PLASMA KAYA TROMBOSIT TIDAK
MENURUNKAN APOPTOSIS FIBROBLAS TIKUS (GALUR SEL NIH3T3) YANG TERPAJAN SINAR UVB
LIZA WIDJAJA
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2011
PLASMA KAYA TROMBOSIT TIDAK
MENURUNKAN APOPTOSIS FIBROBLAS TIKUS (GALUR SEL NIH3T3) YANG TERPAJAN SINAR UVB
LIZA WIDJAJA NIM : 0790761028
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2011
PLASMA KAYA TROMBOSIT TIDAK
MENURUNKAN APOPTOSIS FIBROBLAS TIKUS (GALUR SEL NIH3T3) YANG TERPAJAN SINAR
ULTRA VIOLET B
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada Program Magister Program Studi Ilmu Biomedik
Kekhususan Anti Aging Medicine Program Pascasarjana Universitas Udayana
LIZA WIDJAJA NIM : 0790761028
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2011
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL :
Pembimbing I Pembimbing II
Prof.Dr.dr.Wimpie Pangkahila, drg.Ferry Sandra,PhD
SpAnd,FAACS LFIBA,CIPM,MIPM
NIP : 194612131971071001 NIP :130356070
Mengetahui
Ketua Program Magister Direktur
Ilmu Kedokteran Biomedik Progam Pascasarjana Program Pascasarjana Universitas Udayana Universitas Udayana
Prof. Dr.dr. Wimpie I.Pangkahila, Prof.Dr.dr. AA Raka Sudewi,
Sp.And.FAACS Sp.S(K)
NIP : 194612131971071001 NIP : 195902151985102001
Oleh Panitia Penguji pada
Program Pascasarjana Universitas Udayana Pada Tanggal 11 Maret 2011
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No : 0514/H14.4/HK/2011
Tanggal, 08 Maret 2011
Ketua : Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And. FAACS Anggota:
1. Drg.Ferry Sandra,PhD. LFIBA,CIPM,MIPM 2. drg. Ferry Sandra, Phd,LFIBA,CIPM,MIPM 3. Prof. Dr. dr Alex Pangkahila, Sp.And., PhD 4. Prof. Dr. dr Bagiada., Sp.BIOK
5. Prof. Dr.dr. Nyoman Adiputra, MOH
Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas kasih karunia-Nya,sehingga penelitian dan penyusunan tesis yang berjudul “Plasma Kaya Trombosit Tidak Menurunkan Apoptosis Fibroblas Tikus (Galur Sel NIH3T3) Yang Terpajan Sinar UVB” dapat diselesaikan.
Tesis ini disusun dalam rangka memenuhi persyaratan tugas akhir studi untuk meraih gelar Magister pada Program Magister Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik, Kekhususan Anti-Aging Medicine, Program Pasca Sarjana Universitas Udayana.
Dengan selesainya laporan penelitian ini, penulis ingin menyampaikan rasa hormat, penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And, FAACS selaku ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Universitas Udayana dan pembimbing I, serta pembimbing akademik saya, yang telah memberikan banyak sekali semangat, masukan dan bimbingan dan juga telah memacu penulis untuk segera menyelesaikan tesis ini untuk kemajuan ilmu yang baru berkembang yaitu Ilmu Kedokteran Anti Penuaan ( Anti Aging Medicine).
2. drg. Ferry Sandra, PhD, LFIBA, CIPM, MIPM selaku pembimbing II, yang telah mengijinkan dilakukannya penelitian ini di Stem cell and Cancer Institute, Jakarta serta arahan dan bimbingannya selama penelitian.
3. Prof. Dr. dr. J Alex Pangkahila, M.Sc., Sp.And.selaku penguji yang telah banyak memberikan bimbingan dan masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini.
4. Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp. BIOK. selaku penguji yang dengan sangat sabar meluangkan waktu dan pikirannya untuk membimbing dan mengoreksi selama penyusunan tesis ini serta memberikan contoh semangat untuk berkarya yang luar biasa.
5. Prof.Dr.dr.Nyoman Adiputra, MOH selaku penguji yang sangat teliti, konsisten dan sabar mengarahkan dan memberi masukan yang sangat berharga, dari awal penyusunan penelitian sampai selesainya tesis ini.
pertama penyususan proposal sampai selesai dilakukannya penelitian ini, telah banyak sekali memberikan pengarahan, bimbingan dan masukan.
7. Drs. I. Ketut Tunas, Msi yang dengan tekun dan sabar memberikan bimbingan, pengarahan dan petunjuk dalam analisis statistik.
8. Para dosen pengajar Progam Studi Ilmu Biomedik Progam Pascasarjana Universitas Udayana, teman-teman sependidikan dan seluruh karyawan bagian Ilmu Biomedik, serta semua pihak yang telah membantu selama pendidikan, penelitian dan penulisan tesis yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu..
9. Dr. I Made Oka Negara beserta staf bagian Andrologi dan Seksologi FK Universitas Udayana (dr. Pram, Eny Mariani dan Edy Suantara ) serta teman-teman mahasiswa Program Magister Biomedik kekhususan Anti Aging Medicine atas doa, semangat dan dorongannya.
10. Kolonel Ckm dr. FX Hanny Suwandhani, SpKK selaku atasan saya di Estetiderma, yang telah banyak memberikan saya dukungan, waktu dan pengertian sehingga bisa diselesaikannya tesis ini dalam rangka menyelesaikan pendidikan S2 di bidang anti aging medicine.
11. Laura Wijaya, B.Si, Drs Dwi Agustina, M.Si, yang telah dengan tekun dan sabar memberi pengarahan, petunjuk dan bantuan dalam melaksanakan penelitian ini hingga selesai.
12. Drs Indra Bachtiar, M.Si, PhD, yang juga memberi pengarahan dan petunjuk dalam penulisan tesis ini.
13. Ibu Maria Fatimah, Oktasari Suryanti, Bapak Hengki serta para karyawan lainnya di Stem Cell And Cancer Institute (SCI), yang selalu memberikan semangat dan sudah banyak sekali membantu selama melakukan penelitian.
terimakasih atas dukungan yang luar biasa. Serta papa tercinta Sutikno Widjaja dan mama tersayang Tjondro Hastuti, saudara-saudara kandungku, atas doa, dukungan dan pengertiannya selama penulis menempuh pendidikan.
Penulis juga mengucapkan banyak terimakasih kepada semua pihak yang telah ikut membantu dalam pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini. Semoga Tuhan Yang Maha Pengasih, senantiasa melimpahkan berkat dan rahmat-Nya kepada mereka semua.
Denpasar, Februari 2011
Penulis.
PLASMA KAYA TROMBOSIT TIDAK MENURUNKAN APOPTOSIS FIBROBLAS PADA TIKUS (GALUR SEL NIH3T3) YANG TERPAJAN
SINAR ULTRA VIOLET B
Proses menua adalah proses yang sangat kompleks yang dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal. Proses internal antara lain terjadi akibat menurunnya kemampuan sel untuk bereplikasi dan akhirnya mati atau dikenal dengan apoptosis.
Plasma kaya trombosit (PKT) merupakan sumber faktor pertumbuhan dan sitokin yang sangat dibutuhkan oleh sel pada saat terjadi kerusakan, termasuk fibroblas.
Penuaan fibroblas akibat penyinaran sinar UVB terutama adalah ekspresi enzim matrix metalloproteinase (MMP) dan penurunan mekanisme kerja transforming growth factor β (TGF-β). Kedua mekanisme ini penting dalam pencegahan terjadinya kerusakan sel.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah PKT dapat menurunkan apoptosis fibroblas akibat penyinaran UVB, pada tikus (galur sel NIH3T3).
Sampel dari penelitian ini adalah Fibroblas dari galur sel NIH 3T3 yang berasal dari tikus putih Swiss (Mus musculus). Fibroblas dikultur dalam medium DMEM yang mengandung 2% fetal bovine serum (FBS) dan diberi perlakuan dengan 10%
PKT sebelum dan sesudah penyinaran UVB dengan waktu penyinaran 2 menit(2’) dan 3 menit(3’).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium, dengan menggunakan rancangan post test only control group design yang dilakukan di Stem Cell and Cancer Institute, pada bulan Desember 2010 - Februari 2011.
Dalam penelitian ini dilakukan 42 pemeriksaan pada galur fibroblas NIH3T3 sebagai sampel, yang terbagi menjadi 7 (tujuh) kelompok, masing-masing kelompok berjumlah 6 sediaan, yaitu kelompok kontrol (2% FBS), kelompok 2%
FBS+ UV 2’, kelompok 2% FBS + UV 3’, kelompok 2% FBS+ 10% PKT + UV 2’, kelompok 2% FBS + 10% PKT + UV 3’, kelompok 2% FBS + UVB 2’+10%
PKT, kelompok 2 % FBS + UVB 3’+ 10% PKT. Kelompok ini dibuat agar dapat dibandingkan hasil apoptosis berdasarkan waktu penyinaran 2’ dan 3’ dan juga membandingkan manfaat pemberian PKT sebelum pajanan sinar UVB dan sesudah pajanan, untuk mendapatkan bukti tentang manfaat PKT sebagai pencegahan maupun pengobatan atau perbaikan kembali.
Hasil penelitian pada kelompok kontrol dan perlakuan dengan UVB 2’ dan 3’ terjadi peningkatan apoptosis yang signifikan pada kelompok perlakuan dibanding kontrol. Pada kelompok dengan PKT 10 % sesudah UVB 2’ dan 3’
terjadi peningkatan apoptosis yang paling signifikan dibanding kontrol. Hasil penelitian ini dianalisa dengan uji normalitas Saphiro-Wilk dan uji homogenitas dengan Levene’s dan perbedaan signifikan diuji dengan One Way Anova.
Hasil ini menyimpulkan bahwa PKT tidak dapat menurunkan apoptosis fibroblas pada tikus (galur sel NIH3T3) yang terpajan sinar UVB secara bermakna, baik sebagai pencegahan maupun pengobatan.
Kata Kunci : Plasma Kaya Trombosit (PKT), Sinar Ultra Violet B (UVB), Galur sel NIH 3T3, Apoptosis.
PLATELET RICH PLASMA DOES NOT DOWNREGULATE APOPTOSIS IN RAT FIBROBLASTS (NIH3T3 CELLS) EXPOSED TO UVB
RADIATION
Aging process is a complex mechanism that influenced by internal and external causes. The process caused by internal factors are including, the capacity of cell replication that is code by the genes, that disappearance of the tissues capacity to improve or replace themselves. The process called apoptosis.
Platelet rich plasma are rich of growth factors and cytochine that needed during cell repair, including the fibroblast.
Fibroblast aging due to lighting with UVB light has been reported, and the changes include over expression of enzyme metalloproteinase (MMP) and dysregulation of TGF-β pathway.
This research is done to find out whether PKT can downregulate fibroblast apoptosis which are damaged due to UVB lighting, in mice (NIH3T3 cell strain).
Samples from this research is fibroblast from NIH 3T3 cell strain from Swiss white mice (Mus Musculus). Fibroblast is cutured in DMEM 2% FBS medium and given platelet rich plasma 10% before and after lighting with UVB for 2 minutes and 3 minutes, so we can see the difference between this length of exposure.
This research is a laboratorium experimental research, using post test only control group design which is done in Stem Cell and Cancer Institute, on December 2010 – February 2011.
In this research, 42 examination is done on NIH3T3 fbroblast strain as sample, which are divided into 7 groups, each consists of 6 samples, they are control group (2% FBS), group with 2% FBS+ UV 2’, group with 2% FBS + UV 3’, group with 2% FBS+ 10% PKT + UV 2’, group with 2% FBS + 10% PKT + UV 3’, group with 2% FBS + UVB 2’+10% PKT, group with 2 % FBS + UVB 3’+ 10% PKT. This model group designed to give a more detail results concerning the use of PRP as a preventive or as a curative treatment..
Results in group exposed to UVB 2’ dan 3’ showed significant upregulating apoptosis compared to control group. In group received PRP before the UVB 2’
and 3’ showed upregulating apoptosis compare to control and group with UVB only. Finally the significant difference of upregulating apoptosis are showed in the PRP treated after UVB exposed group.
Research results were analyzed for the normality and homogeneity tests, while significant of the research result was tested with SaphiroWilk, Levene’s, and One Way Anova tests.
Research results concluded that PRP can not down regulate fibroblast apoptosis in NIH3T3 cells exposed to UVB significantly. However it still need to be measure the right concentration of the PRP, the best procedure to make the PRP, and how severe the damages cause by the UVB that can still be repair.
Key words : Platelet Rich Plasma, Ultra Violet B, Apoptosis, NIH3T3.
DAFTAR ISI
SAMPUL DALAM i
PRASYARAT GELAR ii
LEMBAR PERSETUJUAN iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI iv
UCAPAN TERIMA KASIH v-vii
ABSTRAK viii
ABSTRACT ix
DAFTAR ISI x-xii
DAFTAR GAMBAR xiii
DAFTAR TABEL xiv
DAFTAR SINGKATAN………xv
BAB I PENDAHULUAN 1
1.1. Latar Belakang 1
1.2. Rumusan Masalah 7
1.3 Tujuan Penelitian 8
1.3.1. Tujuan Umum 8
1.3.2. Tujuan Khusus 8
1.4. Manfaat Penelitian 8
1.4.1. Manfaat Ilmiah 8
1.4.2. Manfaat Praktis 9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 10
2.1. Teori-teori Penuaan 10
2.2. Apoptosis atau kematian sel 11
2.3. Fibroblas………... 14
2.3.1 Galur Sel NIH/3T3 17
2.4 Apoptosis dan telomer 19
2.5 Penuaan Seluler kulit………..21
2.5.1. Penuaan Kulit kronologis Tingkat seluler 21 2.5.2 Penuaan Kulit Dini atau Photoaging Tingkat Seluler 22
2.6 Sinar Ultra Violet B………23
2.7 Plasma Kaya Trombosit 24
2.7.1 Pembuatan Plasma Kaya Trombosit 26
2.7.2 Trombosit………27
2.7.3 Growth factor 28
2.8 Growth Factor dan Apoptosis Fibroblas………...29
BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS 31
3.1. Kerangka Berpikir 31
3.1. Kerangka Konsep………...33
3.2 Hipotesis Penelitian………...34
BAB IV METODE PENELITIAN 34
4.1. Rancangan Penelitian 34
4.2. Lokasi dan Waktu Penelitian 35
4.2.2. Waktu Penelitian 35
4.2.3. Populasi dan Sampel 36
4.2.3.1. Penentuan Besar Sampel 37
4.3. Variabel Penelitian 38
4.4. Definisi Operasional 38
4.5. Prosedur-Prosedur dan Bahan-bahan Penelitian………40 4.5.1. Prosedur Thawing dan Kultur NIH3T3………..41 4.5.2. Prosedur Penyinaran dengan UVB……….44 4.5.3 Prosedur Pembuatan Plasma Kaya Trombosit …………...45 4.5.4 Prosedur Pembuatan sediaan Untuk pengukuran FACS 46 4.5.5. Prosedur Pembacaan dengan Fluoresent activated cell
sorter 46
4.6. Alur Penelitian 47
4.7. Analisis Data 48
BAB V HASIL PENELITIAN 49
5.1 Uji Normalitas Data 50
5.2 Uji Homogenitas Data antar Kelompok 51
5.3 Analisis efek pemberian UVB dan PKT 10 % pada NIH3T3………...52
BAB VI PEMBAHASAN HASIL PENELITIAN 54
6.1. Subyek Penelitian 54
6.2 Distribusi dan Varian Suyek penelitian……… 55 6.3 Efek Perlakuan dengan UVB 2’ dan 3’ terhadap Apoptosis………….56 6.4. Efek Perlakuan dengan PKT 10 % sebelum UVB 2’ dan 3’…….……57 6.5 Efek Perlakuan dengan PKT 10 % sesudah UVB 2’ dan 3’……….….57 6.6 Analisa hasil Penelitian……….….58 BAB VII SIMPULAN DAN SARAN……….…………... 60
7.1 Simpulan 60
7.2 Saran 61
DAFTAR PUSTAKA 62-64
LAMPIRAN 65-76
Lampiran 1 Uji Normalitas Data 65
Lampiran 2 Uji Homogenitas data 66-67
Lampiran 3 Uji One way Anova 68
Lampiran 4 Data Penelitian………...69 Lampiran 5 Foto Penelitian………...71-73 Lampiran 6 Informed Consent………74-75 Lampiran 7 Hasil Laboratorium……… 76
Gambar 2. 1 Apoptosis 13
Gambar 2. 2 Galur Sel NIH3T3 15
Gambar 2. 3 Galur NIH3T3 18
Gambar 3.1 Kerangka Konsep………...33 Gambar 4.1 Rancangan penelitian……….35 Gambar 4.2 Alur Penelitian………....48 Gambar 5.1 Grafik Peningkatan Apoptosis sesudah diberikan Perlakuan.53
DAFTAR TABEL
Tabel 5. 1 Hasil Uji Normalitas Apoptosis sesudah perlakuan ………….50 Tabel 5.2 Hasil Uji Homogenitas Apoptosis sesudah
perlakuan………...51 Tabel 5.3 Rerata Apoptosis Antar Kelompok sesudah Perlakuan 52 Tabel 5.4 Analisis Perbedaan Apoptosis sesudah perlakuan antar
kelompok 53
DAFTAR SINGKATAN
PKT : Plasma kaya trombosit PRP : Platelet rich plasma
TGF-β : Transforming growth factor β UVB : Ultra violet β
PDGF : Platelet derived growth factor EGF : Epidermal growth factor
VEGF : Vascular endothelial growth factor MMP : Matrix metalloproteinase
TNF-α : Tumor necrotizing factor-α FBS : Fetal bovine serum
DMEM: Dubecco’s minimal essential medium
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Menjadi tua adalah hal yang tidak diinginkan oleh semua makhluk hidup.
Menurut ilmu kedokteran konservatif, menua adalah hal fisiologis yang normal terjadi pada semua manusia. Dalam ilmu kedokteran anti penuaan dan regenerasi, menua dianggap sebagai penyakit.
Ilmu kedokteran anti penuaan dan regenerasi mempelajari ilmu dan teknologi kedokteran untuk diagnosis dini, pencegahan, terapi dan perbaikan kembali dari kelainan fungsi atau penyakit yang disebabkan penuaan (Goldman dan Klatz, 2003). Teori-teori penuaan dapat dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu teori wear and tear dan teori program.Teori wear and tear meliputi kerusakan DNA, glikosilasi, dan radikal bebas. Teori program meliputi terbatasnya replikasi sel (replicative senesence), proses imun, dan neuroendocrine theory (Pangkahila, 2007). Salah satu teori program adalah hayflick limit theory yang kemudian dipatahkan dengan adanya teori telomerase, kemajuan penelitian di bidang stem cell, therapeutic cloning dan terapi sel lainnya (Goldman dan Klatz, 2003).
Salah satu organ yang paling luar dan banyak terpajan sinar matahari adalah kulit. Salah satu sel yang berperan dalam menjaga kelembaban, kekenyalan dan kekencangan kulit adalah fibroblas. Penuaan akan terjadi pada semua organ tubuh yang bermula dari kematian di tingkat seluler. Penuaan kulit disebabkan
1
oleh faktor internal maupun eksternal. Faktor internal mempengaruhi kulit dengan cara yang sama seperti proses penuaan pada umumnya, yaitu menurunnya fungsi secara perlahan dan degenerasi yang irreversible. Hal ini terjadi pada tingkat seluler dan molekuler, termasuk pada fibroblas. Tanda klinis dari menurunnya fungsi dan degenerasi pada fibroblas yaitu menurunnya turgor, penipisan, kekeringan, dan ekimosis. Tanda utama dari penuaan ekstrinsik disebabkan oleh efek lingkungan, terutama paparan sinar ultra violet (UV) berupa perubahan pigmentasi seperti frekles, lentigo senilis, elastosis dan tumor jinak kulit seperti aktinik keratosis (Gilchrest dan Krutmann, 2006). Sinar UV juga terbukti menimbulkan kerusakan sel terutama DNA sebagai target utamanya. Selain DNA, sinar UV juga merusak enzim membran sel dan meningkatkan penumpukan sel rusak di lisosom antara lain serat elastin. Sinar UV juga terbukti meningkatkan degradasi kolagen melalui aktivasi matrix metalloproteinase (MMP). Kolagen pada dermis didominasi oleh kolagen 1 dan 3 yang dapat dirusak oleh MMP-1 dan -3. Sinar UV A dan B dapat memacu sintesis MMP-1 dan -3 melalui pelepasan TNF-α oleh keratinosit dan fibroblas (Fisher et al. 2000).
Apoptosis atau kematian sel terprogram adalah proses normal dalam perkembangan dan kehidupan organisme multiselluler. Apoptosis terjadi sebagai respon terhadap berbagai stimulus secara terkontrol dan terprogram. Ini membuat apoptosis berbeda dari mekanisme kematian sel lainnya seperti nekrosis yaitu kematian sel yang menyebabkan lisisnya sel, reaksi inflamasi dan kemungkinan menyebabkan gangguan kesehatan. Mekanisme kematian sel pada apoptosis
adalah sengaja diaktifkan sendiri oleh sel, akibat respon dari stimuli yang dialaminya. Oleh sebab itu apoptosis sering diartikan sebagai bunuh diri.
Apoptosis dapat terjadi karena faktor internal dan eksternal yang mempengaruhi keadaan fisiologis tubuh kita. Faktor internal yaitu akibat stres seluler. Stres seluler dapat terjadi akibat paparan UV atau radiasi, zat kimia dan infeksi virus. Dapat juga terjadi akibat menurunnya faktor pertumbuhan dan stres oksidatif akibat radikal bebas. Pada umumnya faktor internal ini menginisiasi apoptosis lewat keterlibatan mitokondria sebagai sumber terbentuknya radikal bebas. Faktor eksternal dapat disebabkan oleh infeksi virus, akibatnya sel yang terinfeksi akan dikenali oleh cytotoxic T lymphocytes yang diekspresikan dari permukaan sel. Sinyal lainnya bisa berupa soluble ligand . Kedua sinyal ini dikenal sebagai binding of death inducing ligands yang akan dikenali oleh reseptor di permukaan sel atau death receptors. Cytotoxic T lymphocytes dapat juga menginduksi apoptosis dengan menggunakan enzim granzyme.
Protein yang dikenal sebagai caspases secara khas akan teraktivasi pada
tahap permulaan apoptosis. Protein ini merusak atau membelah komponen seluler yang diperlukan dalam fungsional sel yang normal termasuk struktur protein di dalam nukleus yaitu enzim perbaikan DNA. Selain itu caspases juga mengaktivasi enzim degradasi lainnya seperti DNAses yang akan mulai membelah DNA di nukleus sel yang rusak. Kerusakan DNA meningkatkan regulasi p53 yang akan menginduksi gen lainnya yang meregulasi siklus sel dan akhirnya menyebabkan apoptosis. p53 menginduksi sintesis Bax yaitu protein penyebab kematian yang melukai mitokondria. Perubahan morfologi sel yang apoptosis yaitu sel mulai
mengecil setelah terjadinya pembelahan pada lamina dan filamen aktin pada sitoskeleton, kondensasi nukleus akibat kerusakan kromatin di nukleus dan kebanyakan menampilkan gambaran menyerupai ”horse shoe”, kemudian sel terus mengecil sehingga dapat dihilangkan oleh makrofag. Proses fagositosis ini bertanggung jawab terhadap pembersihan sel apoptosis dari jaringan sehingga tidak meninggalkan masalah seperti pada kematian sel akibat nekrosis. Untuk memudahkan proses fagositosis ini, sel yang apoptotik sering melakukan perubahan pada plasma membran yang merangsang reaksi makrofag. Salah satunya adalah perubahan tempat phosphatidylserine dari dalam sel ke permukaan sel.
Tahap akhir dari apoptosis secara karakteristik ditandai dengan bocornya membran atau proses terbentuknya vesikel pada membran sel. Vesikel kecil ini dikenal sebagai apoptotic bodies (Rubin, 2001). Salah satu penyebab apoptosis yang banyak dipelajari adalah radiasi sinar UV. Pada sebuah penelitian di Belgia, membuktikan UVB dengan dosis mulai dari 500-1000 mJ/cm2 dalam paparan berulang pada fibroblas manusia dapat menyebabkan penuaan sel dini atau premature senescence (Florence et al. 2002). Pada penelitian Mohammad et al.
(2004) tikus yang dipajan sinar UVB (290-320 nm) dengan dosis 240 mJ/cm2 tiga kali seminggu terbukti menyebabkan pertumbuhan tumor kulit. Pada penelitian tentang proses penuaan keratinosit di epidermis oleh Amos et al. (2004) terbukti adanya hubungan antara perbaikan dari penuaan sel dengan penurunan ekspresi Fas ligand dan apoptosis dari keratinosit .
Belakangan ini terjadi peningkatan prevalensi penggunaan produk darah otologus untuk penyembuhan dalam variasi aplikasi klinis. Terutama untuk penyembuhan luka di bidang bedah. Karena pada saat terjadi luka, tubuh kita secara alamiah akan merespon dengan perbaikan, dan dibutuhkan komponen seluler untuk segera secara efektif memperbaiki kerusakan itu. Dua pilihan saat ini untuk perbaikan luka dengan menggunakan darah yaitu fibrin tissue adhesive (FTA) dan platelet rich plasma (PRP) atau plasma kaya trombosit (PKT).
Keamanan serta manfaat growth factor yang ada di dalam dua produk ini sudah banyak dipublikasikan di dalam literatur.
Dengan adanya pengetahuan dan berbagai penelitian di bidang tersebut, terjadi antusiasme besar dalam penggunaan PKT yang mengeluarkan growth factor dalam jumlah sangat besar untuk menstimulasi penyembuhan pada luka yang tidak dapat sembuh. Selama 20 tahun terakhir ini penggunaan PKT otologus banyak didokumentasikan dan tidak hanya di bidang penyembuhan luka namun juga di bidang ortopedi, kedokteran olah raga, kedokteran gigi, THT, bedah saraf, mata, urologi, bedah jantung dan bedah plastik (Sampson et al. 2008).
Sebelumnya trombosit dianggap ekslusif berperan hanya dalam proses pembekuan darah. Namun sudah dipelajari bahwa trombosit juga melepaskan banyak macam protein bioaktif yang berperan dalam menarik makrofag, mesenchymal stem cell, dan osteoblas yang tidak hanya berperan pada pembuangan jaringan nekrotik tapi juga meningkatkan penyembuhan dan regenerasi jaringan (Sampson et al. 2008). Trombosit juga mengandung granul yang mengandung tissue inhibitor matrix metalloproteinase (TIMP) yang
menghambat degradasi kolagen. Pada trombosit terdapat granula-granula yang berisi growth factor yang akan keluar dan teraktivasi pada saat trombosis atau terjadinya respon pada saat kulit terluka.
Pada proses penyembuhan luka, trombosit sangat dibutuhkan untuk membuat fibrin, mengeluarkan growth factor disertai dengan chemoattraction untuk menginduksi migrasi makrofag dan stem cell. Selanjutnya akan terjadi proliferasi serta mitosis dan diferensiasi stem cell untuk membentuk sel baru yang dibutuhkan (Green et al. 2009). Growth factor yang di keluarkan oleh trombosit pada proses degranulasi, yaitu platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor (TGF), insulin like growth factor (IGF) dan epidermal growth factor (EGF) (Blair dan Flaumenhaft, 2009).
PKT adalah material biologis yang mengandung trombosit otologus dengan konsentrasi yang tinggi dalam sejumlah kecil cairan plasma. Jumlah trombosit dalam PKT dapat mencapai lebih dari 2 juta unit per mikroliter (Budiyanto, 2009).
Publikasi terakhir tentang penggunaan PKT telah beredar pada penyembuhan luka tendon kronis, misalnya lateral epicondylitis, plantar fasciitis dan degenerasi kartilago. Namun umumnya karya ilmiah tentang PKT hanya laporan kasus dan bukan penelitian terkontrol. Aplikasi PKT secara klinis tanpa dukungan ilmiah yang kuat banyak dijumpai. Penelitian tentang manfaat, efek samping, dosis dari PKT masih harus banyak dilakukan (Mishra, 2006).
Sejak 1 tahun terakhir, di Indonesia, telah banyak beredar peralatan pembuat PKT dengan harga yang sangat mahal. Walaupun hasilnya secara ilmiah
masih harus banyak dibuktikan. Pada Januari 2010, Dr. De Vos di Belanda, melaporkan tidak ada perbaikan bermakna antara kelompok PKT dengan kelompok plasebo yang menggunakan larutan saline pada kasus achilles tendinopathy kronis (Vos, 2010). Namun hal tersebut tidak mengurangi minat para dokter untuk terus menggali manfaat dari PKT, terbukti terapi ini semakin popular dan banyak diteliti.
Penelitian tentang manfaat PKT dalam bidang peremajaan dan anti penuaan belum banyak dilakukan. Penelitian di bidang PKT masih kontroversi, maka peneliti ingin membuktikan kegunaan dan manfaat PKT khususnya dalam memperbaiki proses kerusakan dan kematian seluler. Untuk mengetahui dosis efektif dan efek samping dari penggunaan PKT, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan hal tersebut di atas maka dapat dirumuskan masalahnya sebagai berikut:
1. Apakah apoptosis meningkat pada fibroblas yang terpajan sinar UVB?
2. Apakah PKT dapat menurunkan apoptosis fibroblas yang terpajan sinar UVB?
1.3 TUJUAN PENELITIAN 1.3.1 Tujuan Umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bahwa PKT dapat memperbaiki keadaan kulit akibat kerusakan sel.
1.3.2 Tujuan Khusus
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui:
1. Peningkatan apoptosis fibroblas yang terpajan sinar UVB dengan dosis 400mJ/cm2 selama 2 menit dan 3 menit.
2. Penurunan apoptosis fibroblas dengan intervensi PKT sebelum dan sesudah pajanan sinar UVB.
1.4 MANFAAT PENELITIAN
1.4.1 Manfaat Teoritis
Untuk mendapatkan data ilmiah tentang efek PKT terhadap perbaikan kerusakan fibroblas yang terpajan sinar UVB. Selain itu, untuk mendapatkan informasi tentang apoptosis fibroblas akibat pajanan sinar UVB, sehingga dapat digunakan sebagai metode acuan untuk penelitian selanjutnya.
1.4.2 Manfaat praktis
Memberikan informasi ilmiah kepada masyarakat umum tentang manfaat pemberian PKT dalam memperbaiki proses penuaan dan kerusakan sel, sehingga
dapat langsung diterapkan untuk praktek sehari-hari dalam pemilihan terapi untuk memperbaiki proses penuaan sel, khususnya fibroblas.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Teori Penuaan
Teori penuaan di tingkat seluler dan molekuler secara umum didasari oleh dua pemikiran yaitu penuaan terprogram dan penuaan secara tidak sengaja. Teori penuaan terprogram didasari pemikiran bahwa sejak kita dalam kandungan, dilahirkan sampai akhirnya meninggal, sudah diatur oleh jam biologis. Jam biologis ini mengatur bermacam kejadian dalam tubuh kita sesuai dengan waktunya. Hilangnya kalsium dari tulang, berkurangnya kemampuan mata untuk melihat, telinga untuk mendengar dan kapasitas pernafasan yang menurun adalah contoh dari penuaan yang terprogram. Dan teori penuaan sebagai kebetulan atau bukan terprogram adalah bahwa manusia menjadi tua akibat banyak hal yang terjadi secara acak, misalnya kerusakan DNA dan radikal bebas atau hanya akibat rusaknya organ tubuh kita dengan bertambahnya waktu (Goldman dan Klatz, 2003).
Secara luas ada empat teori penuaan yang paling sering dibicarakan dan diteliti lebih lanjut. Teori tersebut adalah, teori wear and tear, teori neuroendokrin, teori kontrol genetik dan teori radikal bebas. Teori kontrol genetik yang salah satu dasarnya adalah teori program menyatakan bahwa setiap manusia mempunyai kode genetik masing-masing yang menentukan saat menurunnya kesehatan, organ-organ mulai menua dan akhirnya meninggal. Ternyata dengan kemajuan teknologi kedokteran dan ilmu pengetahuan khususnya anti penuaan
10
diharapkan dapat merubah teori tersebut misalnya dengan ditemukannya cara untuk memperpanjang rantai DNA dalam setiap sel kita, mencegahnya dari kerusakan serta memperbaikinya kembali. Dengan demikian diharapkan pada masa yang akan datang, manusia bisa terbebas dari nasib genetiknya (Goldman dan Klatz, 2003). Di dalam teori program ini salah satu yang juga penting dipelajari adalah teori terbatasnya replikasi sel. Pada ujung utas kromosom terdapat struktur khusus yang disebut telomer. Secara biokimia, telomer terdiri dari hexanucleotide. Dengan setiap replikasi sel, telomer memendek pada setiap pembelahan sel. Setelah sejumlah pembelahan sel, telomer habis dipakai dan pembelahan sel berhenti (Pangkahila, 2007).
2.2 Apoptosis
Apoptosis adalah proses normal dalam perkembangan dan kehidupan organisme multiselluler. Apoptosis terjadi sebagai respon terhadap berbagai stimulus secara terkontrol dan cara yang terprogram. Ini membuat apoptosis berbeda dari mekanisme kematian sel lainnya seperti nekrosis dimana terjadi kematian sel yang menyebabkan lisisnya sel, reaksi inflamasi dan kemungkinan menyebabkan gangguan kesehatan. Berbeda dengan apoptosis dimana proses kematian ini sengaja diaktifkan sendiri oleh sel akibat respon dari stimuli yang dialaminya. Oleh sebab itu apoptosis sering diartikan sebagai bunuh diri.
Apoptosis dapat terjadi karena faktor internal dan eksternal yang mempengaruhi keadaan fisiologis tubuh kita. Berbagai faktor tersebut dapat berupa stres seluler, yang terjadi akibat pajanan sinar matahari atau radiasi, zat kimia dan infeksi
virus. Keadaan – keadaan tersebut dapat menyebabkan menurunnya growth factor serta meningkatnya stress oksidatif akibat radikal bebas. Pada umumnya faktor tersebut di atas dapat menginisiasi apoptosis lewat keterlibatan mitokondria yaitu tempat terjadinya radikal bebas di dalam sel (Rubin, 2001).
Faktor eksternal dapat disebabkan oleh infeksi virus dimana sel yang terinfeksi akan dikenali oleh cytotoxic T lymphocytes yang diekspresikan dari permukaan sel. Sinyal lainnya bisa berupa soluble ligand. Kedua sinyal ini dikenal sebagai binding of death inducing ligands yang akan dikenali oleh reseptor di permukaan sel atau death receptors. Cytotoxic T lymphocytes dapat juga menginduksi apoptosis dengan menggunakan enzim granzyme. Protein yang dikenal sebagai caspases secara khas akan teraktifasi pada tahap permulaan apoptosis. Protein ini merusak atau membelah komponen seluler yang diperlukan dalam fungsional sel yang normal termasuk struktur protein di dalam nukleus yaitu enzim perbaikan DNA. Selain itu caspases juga mengaktifasi enzim degradasi lainnya seperti DNAses yang akan mulai membelah DNA di nukleus sel yang rusak.
Perubahan morfologi sel yang apoptosis yaitu sel mulai mengecil setelah terjadinya pembelahan pada lamina dan filamen aktin pada sitoskeleton, kondensasi nukleus akibat kerusakan kromatin di nukleus dan kebanyakan menampilkan gambaran menyerupai ”horse shoe”, kemudian sel terus mengecil sehingga dapat dihilangkan oleh makrofag (Rubin, 2001). Proses fagositosis ini bertanggung jawab terhadap pembersihan sel apoptosis dari jaringan sehingga tidak meninggalkan masalah seperti pada kematian sel akibat nekrosis. Untuk
memudahkan proses fagositosis ini, sel yang apoptotik sering melakukan perubahan pada plasma membran yang merangsang reaksi makrofag. Salah satunya adalah perubahan tempat phosphatidylserine dari dalam sel ke permukaan sel. Tahap akhir dari apoptosis secara karakteristik ditandai dengan bocornya membran atau proses terbentuknya vesikel pada membrane sel.
Vesikel kecil ini dikenal sebagai apoptotic bodies (Rubin, 2001).
Gambar.2.1. Proses kematian sel (Apoptosis).
http://www.scq.ubc.ca/apoptosis/
Penuaan sel keratinosit akibat pajanan sinar UVB dengan dosis 100J/m2 selama 5 menit sudah pernah diteliti dan terbukti menyebabkan prematur senescence hanya pada keratinosit yang mengandung IGF-1R, sedang pada dosis 400J/m2 selama 5 menit bukan lagi premature senescence melainkan apoptosis sel
yang terjadi. Proses apoptosis ini banyak berhubungan dengan penyakit-penyakit yang berhubungan dengan penuaan, seperti Werner’s syndrome dan Alzheimer disease. Oleh karena itu penelitian terhadap dua proses yang amat penting dalam patofisiologi penyakit degeneratif dan keganasan yaitu cellular senescence dan apoptosis, adalah sangat penting (Campisi dan Fagagna, 2007).
Pada penelitian terakhir tentang apoptosis sel dan hubungannya dengan kemampuan regenerasi dan penyembuhan luka diketahui bahwa sel yang apoptosis mengeluarkan growth signal yang akan menstimulasi proliferasi dari progenitor dan stem cell, dimana peran utamanya adalah caspases 3 dan 7 yaitu protein yang berperan pada tahap awal apoptosis, sehingga tikus yang defisiensi caspases ini mengalami penyembuhan luka yang lambat dan regenerasi sel hati.
Prostaglandin E2 selaku promotor dari progenitor dan stem cell memegang peranan dalam mekanisme ini. Mekanisme dimana caspases merangsang penyembuhan luka dan regenerasi sel pada organ multiseluler ini diberi nama
”Phoenix rising” pathway (Li et al, 2010).
2.3 Fibroblas
Jaringan ikat adalah salah satu dari empat macam jaringan yang ada dalam tubuh manusia. Jaringan tersebut adalah jaringan ikat, otot, saraf dan epitel.
Jaringan ikat adalah jaringan fibrosa yang terdiri dari kolagen, yang merupakan protein yang paling banyak di dalam tubuh mamalia, yang diproduksi oleh fibroblas. Ada banyak macam jaringan ikat antara lain jaringan ikat padat, longgar, elastik, retikularis dan jaringan adiposa. Selain itu bisa ditambahkan
bahwa jaringan ikat ada yang embrionik dan ada yang terspesialisasi seperti tulang, tulang rawan dan darah. Jaringan ikat padat membentuk ligamentum, tendon dan matriks ekstraseluler di dermis kulit. Matriks ekstraseluler ini terbentuk hampir seluruhnya oleh kolagen, yang diproduksi oleh fibroblas.
Fibroblas tersebar di antara kolagen yang juga memproduksi glikoprotein, glikosaminoglikan, serta proteoglikan yaitu polisakarida yang berbentuk gel seperti pelumas untuk menjaga ligamentum dan tulang rawan tetap berfungsi baik.
Selain itu fibroblas juga mempunyai kemampuan untuk memperbaiki jaringan yang rusak dan akan bertambah jumlahnya apabila terjadi luka .
Gambar 2.2. Fibroblas
(http://4.bp.blogspot.com/_tly7kZVpziE/R1QFL2xizII/AAAAAAAAAog/qxXqIak1Ctc/s1600- R/PC030956.JPG)
Setiap sel saling berhubungan satu dengan lainnya melalui berbagai cara.
Mereka bersatu membentuk jaringan atau organ. Beberapa jaringan, seperti epitel pembatas atau epitel penutup terdiri dari kelompok sel yang rapat dan saling
melekat erat secara langsung dengan sedikit sekali ruang antara. Kelompok jenis ini adalah lunak, lentur dan tidak dapat mempertahankan bentuk organ ataupun menopang seluruh tubuh. Sebenarnya jaringan penyambung yang mempersatukan sel-sel tersebut menjadi tubuh karena jaringan ini memiliki substansi interselular.
Jaringan penyambung menghasilkan kolagen. Kolagen adalah suatu protein berbentuk serabut yang amat kuat (seperti tendon, ligamentum dan elastin) yang juga dibentuk menjadi serabut, serta mempunyai sifat-sifat kenyal. Di antara serabut-serabut elastik ini terdapat matriks atau zat dasar seperti agar-agar.
Kombinasi serabut kuat dan serat elastik serta matriks memberikan kekuatan, bentuk dan gaya pegas pada tubuh. Pada rangka, zat antar sel ini diisi dengan garam-garam kalsium, menghasilkan tulang penyokong tubuh yang kuat (Mescher, 2010).
Fibroblas adalah sel yang paling banyak terdapat dalam jaringan ikat.
Fibroblas adalah sel memanjang yang dibedakan terutama oleh banyaknya anyaman retikulum endoplasma kasar yang melapisi rongga lebar dalam sitoplasmanya. Fibrosit berukuran lebih kecil daripada fibroblas. Ia cenderung berbentuk gelendong, dengan lebih sedikit cabang-cabangnya daripada fibroblas.
Ia memiliki inti yang panjang, lebih gelap, lebih kecil dan sitoplasmanya bersifat asidofil serta mengandung sedikit retikulum endoplasma kasar. Bila cukup dirangsang, fibrosit dapat berubah menjadi fibroblas dan aktivitas sintetiknya diaktifkan kembali. Hal ini terjadi pada penyembuhan luka dan dalam keadaan demikian sel-sel mengambil bentuk dan tampak seperti fibroblas muda.
Miofibroblas, suatu sel dengan gambaran fibroblas dan otot polos, juga diamati
selama penyembuhan luka. Sel ini mempunyai sifat morfologis sebagai suatu fibroblas tetapi mengandung banyak mikrofilamen aktin dan miosin. Aktivitas sel- sel tersebut berperan pada penutupan luka akibat cedera jaringan, suatu proses yang disebut kontraksi luka (Mescher, 2010).
Fibroblas membuat serat-serat kolagen, retikulin, elastin, glikosaminoglikan dan glikoprotein dari substansi intercellular amorf. Serat kolagen adalah serat yang paling banyak dijumpai dalam jaringan penyambung.
Serat-serat kolagen segar merupakan benang-benang tanpa warna, namun bila terdapat dalam jumlah besar akan menyebabkan jaringan tempat beradanya tampak putih, misalnya pada tendon dan aponeurosis (Mescher, 2010).
Fibroblas mensekresi molekul prokolagen ke dalam matriks intersel, dan polismerisasi mereka menjadi mikrofibril terjadi diluar sitoplasma tersebut.Pada orang dewasa, fibroblas dalam jaringan ikat jarang mengalami pembelahan.
Mitosis hanya tampak bila organisme memerlukan fibroblas tambahan, yaitu bila jaringan ikat cedera (Spector dan Spector, 2002).
2.3.1 Galur Sel NIH/3T3 tikus Swiss (Mus Musculus).
Salah satu karakteristik hewan yang paling utama adalah bahwa mereka multiselular dengan kata lain, mereka terdiri dari banyak sel. Multiseluler ini terdiri dari sel–sel dengan spesialisasi berbeda-beda.
Gambar 2. Galur Sel NIH/3T3
The '3-T3 adalah singkatan dari "3-hari transfer, inokulum 3 x 105 sel."
Galur sel ini berasal dari fibroblas embrio tikus primer yang dikultur sesuai dengan aturan atau protokol, yang disebut '3T3 protokol '. Fibroblas embrio tikus primer ditransfer ("T") setiap 3 hari (yang pertama "3"), dan diinokulasi pada kepadatan dari 3 x 105 sel-sel per 20-cm² piringan ("3" yang kedua) terus- menerus. Sel-sel yang secara spontan diabadikan dengan tingkat pertumbuhan stabil setelah dikultur dalam 20-30 generasi, dan kemudian bernama '3T3 'sel.
Galur sel (cell line) terus menerus dibentuk dari kultur NIH mouse embrio Swiss (Todaro dan Green, 1963). Galur sel NIH3T3 rentan terhadap pembentukan fokus sarkoma virus dan virus leukemia serta berharga untuk studi transfeksi DNA. Telah digunakan untuk ekspresi rekombinan protein, termasuk antigen
hepatitis B, hidroksilase fenilalanin, hormon pertumbuhan tikus, rekombinan fibronektin, human class antigen I1 MHC n, insulin reseptor manusia dan faktor pertumbuhan seperti insulin. Sel-sel dikultur dengan mengunakan DMEM + FBS10%. Sel – sel sangat mudah dihambat dan sangat sensitif terhadap kumpulan serum.
Galur sel NIH3T3 yang dipakai untuk penelitian ini diambil dari pabrik American Type Culture Collection (ATCC) dengan data sebagai berikut :
NIH/3T3 (ATCC)
Jenis Sel Fibroblast (Connective Tissue Cells, Galur sels) Deskripsi Swiss NIH embryonic fibroblast
Karakteristik Adherent
Spesies Tikus
Pemasok American Type Culture Collection (ATCC)
Klon CCL-92
Asal Jaringan Embryo
Tahap Pengembangan Jaringan
Embryonic
Protokol yang dioptimalkan
Nucleofector (PDF, 98 KB) 96-well Shuttle (PDF, 129 KB)
Related Citations Nucleofection of NIH/3T3
2.4 Apoptosis dan Telomer
Pada tahun 1961, Leonard hayflick dan Paul Moorhead memformulasikan tentang masa hidup sel diploid manusia. Pada penelitian dengan menggunakan fibroblas yang diambil dari donor muda menunjukkan kemampuan replikasi yang lebih cepat dari donor usia tua (Afshari CA and Barrett JC, 1996). Kapasitas sel untuk tidak mampu lagi bereplikasi pada kultur sel dikenal sebagai teori Hayflick’s limit. Sekarang diketahui bahwa Hayflick’s limit ini terjadi akibat perubahan panjang telomer dari kromosom, di mana pada kondisi normal ujung kromosom dilindungi oleh telomer agar tidak terjadinya fusi dari kromosom.
Telomer adalah bagian terminal dari kromosom eukaryot yang juga terimplikasi efek dari penuaan kronologis. Telomer manusia terdiri dari 15-20 kilobase pairs rantai duplex ganda TTAGGG di ikuti utas tunggal melayang g - rich 3’ yang berakhir pada struktur duplex yang dikenal sebagai t-loop. Ada hipotesis tentang t-loop ini, dimana berfungsi untuk menjaga stabilitas dari telomer atau melindungi telomer sehingga kromosom terminal terhindar dari degradasi, rekombinasi. Setiap pembelahan sel terjadi pemendekan telomer.
Untuk menjaga panjang telomer pada sel yang berproliferasi dibutuhkan enzim telomerase, yaitu enzim reverse-transkriptase eukariot yang memiliki komponen RNA dan subunit katalitik dan berfungsi dengan menambahkan ulang TTAGGG pada telomer (Mirzayans dan Murray, 2009).
Pada manusia sekitar 30% panjang telomer fibroblas kulit berkurang selama masa dewasa. Dan kritisnya dengan telomer yang pendek merupakan
sinyal bagi sel tersebut untuk apoptosis atau mati sehingga berkuranglah jumlah sel di dalam organ tersebut (Gilchrest and Krutmann, 2006). Pada sebuah penelitian diketahui bahwa dengan memasukkan telomerase pada sel yang menua atau senescent maka sel tersebut mengalami pemanjangan telomer kembali seperti pada sel muda tanpa adanya tanda-tanda malignansi. Penemuan besar ini tidak saja membuktikan bahwa peran telomer pada kehidupan sel sangat penting namun juga memberikan inspirasi bahwa panjang telomer dapat di program ulang untuk menambah panjang usia sel. Dengan penemuan ini diharapkan di kemudian hari penyakit-penyakit degeneratif seperti arteriosklerosis, alzheimer, diabetes mellitus dan sebagainya dapat disembuhkan (Hancock, 2010).
2.5 Penuaan Seluler Kulit
Proses penuaan kulit dapat disebabkan oleh faktor internal dan eksternal.
Di mana proses ini terjadi akibat hilangnya kemampuan sel kulit untuk memperbaiki kerusakan, membelah dan akhirnya mati, yang dipengaruhi oleh program genetik dan juga pengaruh buruk baik dari internal maupun eksternal selama organisme itu hidup. Walaupun penuaan kulit hanya sebagian dari proses penuaan manusia, namun data di Amerika pada tahun 1996-1997 tentang kunjungan dokter, lima persennya adalah masalah kulit dan juga menurut statistik di Amerika bahwa jumlah penduduk berusia di atas 55 tahun akan meningkat menjadi 31% di tahun 2030, maka problem penuaan kulit akan menjadi salah satu masalah yang harus dicari jalan keluarnya oleh para dokter. Penuaan kulit dibagi
dua golongan besar yaitu penuaan kronologis dan photoaging atau penuaan dini (Gilchrest dan Krutmann, 2006 ).
2.5.1 Penuaan Kulit Kronologis Tingkat Seluler
Penuaan kronologis disebabkan oleh efek kumulatif dari spesies oksigen reaktif yang terjadi akibat metabolisme oksidatif seluler. Dan walaupun tubuh mempunyai mekanisme untuk memproduksi antioksidan, namun dengan adanya spesies oksigen reaktif akan mengakibatkan rusaknya struktur-struktur sel seperti membran sel, enzim dan mengganggu interaksi antara DNA-protein juga protein- protein (Gilchrest dan Krutmann, 2006).
2.5.2 Penuaan Kulit Dini atau Photoaging Tingkat Seluler
Penuaan kulit dini atau photoaging merupakan penuaan yang terjadi akibat efek buruk kronis dari sinar matahari yang bertumpuk dengan gejala penuaan kronologis. Radiasi ultraviolet dengan panjang gelombang 100-400 nm merupakan 5% dari seluruh radiasi sinar yang ada. Radiasi ultra violet terbagi atas tiga golongan yaitu UVA (320-400nm), UVB (280-320nm) dan UVC (100- 280nm). UVC biasanya tidak sampai ke permukaan bumi kecuali pada dataran tinggi sekali dimana UVC ini diserap oleh lapisan ozon pada atmosfir. Yang paling banyak berpengaruh kepada kesehatan kulit adalah UVB, karena panjang gelombangnya yang lebih pendek dan paling banyak menembus bumi (Gilchrest dan Krutmann, 2006)
Kromofor dari UVB adalah DNA. Kelainannya berupa lesi DNA pada cyclobutane pyrimidine dimer. Secara klinis kelainannya berupa eritema atau kemerahan. Hasil akhir dari proses glikasi atau advance glycation end product (AGE) yang terakumulasi pada protein yang berusia panjang seperti matriks ekstraseluler juga berfungsi sebagai sensitiser untuk ultraviolet sehingga merusak fibroblas di dermal. Sinar UV juga terbukti meningkatkan degradasi kolagen melalui aktivasi MMP dan penurunan mekanisme sinyal TGF-β. Kemudian sinar UV dapat memacu sintesis MMP-1 dan -3 melalui pelepasan TNF-α oleh keratinosit dan fibroblas. UVB secara langsung berefek pada kerusakan DNA terutama pada dua lesi besar yaitu cyclobutane dimer dan pyrimidine pyrimidone photoproduct, yang secara langsung mempengaruhi sintesis asam nukleat.
Walaupun nukleus DNA mempunyai kemampuan untuk memperbaiki diri, kerusakan DNA jarang sekali diperbaiki secara komplit. Sisa sel yang tidak mengalami apoptosis setelah kerusakan DNA dan tidak mengalami perbaikan sempurna akan mempunyai resiko terjadinya mutasi dan akhirnya dapat menjadi sel kanker (Varani et al. 2010).
2.6 Sinar UVB
UVB merupakan spektrum radiasi UV dengan panjang gelombang 290 – 320 nm, dan merupakan sinar UV yang paling efektif menembus bumi dan mengakibatkan kerusakan pada kulit manusia. Kerusakan yang terjadi oleh karena UVB adalah lebih pada kerusakan DNA sel yang merupakan kromofornya. Sinar UVB banyak terserap ke epidermis dan menembus ke papila dermis. Gejala
kerusakan yang terjadi akibat penyerapan UVB ke epidermis berupa eritema.
Panjang gelombang dari UV yang paling efektif menyebabkan eritema yaitu 250- 290 nm dan semakin berkurang efek eritemanya seiring dengan bertambahnya panjang gelombang. Pada pajanan sinar UVB tunggal dengan dosis suberitema, gejala eritema berangsur berkurang dalam waktu 24 jam. Pada pajanan berulang akan terjadi efek kumulatif dan terjadilah eritema. Gejala eritema setelah paparan sinar UVB akan terjadi kemudian dalam waktu 3- 5 jam dan maksimal pada 12-24 jam kemudian, dan berkurang dalam 72 jam. Sebelum terjadi eritema maka akan terjadi vasodilatasi pembuluh darah. Secara histopatologis pada studi dengan potongan kulit 1 µm yang disinari UVB tunggal dengan dosis 3 MED terjadi kerusakan sel keratinosit pada 30 menit setelah paparan, dan paling jelas pada 24jam kemudian. Setelah 72 jam sel keratinosit yang rusak berubah menjadi parakeratotik dan pembesaran sel endotel terjadi setelah 30 menit sampai maksimal 24 jam setelahnya (Gilchrest dan Krutmann, 2006). Pada Penelitian di Jogja oleh Noor, 2008 terbukti dengan penyinaran UVB 300 mJ/cm2 selama 5 menit pada kultur fibroblas terjadi kerusakan DNA sel berupa cyclobutane pyrimidine dimer (Noor, 2008).
2.7 Plasma Kaya Trombosit (PKT)
Penggunaan bahan dari darah sebagai pengobatan luka sangat berkembang di bidang bedah. Dua bahan yang sangat berkembang dan banyak dipakai sebagai pengobatan dengan bahan dasar darah adalah fibrin tissue adhesive (FTA) atau
yang dikenal dengan fibrin glue dan platelet rich plasma (PRP) atau plasma kaya trombosit (PKT) (Greene et al. 2009).
Untuk mempelajari lebih lanjut tentang manfaat PKT maka harus dipahami tentang respon tubuh terhadap luka yang terdiri dari 3 fase yaitu inflamasi, proliferasi dan remodeling. Fase inflamasi yang didahului dengan agregasi trombosit sehingga terjadi hemostasis. Selain itu trombosit juga mengeluarkan thromboxane dan serotonin yang merangsang hemostasis dengan vasokonstriksi.
Selain itu trombosit juga mengeluarkan histamin yang merangsang polymorphonuclear (PMN) dan monosit ke tempat luka. Selanjutnya kemotaktik dari growth factor akan merekrut sel endotel untuk membuat pembuluh darah baru (angiogenesis), juga fibroblas terangsang untuk membentuk matriks ekstraseluler sehingga luka akan cepat menutup (Greene et al., 2009)
Bermacam sitokin dan growth factor berpengaruh terhadap penyembuhan dan maturasi dari luka. Sitokin berperan dalam perekrutan sel untuk proliferasi dan diferensiasi. Growth factor yang berasal dari trombosit atau PDGF keluar dari alfa granul dan berfungsi dalam rekrutmen dan aktivasi sel immun dan fibroblas.
Contoh produk yang telah dipakai dan disetujui oleh FDA yaitu bentuk isomer rantai β dari PDGF (PDGF-BB) yang secara klinis terbukti mempercepat penyembuhan, termasuk pada luka kronis diabetic neuropathy. Selain itu trombosit juga mengeluarkan TGF-β, yang merangsang maturasi fibroblas, migrasi, dan sintesis matriks ekstraseluler. Sedangkan growth factor lainnya yaitu EGF, dan VEGF dikeluarkan oleh fibroblas, sel endotel, dan sel immun untuk
menambah percepatan penyembuhan luka. PKT bisa didefinisikan sebagai plasma darah yang mengandung 1,000,000 trombosit/microliter dengan volume 5 ml plasma (Greene et al., 2009). Secara luas PKT diketahui mengandung 7 macam growth factor yaitu: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, TGF-β1, TGF-β2, VEGF, EGF. Kadar growth factor in-vivo tetap terjaga setelah dilakukan pembuatan PKT.
Konsentrasi trombosit dalam PKT dapat meningkat delapan kali dari kadar trombosit di dalam darah sehingga kadar growth factor di dalam PKT juga meningkat delapan kali kecuali IGF-1. Selama proses pengambilan atau pembuatannya tidak terjadi aktivasi dari trombosit (Greene et al. 2009). PKT juga disebutkan sebagai volume plasma darah autologus yang mengandung trombosit 4x nilai normal yaitu 200,000/µl. Namun belum diketahui apakah dengan peningkatan konsentrasi trombosit akan menghasilkan efek yang lebih baik (Sampson et al. 2008). Kontraindikasi dari terapi ini adalah kelainan fungsi trombosit, trombositopenia, pasien dengan ketidakstabilan hemodinamik serta kehamilan (Budiyanto, 2009).
2.7.1 Pembuatan PKT
Beberapa cara pembuatan dan proses pengambilan PKT ini sudah banyak beredar seperti SmartPrep Autologous Platelet Concentrate system (Harvest Technologies Corp) dan Magellan Autologous Separator (Medtronic Inc, Minneapolis ).
Dengan alat-alat sederhana tersebut dapat dihasilkan sepuluh persen PKT dari total darah yang diambil, yaitu berkisar dari 20 sampai 120cc (Greene et al.
2009). Namun beberapa cara konvensional dengan bantuan alat sentrifugasi dapat menghasilkan jumlah konsentrasi trombosit yang kurang lebih sama. Salah satu cara yang telah disetujui oleh FDA adalah dengan pemutaran 3200 rpm selama 15 menit dengan jumlah darah vena sebanyak 30-60 cc setelah itu plasma rendah trombosit atau supernatant bagian paling atas disedot keluar dengan spuit, lalu sisanya adalah PKT dan sel darah merah. Kemudian PKT dikocok sebanyak 30 kali, dapat dengan bantuan vortex atau resuspensi berulang. Pada akhir proses akan didapatkan jumlah PKT sebanyak 3-6 cc (Sampson et al. 2008). Cara lain juga banyak dilakukan antara lain dengan cara pengambilan darah vena sesuai kebutuhan lalu ditambahkan asam sitrat dekstrose sebanyak 10%, lalu dipusing dengan kecepatan 1100g selama 10 menit, kemudian dipisahkan antara plasma rendah trombosit yaitu sepertiga bagian atas lapisan plasma lalu dikeluarkan ke tabung terpisah untuk tidak dicampurkan ke dalam PKT. Sisa plasma (2/3 bagian bawah plasma) masukkan ke dalam tabung steril tanpa koagulan kemudian dipusing lagi dengan 2000rpm selama 2 menit atau dengan cara ultra pulse dengan bantuan vortex untuk mengaktifkan α granule (Yulianto, 2010).
2.7.2 Trombosit
Trombosit merupakan salah satu komponen darah tepi yang berbentuk diskoid tanpa inti dan berperan dalam berbagai proses hemostasis dan pertahanan alami manusia. Trombosit mempunyai karakter berbentuk bulat, berdiameter 2-4 µM, tidak mempunyai nukleus tetapi memiliki banyak vesikel dan granula. Kadar
normal trombosit 150.000 - 400.000 sel setiap µL darah. Umur trombosit dalam darah adalah 5-9 hari. Dalam trombosit dijumpai berbagai granula seperti:
granula-α, granula padat, dan granula lisosomal. Granula-α merupakan granula yang terbanyak, berkisar 50-80 granula per butir trombosit dan menyusun 10 % dari volume platelet. Riset proteomik menunjukan bahwa granula-α melepaskan ratusan protein yang diduga berperan penting pada proses penjendalan darah, penyembuhan luka, peradangan, atherosklerosis, antimikrobial, angiogenesis, dan malignansi (Blair dan Flaumenhaft, 2009). Protein-protein tersebut dapat diperoleh apabila platelet telah diaktivasi, yaitu antara lain dengan cara penambahan 10% kalsium klorida atau trombin serta adanya kolagen setempat (Wang dan Avila, 2007).
2.7.3 Growth Factor
Trombosit akan mengeluarkan growth factor, menarik dan memberi sinyal kepada stem cell untuk memperbaiki sel yang rusak atau mati. Growth factor adalah substansi yang secara alamiah ada di dalam tubuh kita, dan berguna untuk merangsang pertumbuhan sel baik proliferasi maupun diferensiasi. Biasanya growth factor adalah protein atau hormon steroid. Growth factor sangat penting dalam regulasi proses seluler. Growth factor berperan sebagai sinyal antar sel.
Contohnya sitokin dan hormon yang menempel pada reseptor dari sel target.
Mereka berperan dalam diferensiasi dan maturasi sel yang bervariasi untuk setiap growth factor. Misalnya, bone morphogenic proteins menstimulasi diferensiasi sel tulang, VEGF menstimulasi diferensiasi pembuluh darah (angiogenesis). Growth
factor akan menstimulasi siklus sel dari phase G0 menjadi phase G1. Dalam dunia kedokteran selama 20 tahun belakangan, penggunaan growth factor pada penanganan kelainan darah, kanker dan kardiovaskular sangat meningkat antara lain: neutropenia, sindrom myelodisplastik, leukemia, anemia aplastik, transplantasi sumsum tulang, angiogenesis untuk penyakit kardiovaskular serta penyembuhan luka (Sampson, 2008).
2.8 Growth factor dan Apoptosis fibroblas
Seperti proses penuaan pada sistim organ lainnya penuaan sel kulit juga dipengaruhi karena berkurangnya jumlah serta kemampuan dari mekanisme kerja beberapa macam growth factor dan hormon. Begitu juga sitokin dan kemokin yang merupakan molekul sinyal dari sel, menurun sesuai dengan bertambahnya usia. Dan diikuti juga dengan menurunnya kemampuan dari reseptor yang ada di membran sel dalam menerima sinyal. Reseptor pada sel kulit yang menurun sesuai dengan bertambahnya umur antara lain yaitu reseptor untuk vitamin D, beta adrenergik, neurotransmitter dan dopamin. Sedang di epidermis terjadi penurunan untuk reseptor interleukin-1. Pada penelitian in vitro diketahui pula bahwa pada fibroblas terjadi penurunan reseptor untuk low-density lipoprotein, PDGF dan EGF (Gilchrest dan Krutmann, 2006).
Patofisiologi dari penuaan kronologis dan prematur diketahui sama walaupun etiologinya berbeda. Perubahan yang terjadi diketahui yaitu menurunnya TGF-β
dengan mekanismenya dan peningkatan enzim MMP. Pada akhirnya akan terjadi penurunan kemampuan fibroblas untuk mitosis dan memperbaiki dirinya dan terjadilah apoptosis. Apabila keadaan ini terjadi melebihi mekanisme pertahanan yang dibutuhkan maka akan terjadi tanda-tanda penuaan, seperti kerut dan kendur (Varani et al. 2010). Beberapa growth factor yang dapat memperbaiki kerusakan fibroblas, FGF, PDGF, IGF-1, TGF-β (Mehta dan Fitzpatrick, 2010).
Kemungkinan efek samping yang ditakuti dari pemakaian growth factor dalam peremajaan kulit adalah timbulnya kanker, akibat stimulasi pertumbuhan secara berlebihan. Para ahli masih menyelidiki hal ini, disebabkan beberapa pemahaman tentang modalitas anti penuaan kulit lainnya selama ini yang telah banyak dilakukan, juga terbukti meningkatkan pengeluaran growth factor yang melebihi normal seperti proses inflamasi yang terjadi pada saat terapi chemical peeling dan retinoid topikal dan laser (Mehta dan Fitzpatrick, 2010).
BAB III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Berpikir
Secara alamiah tubuh kita akan mengalami penurunan baik fungsi maupun fisik pada semua organ tubuh termasuk kulit. Penuaan kulit dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal. Faktor internal meliputi: radikal bebas, glikosilasi, cellular senescence, apoptosis, hormonal, genetik. Faktor eksternal meliputi: sinar ultra violet, makanan yang dikonsumsi, kurangnya tidur, merokok, kurangnya olah raga, penggunaan kosmetik yang tidak benar dan lain-lain. Penuaan kulit dapat terjadi secara kronologis maupun prematur atau dikenal dengan photoaging yang disebabkan terutama oleh UVB.
Patofisiologi dari penuaan kulit ini terutama adalah perubahan di lapisan dermis yaitu kerusakan kolagen dan perubahan di epidermis yaitu berhubungan dengan kelainan kanker. Penelitian tentang penuaan kulit banyak sekali berfokus pada kolagen, karena protein jaringan ikat ini paling banyak di dalam tubuh manusia, dan memegang peranan penting dalam mencegah terjadinya tanda–tanda penuaan seperti keriput dan kulit kendur.
Perubahan kolagen pada penuaan kronologis dan prematur atau photoaging mempunyai mekanisme yang sama, walau etiologi berbeda. Yaitu meningkatnya enzim MMP dan menurunnya TGF-β serta efek lain yang timbul bersamaan dengan mekanisme tersebut. Akhirnya akan terjadi penurunan kemampuan dari fibroblas dalam membentuk kolagen baru.
31
Bagan 3.1 Konsep Faktor Internal :
- Hormonal
- Genetik (Telomer) - Imun Sistem - Glikosilasi -
Tikus galur sel NIH3T3
Faktor Eksternal : - Stress
- Radikal bebas
- Bahan kimia dan obat-obatan - Diet
- Kurang tidur - Rokok PKT
APOPTOSIS FIBROBLAS NIH3T3
Oleh sebab itu penelitian tentang growth factor dalam PKT untuk memperbaiki penuaan kulit banyak diteliti. Dengan menambahkan growth factor ke dalam kulit yang mulai rusak diharapkan dapat membantu fibroblas untuk memperbaiki diri sehingga terhindar dari kematian atau apoptosis.
3.2 Hipotesis Penelitian
Berdasarkan kerangka konsep, maka hipotesis yang dapat diajukan adalah 1. Pajanan sinar UVB pada fibroblas meningkatkan apoptosis sel.
2. Pemberian plasma kaya trombosit pada fibroblas yang diberi pajanan UVB dapat menurunkan apoptosis sel.
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menggunakan rancangan Randomized post test only control group design (Campbell, 1963).
Skema rancangan penelitian digambarkan sebagai berikut :
Bagan 4.1 Rancangan Penelitian
P = Populasi biakan fibroblas S = Sampel fibroblas
P0 = Tanpa perlakuan (kontrol) P1 = Perlakuan dengan UVB 2 menit P2 = Perlakuan denan UVB 3 menit
P3 = Perlakuan dengan UVB 2 menit dan PKT sebelum penyinaran P4 = Perlakuan dengan UVB 3 menit dan PKT sebelum penyinaran P5 = Perlakuan dengan UVB 2 menit dan PKT sesudah penyinaran
34
P6 = Perlakuan dengan UVB 3 menit dan PKT sesudah penyinaran O1 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok kontrol
O2 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok perlakuan 1 O3 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok perlakuan 2 O4 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok perlakuan 3
O5 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok perlakuan 4 O6 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok perlakuan 5 O7 = Ekspresi Sub-G1 post test kelompok perlakuan 6
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di laboratorium Stem cell and Cancer Institute (SCI), Jakarta. Waktu penelitian mulai bulan Desember 2010 sampai Februari 2011.
4.3 Populasi Subjek dan Sampel Penelitian 4.3.1 Populasi Subjek penelitian
Populasi subjek penelitian adalah Galur NIH3T3 dari tikus putih Swiss (Mus musculus).
4.3.2 Sampel Penelitian adalah dengan kriteria subjek:
4.3.2.1 Kriteria inklusi:
a. Fibroblas hidup.
4.3.2.2 Kriteria Drop Out
a. Sample rusak akibat kesalahan tehnis pada saat pelaksanaan penelitian.
b. Sel tidak hidup dengan baik pada medium kultur atau mati.
4.4 Penentuan Besar dan Cara Pengambilan Sampel
4.4.1 Penentuan besar sampel minimal
Besarnya sampel ditentukan berdasarkan rumus Federer (Federer et al., 1966):
Rumus Federer :
( t-1 ) ( n-1 ) ≥ 15 (6-1) (n-1) > 15 5 (n-1)> 15 5n-5>15 5n>20 N> 4 Keterangan:
t = jumlah kelompok perlakuan (treatment) n = jumlah ulangan pada tiap kelompok
Dari rumus diatas, karena kelompok perlakuannya adalah 6, maka di dapat jumlah ulangan untuk tiap kelompok adalah 4. Untuk mengantisipasi kemungkinan drop out, maka jumlah sampel ditambah 10%, sehingga pada tiap kelompok terdiri dari 5 well koloni fibroblas. Karena percobaan menggunakan 6 well plate maka dilakukan pengulangan pada setiap kelompok 6 kali, jadi jumlah sampel seluruhnya dengan kelompok kontrol adalah 42 well plate koloni sel yang diambil secara simpel random.
4.5 Variabel Penelitian
4.5.1 Identifikasi Variabel 1.Variabel internal: genetik.
2.Variabel eksternal: lingkungan, suhu.
4.5.2 Klasifikasi Variabel
a. Variabel bebas : perlakuan dengan UVB dan PKT .
b. Variabel tergantung : Ekspresi Sub-G1 (apoptosis) fibroblas
c. Variabel terkendali : tipe fibroblas, asal atau sumber isolasi sel, medium kultur dan lingkungan, mesin centrifuge, ketrampilan petugas dalam tehnik pemanenan sel, higienitas, serta tehnik penanaman sel dalam medium kultur serta instrumen penghitungan nilai ekspresi sub-G1 (apoptosis) .
4.5.3 Definisi Operasional Variabel 1. Variabel bebas
a. PKT adalah plasma darah yang diambil dari vena sebanyak 60 cc dari probandus yang telah diukur kadar trombositnya lebih dahulu ke dalam tabung yang berisi anti koagulan sitrat phosphate dextrose disentrifugasi 1100g selama 10 menit lalu dibuang supernatannya sampai sepertiga atas bagian supernatannya yaitu lapisan plasma rendah trombosit. Kemudian dikeluarkan sisa supernatan sampai buffy coat dan dipindah ke tabung bersih, lalu disentrifugasi kembali
