K
Keeppaaddaa YYtthh :: TTuuggaass PPeennddaahhuulluuaann Rencana Baca : Selasa, 1
Rencana Baca : Selasa, 1 Februari 2011Februari 2011
ENZYME IMMUNOASSAY
ENZYME IMMUNOASSAY
Patricia M.Tauran
Patricia M.Tauran, Nurul H, Tenri Esa, Nurul H, Tenri Esa
Bagian Patologi Klinik FK-UNHAS/BLU RS Wahidin Sudirohusodo Makassar Bagian Patologi Klinik FK-UNHAS/BLU RS Wahidin Sudirohusodo Makassar
I.
I. PPEENNDDAAHHUULLUUAANN
Imunoasai adalah suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar Imunoasai adalah suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi dan antigen dalam cairan tubuh atau serum seseorang. Imunoasai dapat dibagi antibodi dan antigen dalam cairan tubuh atau serum seseorang. Imunoasai dapat dibagi men
menjadjadi i 2 2 kelkelompompok ok menmenuruurut t jenjenisnisnya, ya, yaiyaitu tu imuimunoanoasai sai tak tak berberlablabel el dan dan imuimunoasnoasaiai berlabel. Imunoasai tak berlabel terdiri dari beberapa teknik, yaitu : uji presipitasi, uji berlabel. Imunoasai tak berlabel terdiri dari beberapa teknik, yaitu : uji presipitasi, uji
aglut
aglutinasiinasi, , uji hemaglutinuji hemaglutinasi, asi, lisilisis s imun imun dan dan fiksafiksasi si komplekomplemen, men, sertserta a uji uji netranetralisaslisasi.i. Sedangkan imunoasai berlabel juga terdiri dari beberapa teknik yaitu : asai berlabel Sedangkan imunoasai berlabel juga terdiri dari beberapa teknik yaitu : asai berlabel fl
fluouoreresesens ns (( Fl Fluoreuorescenscent t ImmImmunoaunoassayssay atatau au FIFIA)A), , asasai ai beberrllababel el rradadiioioissototopop (( Radioimmunoassay Radioimmunoassay atau RIA), asai berlabel luminescent (atau RIA), asai berlabel luminescent ( Lumin Luminescent escent ImmunoaImmunoassayssay aattaau u LLIIAA)), , aassaai i bbeerrllaabbeel l eennzziim m (( E Enzynzyme me ImImmumunonoassassayay aattaau u EIIAE A)),, Immunochromatographic Assay
Immunochromatographic Assay atau ICA dan uji imunoperoksidase.atau ICA dan uji imunoperoksidase.11
Yalow dan Berson mengembangkan metode
Yalow dan Berson mengembangkan metode Radio Radioimmunoimmunoassay assay (RIA)(RIA) pada tahunpada tahun 1959
1959 dendengan gan menmenggunggunakan akan lablabel el radradioaioaktiktif f yanyang g dapdapat at menmengidgidententifiifikaskasi i komkomponeponenn immun pada konsentrasi yang sangat rendah. Pada tahun 1960-an, para peneliti mulai immun pada konsentrasi yang sangat rendah. Pada tahun 1960-an, para peneliti mulai mencari pengganti metode RIA karena kelemahannya menggunakan radioaktif isotop mencari pengganti metode RIA karena kelemahannya menggunakan radioaktif isotop sebagai label.
sebagai label.22 Kekurangan penggunaan radioaktif tersebut berkaitan dengan keselamatanKekurangan penggunaan radioaktif tersebut berkaitan dengan keselamatan
petug
petugas as laborlaboratoriatorium, um, masalmasalah ah pembuapembuangan ngan radioradioaktifaktif, , fasifasilitalitas s laborlaboratoriatorium um khususkhusus dengan persyaratan gedungnya dan mahalnya peralatan yang dibutuhkan.
dengan persyaratan gedungnya dan mahalnya peralatan yang dibutuhkan.33
Kelemahan dari
Kelemahan dari Radioimmunoassay Radioimmunoassay mendorong para peneliti untuk mencari suatumendorong para peneliti untuk mencari suatu label pengganti yang lebih sederhana, lebih murah, dengan reagen yang dapat tahan lebih label pengganti yang lebih sederhana, lebih murah, dengan reagen yang dapat tahan lebih lama dan dapat dipakai oleh hampir semua laboratorium serta mudah dibuat otomatis. lama dan dapat dipakai oleh hampir semua laboratorium serta mudah dibuat otomatis. Muncullah kemudian gagasan untuk memakai enzim sebagai label dan lahirlah suatu Muncullah kemudian gagasan untuk memakai enzim sebagai label dan lahirlah suatu imunoasai yang baru yaitu
imunoasai yang baru yaitu Enzyme Immunoassays Enzyme Immunoassays (EIA).(EIA).11
Teknik EIA pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh Anton Schuurs sebagai Teknik EIA pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh Anton Schuurs sebagai peneliti utama dan Bauke van Weemen di laboratorium penelitian NV Organon, Oss, peneliti utama dan Bauke van Weemen di laboratorium penelitian NV Organon, Oss,
Bel
menggunakan plate mikrotiter-96 sumur. Tes ini kemudian menjadi EIA yang pertama kali dikomersilkan dan kemudian diikuti oleh tes diagnostik mikrobiologi dan virologi lain seperti antigen Hepatitis B "e" (HBe), antibodi Rubella, antibodi Toxoplasma dan
antibodi Human Immunodeficiency Virus pada tahun 1980-an.3
II. DEFINISI
Enzyme immunoassay (EIA) adalah tes untuk mendeteksi antigen atau antibodi dengan penambahan enzim yang dapat mengkatalisa substrat sehingga terjadi perubahan warna.2,4
Metode EIA menggunakan sifat katalisa dari enzim untuk mendeteksi dan menghitung jumlah reaksi imunologi. Gabungan antibodi berlabel enzim atau antigen berlabel enzim digunakan pada pemeriksaan imunologi. Enzim dan substratnya
mendeteksi keberadaan dan jumlah antigen atau antibodi yang terdapat pada sampel pasien.2
Untuk dapat digunakan pada EIA, enzim harus memenuhi kriteria :
- Stabilitas tinggi
- Spesifitas tinggi
- Tidak mengandung antigen atau antibodi
- Tidak ada perubahan oleh inhibitor dalam sistem.2
Tabel 1. Enzim-enzim yang Digunakan pada EIA2
Enzim Sumber Acetylcholinesterase Alkaline phosphatase β-Galactosidase Glucose oxidase Glocose-6-phosphatase dehydrogenase (G6PD) Lysozyme Malate dehydrogenase Peroxidase Electrophorous electicus Escherichia coli Escherichia coli Aspergillus niger Leuconostoc mesenteroides Putih telur Jantung babi Lobak
Enzim berlabel yang sering digunakan yaitu horseradish peroxidase, alkaline
Enzyme Immunoassay (EIA) memiliki keuntungan dan kerugian, yaitu : A. Keuntungan
1. Tes yang sensitif dapat diperoleh dengan efek penguatan dari enzim.
2. Reagen relatif murah dan jangka waktunya panjang.
3. Dapat menghasilkan tes multiple secara simultan.
4. Dapat menghasilkan konfigurasi tes dengan variasi yang luas.
5. Tidak ada bahaya radiasi selama pemberian label atau pembuangan sampah. B. Kerugian
1. Pengukuran aktivitas enzim dapat lebih kompleks dibandingkan dengan
pengukuran dengan beberapa tipe radioisotop.
2. Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh konstitusi plasma.
3. Pada saat ini tes homogen memiliki sensitivitas 10-9M dan tidak sesensitif radioimmunoassay.
4. EIA homogen untuk protein yang besar dapat dihasilkan tetapi membutuhkan
reagen imunokimia yang kompleks.5
III.METODE
Pada tes EIA, sebuah manik plastik atau plat plastik dilapisi dengan antigen (contoh: virus). Antigen bereaksi dengan antibodi pada serum pasien. Manik atau plat kemudian di inkubasi dengan sebuah gabungan enzim-antibodi berlabel. Jika terdapat antibodi, gabungan tersebut bereaksi dengan kompleks antigen-antibodi pada manik atau plate. Aktivitas enzim diukur dengan spektrofotometer setelah penambahan substrat kromogenik spesifik. Misalnya, peroksidase mengkatalisa substratnya, o-dianisidine, menyebabkan perubahan warna. Pada beberapa kit , tes EIA dapat dibaca secara langsung (visual).2,6
Hasil pada tes EIA dapat juga dinilai dengan membandingkan hasil spektofometer serum pasien dengan referensi serum kontrol. Keunggulan tes secara objektif adalah hasilnya tidak tergantung dari interpretasi teknisi. Pada umumnya prosedur EIA lebih
A. Deteksi Antigen
EIA tipe deteksi antigen terdiri atas 4 langkah “
1. Antibodi yang spesifik terhadap antigen dilekatkan pada suatu permukaan fase
padat (a solid-phase surface) atau suatu manik-manik plastik.
2. Ditambahkan serum pasien yang mungkin mengandung atau tidak mengandung
antigen.
3. Ditambahkan suatu antibodi yang spesifik terhadap antigen tertentu yang berlabel
enzim (conjugate).
4. Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika terdapat
enzim. Warna yang terbentuk sesuai dengan jumlah antigen yang terdapat pada sampel pasien.2,4
Gambar 1. Langkah-langkah pemeriksaan EIA tipe antigen detection.4
EIA antibody detection terdiri dari 3 tipe yaitu noncompetitive EIA, competitive EIA dan capture EIA.
a. Noncompetitive EIA
1. Antigen yang spesifik dilekatkan pada suatu permukaan fase padat
(manik-manik plastik atau sumur mikrotiter).
2. Ditambahkan serum pasien yang mungkin mengandung atau tidak
mengandung antibodi.
3. Ditambahkan antibodi yang spesifik terhadap antibodi sebelumnya yang
telah dilabel dengan enzim (conjugate).
4. Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika
terdapat enzim. Warna yang terbentuk sesuai dengan jumlah antibodi yang terdapat pada sampel pasien.2,4
Gambar 2. Langkah-langkah pemeriksaan noncompetitive EIA.4
b. Competitive EIA
2. Serum pasien yang mungkin mengandung atau tidak mengandung antibodi ditambahkan ke dalam plate bersama-sama dengan penambahan antibodi berlabel enzim (conjugate) yang akan berkompetisi untuk memperebutkan antigen yang sama.
3. Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika
terdapat enzim. Jumlah warna yang terjadi berbanding terbalik dengan jumlah antibodi yang terdapat pada sampel pasien.2,4
Gambar 3. Langkah-langkah pemeriksaan competitive EIA.4
c. Capture EIA
Sebuah capture EIA dirancang untuk mendeteksi tipe spesifik dari antibodi, seperti IgG atau IgM.
1. Antibodi yang spesifik terhadap IgG atau IgM dilekatkan pada suatu permukaan fase padat (manik-manik plastik atau sumur mikrotiter).
2. Sampel pasien yang mengandung IgG atau IgM ditambahkan.
3. Ditambahkan antigen yang spesifik.
4. Ditambahkan sebuah antibodi yang spesifik terhadap antigen yang berlabel enzim
(conjugate).
5. Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika terdapat
enzim. Warna yang terbentuk sesuai dengan jumlah antigen yang spesifik
terhadap IgG atau IgM yang terdapat pada sampel pasien.2,4
Gambar 4. Langkah-langkah pemeriksaan capture EIA.4
Tabel 2. Klasifikasi EIA dan Contoh Tes :2,4
Tipe EIA Tes
Antigen Detection • Hepatitis B surface Antigen
• Hepatitis C
• Hepatitis B surface Antibody
• HIV Antibody
• Measles IgG
• Mumps IgG
• Rubella IgG
• VZV IgG
Competitive EIA • Hepatitis B core Antibody
Capture EIA • Arbovirus IgM
• CMV IgM • Hantavirus IgM • Measles IgM • Rubella IgM • Toxoplasma IgM
DAFTAR PUSTAKA
1. Handoyo I. Pengantar Imunoasai Dasar. Airlangga University Press, Surabaya :
2. Turgeon ML : Immunology & Serology in Laboratory Medicine. 4th ed. Mosby,
St. Louis ; 2009. p 158-61
3. Lequin RM. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA). Washington DC: American Association for Clinical Chemistry, Inc; [cited 2005 September 22]. Available from: http://intl.clinchem.org
4. Laboratory Services Section. Enzyme Immunoassay (EIA). Texas: Texas
Department of State Health Services; [updated 2004 December 1]. Available from: www.dshs.state.tx.us/lab/serology_eia.shtm
5. Henry J.B.MD : Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st
ed. WB Saunders Co, Philadelphia ; 2007. p 803-8
6. Turgeon ML : Clinical Laboratory Science, The Basics Routine Techniques. 5th
