Astri Rahayu Resa Gusmayanti
KROMATOGRAFI KOLOM
1. Pengertian Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang pertama kali di lakukan oleh D.T.Davy yaitu untuk membedakan komposisi minyak bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi. Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparatif.
2. Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen – komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masing-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom.
3. Tujuan kromatografi kolom
Untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti dengan penambahan fase mobile. Metode basah, sebuah bubur disiapkan dari eluent dengan fase diam bubuk dan kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan eluent. Eluent perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan organik.
4. Persyaratan Kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih adsorben yang ukuran butir – butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik. Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom. Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang di atas kolom dengan menggunakan pompa pneumatic.
5. Perhitungan Efesiensi Kolom
Semakin lebar suatu puncak kromatografi yang sebanding dengan waktu retensinya, semakin kurang efesien kolom pengelusinya.
Persamaan 1
Pengukuran efesiensi kolom yang lebih ketat, terutama jika waktu retensi analit tersebut singkat, di nyatakan dengan.
Persamaan 2
N eff = 5, 54 (t’r : W1/2)²
Dengan N eff adalah jumlah pelat yang efektif dan mencerminkan berapa kali analit berpartisi antara fase gerak dan fase diam selama pergerakannya melalui kolom dan t’r =tr – t0
Persamaan lain yang di gunakan sebagai pengukuran adalah H, “tinggi pelat teoretis” H=L/N eff
Dengan H adalah panjang kolom yang di butuhkan untuk berlangsungnya satu tahap partisi
6. Peralatan Kromatografi Kolom
Alat utama yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 5 cm - 1 m. Pada bagian dasar tabung diberi semacam penyaring dari glass wool untuk menghindari hilangnya fasa diam. Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat padat aktif seperti alumino dan selika gel sebagai fase diam. Zat yang dimasukan lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat diserap dari larutan secara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda, sehingga terjadi pemisahan dalam kolom. Hasil pemisahan ini disebut kromatogram.
7. Fasa gerak
8. Fasa diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas permukaan. Ada rasio penting antara berat fasa diam dan berat kering campuran analit yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan jarak elusi antar komponen analit.
9. Jenis Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan : Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.
Kromatografi Fase Terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
10. Manfaat Kromatografi Kolom
Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
11. Kelebihan Dan Kekurangan Kromatografi Kolom Kelebihan kromatografi kolom :
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kekurangan kromatografi kolom :
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (timeconsuming)
12. Metode
Dua metode utama yang digunakan yaitu metode kering dan metode basah: Metode kering
Pada metode kering, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.
Pada metode basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benar-benar hati-hati supaya tidak ada gelumbung udara. Larutan senyawa organik dipipet di bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.
Cara pengisian kolom terbagi dua , yaitu : 1. Cara basah
- Isi dasar kolom dengan kapas - Masukkan eluen
- Campurkan dengan rata sebagai adsorben dan eluen menjadi homogen - Jangan tersentuh atau diguncangkan ± 6 jam
- Setelah stabil, masukkan eluen dan zat, lalu keluarkan eluen
2. Cara kering
- Isi tabung dengan kapas - Masukkan eluen
- Masukkan adsorben kering sedikit demi sedikit - Lalu di aduk
13. Cara Kerja Kromatografi Kolom
1. Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat. 2. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen
sesuai dengan kesesuaian kepolaran.
3. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. 4. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk
mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. 5. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi
dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi.
