1. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 3.1. Alat Penelitian
Berikut merupakan peralatan penelitian yang dipergunakan diantaranya yaitu Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, pH meter digital, cawan petri, gelas ukur, labu Erlenmeyer250 ml, 500 ml, dan 1000 ml,beaker glass, tabung reaksi, kertas whatman no.41, hot plate, magnetic stirrer, shaker, timbangan analitik, corong, thermometer, kompor gas, pembakar spirtus, pinset, jarum ose, spatula, bor gabus diameter 5 mm, pisau, gunting, penyaring, inkubator, sprayer, corong Buchner dan alat penyaring (pompa vakum).
a. Bahan Penelitian
Berikut merupakan bahan-bahan penelitian yang dipergunakan diantarnya yaitu limbah cair minyak kelapa dari Desa Kedung Kamal, Kecamatan Grabag, Kabupaten Purworejo; 4 (empat) isolatTrichodermaspp. (isolat rhizosfer jahe, isolat rhizosfer bawang merah, isolat rhizosfer pisang dan Trichoderma spp. hasil isolasi dari rhizosfer nanas), koleksi Prof. Loekas Soesanto, M.Sc., Ph.D di Laboratorium Hama dan Penyakit Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto), alkohol 70%, wrapper, kertas label, alumuniumfoil, kapas, akuades, tissue,medium Potato Dextrose Yeast Broth (PDYB), mediumPotato Dextrose Agar (PDA), dan medium limbah cair minyak kelapa.
b. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Fakultas Biologi, Laboratorium Hama dan Penyakit Tanaman Fakultas Pertanian, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Pelaksanaan penelitian yaitu 7 bulan, dari bulan Mei 2014– November 2014.
2. Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Perlakuan yang dicobakan terdiri atas 4 macam, yaitu:
TJ = limbah cair minyak kelapa yang diinokulasi isolatTrichoderma sp. rhizosfer jahe.
TB = limbah cair minyak kelapa yang diinokulasi isolatTrichodermasp. rhizosfer bawang merah.
Setiap perlakuan diulang sebanyak 7 kali ulangan sehingga terdapat 28 unit percobaan. Pengukuran bobot kering saring miselium kapangTrichodermaspp. tidak memerlukan perlakuan kontrol.
Variabel penelitian yang diamati adalah variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebasnya adalah isolatTrichodermaspp., variabel tergantungnya adalah pertumbuhan isolat Trichoderma spp. pada limbah cair minyak kelapa. Parameter utama adalah selisih bobot panenan miselium yang telah ditumbuhkan pada limbah cair minyak kelapa dengan bobot inokulum Trichoderma spp. sedangkan parameter pendukungnya adalah pH, persentase penurunan COD, persentase penurunanBODpada limbah cair minyak kelapa.
3. Cara Kerja 3.3.1. Sterilisasi Alat (Davet & Rouxel, 1997)
Alat-alat yang terbuat dari bahan gelas disterilisasi terlebih dahulu. Sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C, tekanan 2 atm selama 15-20 menit.
Alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilisasi menggunakan alcohol 70% dan nyala lampu spirtus.
3.3.2. Pembuatan mediumPotato Dextrose Agar (PDA)(Davet & Rouxel, 1997) Kentang 200 gram yang sudah dibuang kulitnya dan dipotong dadu kecil-kecil kemudian direbus dengan 500 ml akuades dan disaring. Agar 15 gram dicampur dengan 300 ml akuades kemudian dipanaskan. Agar yang larut dalam akuades dicampurkan dengan dekstrose 20 gram dan air rebusan kentang. Kemudian medium tersebut ditambahkan akuades hingga volumenya menjadi 1000 ml. Medium PDA dimasukkan ke dalamlabu Erlenmeyer2000 ml dan disumbat dengan kapas. Langkah berikutnya, medium PDA tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 2 atm selama 15-20 menit. Medium PDA yang telah steril kemudian dituang ke dalam cawan petri steril secara aseptis dan digunakan untuk peremajaan isolatTrichodermaspp..
3.3.3. Peremajaan Isolat Kapang (Davet & Rouxel, 1997)
Isolat-isolat kapang yang digunakan, diremajakan di dalam cawan petri yang berisi medium PDA, kemudian diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu ruang. Peremajaan dilakukan secara aseptis diLaminar Air Flow (LAF).
3.3.4. Pembuatan mediumPotato Dextrose Yeast Broth (PDYB)(Wehr & Frank, 2004).
Kentang 200 gram dikupas kulitnya dan dipotong dadu selanjutnya direbus dengan 800 ml akuades sehingga menjadi lunak. Air hasil rebusan kentang tersebut disaring kemudian ditambahkan dekstrose 10 gram dan yeast ekstrak 2 gram. Kemudian medium tersebut ditambahkan akuades hingga volumenya menjadi 1000 ml. Selanjutnya, mediumPDYBdituangkan masing-masing sebanyak 100 ml ke dalam labu Erlenmeyer250 ml. MediumPDYBdisterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C tekanan 2 atm selama 20 menit.
3.3.5. Penentuan kadar air miselium kapangTrichodermaspp.
3.3.5.1. KultivasiTrichodermaspp. pada mediumPDYB(Wikolazka et al.,2008) KapangTrichodermaspp. yang telah ditumbuhkan pada mediumPDAdiambil sebanyak 5 plug menggunakan bor gabus steril berukuran 5 mm dan dimasukkan ke dalam masing-masing 100 ml medium PDYB pada labu Erlenmeyer berukuran 250 ml, selanjutnya diinkubasi selama 4 hari menggunakanshaker.
3.3.5.2. Pemanenan dan pengukuran bobot kering saring miselium kapang
Trichodermaspp. pada mediumPDYB(Subowo, 2009).
Pemanenan miselium kapang Trichoderma spp. dilakukan setelah waktu inkubasi selama 4 hari. Medium PDYB berisi miselium kapang Trichoderma spp. dituangkan ke dalamcorong buchner yang beralaskan kertas saring Whatman no.41. Penyaringan dilakukan dengan bantuan corong buchner yang terhubung dengan pompa vakum. Kemudian ditimbang bobot kering saring miseliumnya menggunakan timbangan analitik.
3.3.5.3. Pengukuran bobot kering konstan miselium kapangTrichodermaspp. pada mediumPDYB(Subowo, 2009).
Pengukuran bobot kering konstan miselium Trichoderma spp. dilakukan dengancara miselium yang dipanen tesrsebut diatas dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 600C selama 24 jam. Kemudian miselium tersebut ditimbang dengan
3.3.5.4. Perhitungan kadar air (Irianto et al., 2004)(Modifikasi).
Bobot kering saring miselium yang telah ditumbuhkan pada medium PDYB dan bobot kering konstan miselium (miselium yang telah dikeringkan menggunakan oven) ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik. Perhitungan kadar air dilakukan untuk mengetahui banyaknya air yang terkandung pada miselium Trichoderma spp. yang dinyatakan dalam persen. Persentase kadar air digunakan sebagai acuan untuk mendapatkan bobot konstan inokulum Trichoderma spp.. Persentase kadar air dapat diperoleh dengan cara mengetahui selisih bobot kering saring miselium dengan bobot kering konstan miselium yang telah ditumbuhkan pada mediumPDYB. Kemudian dihitung persentasenya dengan menggunakan rumus:
Persentase Kadar Air=(bobot kering saring miselium–bobot kering konstan miselium)
bobot kering saring miselium 100% 3.3.6. Pengukuran pH awal medium limbah cair minyak kelapa (Raharjanti,
2006).
Nilai pH dalam medium kultivasi diukur dengan menggunakan pH meter digital. Alat pH meter dinyalakan dan pH dikalibrasi menggunakan larutan buffer 4 dan 7, lalu elektroda pH meter dicelupkan ke dalam medium limbah cair minyak kelapa kemudian dilihat angka digital yang terdapat di alat pH meter tersebut. 3.3.7. Pengukuran suhu awal medium limbah cair minyak kelapa (Lestari et
al.,2009).
Pengukuran suhu awal perlakuan diukur dengan mencelupkan thermometer laboratorium ke dalam medium limbah cair minyak kelapa selama beberapa menit sampaiair raksa yangterdapat didalamthermometerlaboratorium berhenti. Kemudian dilihat berapa derajat suhu yang ditunjukkan olehthermometerlaboratorium tersebut. 3.3.8. Uji kemampuan tumbuhTrichodermaspp. pada limbah cair minyak
kelapa.
3.3.8.1. Penyiapan inokulumTrichodermaspp. (Soesanto et al.,2011).
Kapang Trichoderma spp. yang ditumbuhkan pada medium PDA diambil sebanyak 5 plug menggunakan bor gabus steril berukuran 5 mm dan dimasukkan ke dalam masing-masing 100 ml medium PDYB pada labu Erlenmeyer berukuran 250 ml. Setelah itu, diinkubasi menggunakan shaker inkubator selama 4 hari.
3.3.8.2. Kultivasi miselium kapangTrichodermaspp.pada medium limbah cair minyak Kelapa (Wikolazka et al.,2008).
spp. memiliki bobot miselium yang seragam. Selanjutnya inokulum tersebut diinokulasikan ke dalam medium limbah cair minyak kelapa dan diinkubasi selama 5 hari. Dengan telah diketahuinya kadar air inokulum berdasarkan perlakuan pada 3.3.5.4 (perhitungan kadar air) maka dapat diketahui pula bobot inokulum tersebut. 3.3.8.3. Pemanenan dan pengukuran bobot panenan miselium kapang
Trichodermaspp. pada medium limbah cair minyak kelapa (Subowo, 2009).
Pemanenan miselium kapang Trichodermaspp. dilakukan setelah diinkubasi selama 5 hari. Pemanenan dilakukan dengan cara inokulumTrichodermaspp. disaring menggunakan corong Buchner yang beralaskan kertas saring Whatman no.41. Miselium yang tersaring pada kertas saring whatman dilepaskan dari kertas saringnya untuk dimasukkan ke dalam cawan petri yang bersih. Dilanjutkan dengan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 600C selama 24 jam. Miselium ditimbang dengan
menggunakan timbangan analitik sehingga akan diperoleh bobot panenan miselium. 3.3.8.4. Penentuan pengukuran pertumbuhan miseliumTrichodermaspp. pada
limbah cair minyak kelapa (Martinius et al., 2010) (Modifikasi).
Kemampuan tumbuh miselium Trichoderma spp. dapat diketahui dengan menghitung selisih antara bobot panenan miselium yang telah ditumbuhkan pada limbah cair minyak kelapa dengan bobot inokulum.
Pertumbuhan Miselium = A – B
Keterangan : A = Bobot panenan miselium B = Bobot inokulum
3.3.9. Pengukuran pH akhir medium limbah cair minyak kelapa (Raharjanti, 2006).
Nilai pH dalam medium kultivasi diukur dengan menggunakan pH meter digital. Alat pH meter dinyalakan dan pH dikalibrasi menggunakan larutan buffer 4 dan 7, lalu elektroda pH meter dicelupkan ke dalam medium limbah cair minyak kelapa kemudian dilihat angka digital yang terdapat di alat pH meter tersebut. 3.3.10. Pengukuran Suhu akhir medium limbah cair minyak kelapa (Lestari et
al ., 2009).
Pengukuran suhu akhir perlakuan diukur dengan mencelupkan thermometer laboratorium ke dalam medium limbah cair minyak kelapa selama beberapa menit sampai air raksa yang terdapat di dalam thermometer laboratorium berhenti.
3.3.11. PengukuranChemical Oxygen Demand (COD)(Togatorop, 2009).
Sampel diambil sebanyak 20 ml, dimasukkan ke dalam labu didih 300 ml, ditambahkan K2Cr2O7 0,25N; 0,4 gr H2SO4; 40 ml asam sulfat yang mengandung
silver sulfat dan batu didih. Selama 10 menit dipanaskan dan didihkan dengan direflux menggunakan kondensor, didinginkan dan dicuci dengan 50 ml air suling. Selanjutnya ditambahkan 2 tetes indikator ferroin dan titrasi dengan amonium ferro sulfat 0,25N hingga terjadi perubahan warna dan biru kehijauan menjadi merah kecoklatan, kemudian mencatat volume yang digunakan. Diindikasikan sebagai (B). Dengan melakukan prosedur yang sama, dilakukan titrasi terhadap blanko air suling sebanyak 20 ml dengan menggunakan 0,25 amonium ferro sulfat. Diindikasikan sebagai (A). Perhitungan:
= ( / )
Keterangan :
A = ml titrasi blanko (mg o2/l)
B = ml titrasi sampel (mg o2/l)
M = molaritas (0,25) (mg o2/l)
8000 = iliequivalent berat oksigen x 1000 ml/l
3.3.12. PengukuranBiochemical Oxygen Demand (BOD)(Togatorop, 2009). PenentuanBODdilakukan dengan menetralkan air sampel sampai pH 7,0 ± 0,1 dengan penambahan asam (HCl) atau basa (NaOH). Sebanyak 30 ml air sampel diencerkan sampai 2 liter, dengan derajat pengenceran 0,015. Kemudian dua larutan blangko dari air pengencer dandua larutan sampel dari air yang telah diencerkan dimasukkan pada botol-botol BOD. B0: blangko untuk hari ke-0 dan B5: untuk hari ke-5, sedangkan S0: sampel untuk hari ke-0 dan S5: sampel untuk hari ke-5. Botol-botol tersebut disimpan dalam inkubator, suhu 200C ± 10C selama 1 jam, kemudian
botol B0 dan S0 dibuka untuk ditentukan kadarDO(Demand Oxygen), edangkan botol B5 dan S5 tetap disimpan dan baru ditentukan kadarDO(Demand Oxygen) pada hari ke-5. KadarBODditentukan dengan perhitungan berikut:
= (mg O2/I)
Keterangan :
S0 = kandungan O2 terlarut sampel hari ke-0 (mg O2/I) S5 = kandungan O2 terlarut sampel hari ke-5 (mg O2/I) B0 = kandungan O2 terlarut blangko hari ke-0 (mg O2/I) B5 = kandungan O2 terlarut blangko hari ke-5 (mg O2/I)
3.3.13.Penentuan Persentase PenurunanBODdanCOD(Fatha, 2007).
Pengukuran persentase penurunanBOD danCODlimbah cair minyak kelapa dilakukan dengan rumus sebagai berikut:
PenurunanBOD:
= − %
PenurunanCOD:
= − %
4. Metode Analisis ( Steel & Torrie, 1993)
Data pertumbuhan Trichoderma spp. pada limbah cair minyak kelapa dianalisis secara deskriptif.
