnya, slide dihilasi dengan alkohol atau larutan alkohol aseton. Solusi ini adalah agen decolurizing, yang menghilangkan noda utama dari sel-sel beberapa spesies tetapi tidak dari yang lain.

Langkah 4: Slide segera dicuci setelah decolurization dan slide kemudian dilawan dengan fuchsin dasar atau safranin, pewarna merah dasar. Olesan dicuci lagi, blot dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop.

Prosedur teknik noda gram

Contoh Pewarnaan Gram

Bakteri gram positif akan bernoda biru/ungu.

Bakteri gram negatif akan bernoda merah muda/merah

Bacillus anthracis

Pseudomonas aeruginosa

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak.

Perbedaan dasar pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel.

Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Pengelompokkan pewarnaan gram

bakteri

Ciri-ciri bakteri gram negatif

a) Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

b) Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

c) lapisan kaku

d) Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

e) Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

f) Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

g) Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

h) Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Ciri-ciri bakteri gram positif

A. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

B. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),

peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

C. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

D. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

E. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

F. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut G. Tidak peka terhadap streptomisin

H. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Pewarnaan Tahan Asam

Ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi

tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan

menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti

asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).

Mycobacterium tuberculosis

Prinsip kerja:

Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena

pengaruh fenol dan kadar cat yang tinggi maka lapisan lilin dan lemak itu

dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka

akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol

warna fuchsin tidak dilepas.

Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil

warna biru dari methylen blue.

Cara Kerja :

1. Dibuat sediaan kuman dan difiksasi.

2. Diwarnai dengan Kinyoun selama 3 menit

3. Sediaan dicuci dengan air.

4. Diwarnai dengan Gabbet selama 1 menit.

5. Dicuci dan dikeringkan

6. Diperiksa di bawah mikroskop.

Prinsip dan cara kerja (metode kinyoun gabbet)

Pewarnaan spesial atau

khusus (pecial

strain)

3.

Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) memerlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan klein merupakan pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode gram. Untuk

pewarnaan endospora, perlu dilakukan pemanasan agar cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  basil tahan asam

dimana cat  carbol   fuschsin dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .

Bacillus subtilis

Prinsip Kerja :

Spora kuman mempunyai dinding tebal sehingga diperlukan

pemanasan agar pori-pori membesar lalu zat warna fuchsin

dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin

tidak dapat hilang apabila dilunturkan dengan asam alkohol,

sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan

mengambil warna biru dari methylen blue.

Cara Kerja :

1. Buatlah larutan suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak lalu panaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80°c selama 10 menit

2. Buatlah sediaan lalu keringkan. Jika sudah maka masukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik

3. Masukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir

4. Setelah itu, sediaan dicuci dengan air dan warnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan

5. Amati dibawah mikroskop.

PROSEDUR KERJA

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna

biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air

dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna

pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

Bakteri Pneumococcus

Prinsip kerja :

Kapsul pada kuman tidak dapat mengikat zat warna, sehingga pada pemberian cat tinta cina dan calbol fuchsin terlihat

bulatan terang atau transparan dengan latar belakang gelap dan badan kuman berwarna merah dari fuchsin.

Cara Kerja :

1. Persiapkan 2 buah objek glass yang bersih dan bebas lemak

2. Letakkan 1 ose tinta cina pada bagian pinggir objek glass

3. Diambil 1 ose suspensi bakteri,

campurkan dengan tinta cina sampai homogen

4. Dengan ujung objek glass yang lain, buat hapusan, dibiarkan kering dan fiksasi

5. Ditambahkan carbol fuchsin 1/10 selama 1 menit

6. Sisa cat dibuang dan dikeringkan..

7. Diperiksa dibawah mikroskop.

PROSEDUR KERJA Metode Burry Gins

Pewarnaan Flagel

Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar.

Penyusun flagel yaitu sub unit protein yang disebut flagelin,

yang mempunyai berat

molekul rendah.

Prinsip kerja

Membuat organel tersebut dapat dilihat dengan cara melapisinya

dengan mordant dalam jumlah yang cukup. Dua

metode pewarnaan flagella, yaitu

metode Gray dan metode Leifson.

Metode Gray untuk mendapat hasil yang lebih baik dan jelas walaupun metode ini tidak dilakukan pencelupan khusus.

Larutan kristal violet dalam

pewarnaan flagel

bertindak sebagai pewarna utama dan akan membentuk endapan putih disekitar flagel agar meningkatkan ukuran flagel,  sedangkan asam  tannic dan alumunium kaliumsulfat bertindak sebagai mordant.

PROSEDUR KERJA

Gambar Prosedure kerja

Pewarnaan Granula Metode Neisser

Granula metakromatik disebut juga granula volutin. Granula metakromatik tidak hanya ditemukan pada Corynebacterium diphtheria tetapi juga di beberapa bakteri selain Corynebacterium diphtheria fungi, algae, dan protozoa.

Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang terdiri atas volutin, granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman pathogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman

tersebut.

Corynebacterium diphtheria

Prinsip kerja

Pengecatan dengan neisser A menyebabkan granula babes ernst (poolkarrel) berwarna violet

hitam, cat tadi oleh granula

bakteri dipegang kuat terhadap air.

Sehingga dengan cat neisser B tidak berubah (luntur), badan

bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada neisser B

sehingga mengambil warna

kuning atau coklat dari neisser B.

Cara Kerja

1. Disiapkan objek glass steril dan bebas lemak

2. Difiksasi diatas nyala api

3. Diambil satu ose bakteri diletakan ditengah-tengah objek glass

kemudiaan dibuat sediaan, tunggu sampai sediaan kering.

4. Difiksasi diatas nyala api 5. Sediaan digenangi

dengan Neisser A selama 60 detik, lalu buang

6. Sediaan digenangi

dengan Neisser B salama 10 detik, lalu buang

7. Dicuci dengan air mengalir, keringkan

8. Diamati di mikroskop dengan perbesaran 10x & 100x

Prosedure Pewarnaan Granula Metode

Neisser

Thank

you