BAB 3 BAHAN DAN METODE PENELITIAN

(1)

BAB 3

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1. Alat-alat

1. Neraca Analitik Mettler PM 480

2. Rotary Evaporator Buchi

3. Corong

4. Gelas Beaker Pyrex

5. Gelas Ukur Pyrex

6. Kolom Kromatografi Pyrex

7. Plat Skrining

8. Labu Erlenmeyer Pyrex

9. Oven

10. Melting Point Apparatus Fisher Johns

11. Bosch Monoscope 12. Lampu UV

13. Tabung Reaksi 14. Rak Tabung Reaksi

15. Plat Kromatografi Lapis Tipis 16. Magnetik Stirer

17. Hot Plate Nuova

18. Chamber

19. Indikator Universal 20. Alat soklet

21. Labu Alas Pyrex

22. Blender Maspion

23. Stoples

(2)

25. Spektrofotometer IR Jasco FT-IR 5300

26. Spektrometer 1H-NMR Hitachi FT-NMR-1900

3.2. Bahan – bahan

1. Batang Brotowali

2. Etanol (P.a. E.Merck)

3. HCl 2 N

4. NH4

5. Kloroform (P.a. E.Merck)

OH Pekat 6. Aquadest 7. MgSO4 8. Pereaksi Meyer Anhidrat 9. Pereaksi Wagner 10. Pereaksi bouchardat 11. Pereaksi Dragendorf

12. Silika Gel 60 G ( E.Merck. Art. 7734)

13. Silika Gel 60 GF254 ( E.Merck. Art. 10180)

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1. Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah batang tumbuhan Brotowali (Tinospora crispa (L.)MIERS) yang diperoleh dari pajak sore Padang Bulan Medan yang kemudian dibuat dalam bentuk serbuk halus sebanyak 1000 g

3.3.2. Uji Skrining Fitokimia

Dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif terhadap sampel tumbuhan Brotowali (Tinospora crispa (L.)MIERS) untuk membuktikan adanya kandungan alkaloid dalam

(3)

sampel dengan uji skrining fitokimia, yaitu serbuk batang tumbuhan Brotowali ditimbang sebanyak 5 g, dimaserasi dengan 20 ml etanol, selama 2 jam, disaring dan filtrat yang diperoleh dibagi menjadi 4 bagian, yaitu :

Filtrat I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer ternyata terbentuk endapan warna

putih, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.

Filtrat II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf ternyata terbentuk endapan

warna jingga, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.

Filtrat III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Wagner ternyata terbentuk endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.

Filtrat IV : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat ternyata terbentuk endapan

warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida

3.3.3.Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Ekstrak Batang Tumbuhan Brotowali (Tinospora crispa(miers))

Serbuk batang brotowali ditimbang sebanyak 1000 g dimaserasi dengan pelarut etanol 2 L, pekerjaan dilakukan 4 kali, lalu dipisahkan ampas dengan ekstrak. Ekstrak hasil sokletasi ini kemudian dipekatkan pada rotary evaporator pada suhu 65 0C sehingga diperoleh ekstrak pekat. Ekstrak pekat ini kemudian dipartisi dengan etil asetat : air yang kemudian diambil fraksi air, fraksi air kemudian diasamkan dengan HCL 2 N sampai pH 2, kemudian diaduk selama 3 jam dengan pengaduk magnet, lalu disaring. Larutan hasil

pemisahan ini kemudian dibasakan dengan NH4OH pekat sampai pH 10, kemudian

diekstraksi dengan kloroform : air (1:1) sebanyak 4 kali. Diambil lapisan bawah yang berupa ekstrak kloroform lalu dicuci dengan aguadest sampai netral, kemudian

dikeringkan dengan 15 g MgSO4 anhidrat, diamkan 1 malam lalu disaring, kemudian

diambil larutannya dan dipekatkan dengan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak kasar sebanyak 18 g.

(4)

3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai di dalam analisis kromatografi kolom. Dimana ekstrak kasar yang diperoleh dilakukan analisis secara kromatografi lapisan tipis dengan pelarut yang digunakan adalah kloroform 100% dan campuran pelarut kloroform : etanol (5 : 1 v/v, 4 : 1 v/v, 3 : 1 v/v, 2 : 1 v/v, 1 : 1 v/v). Sehingga akan diperoleh perbandingan pelarut kloroform : metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.

Prosedur :

Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kloroform 100 %. Ekstrak encer dietil eter ditotolkan pada palat KLT yang diaktifkan. Plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi developer – developer yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup rapat dan dielusi. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan. Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet. Kemudian harga Rf nya dihitung.

Perlakuan yang sama dilakukan untuk campuran pelarut antara kloroform : etanol (5 : 1 v/v, 4 : 1 v/v, 3 : 1 v/v, 2 : 1 v/v, 1 : 1 v/v). Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa batang tumbuhan Brotowali mengandung senyawa alkaloida. Dari hasil pemisahan yang lebih baik diberikan pada fase gerak kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v). Harga Rf nya dapat dilihat pada kromatogram ( tabel 1 )

3.3.5. Isolasi Senyawa alkaloida dengan Kromatografi Kolom

Terhadap 18 g ekstrak kasar dilakukan isolasi senyawa alkaloida dengan kromatografi kolom. Fasa diamnya adalah silika gel 60 G (E.Merck Art. 7734) dan fasa geraknya adalah kloroform : etanol (4 : 1 v/v).

Prosedur :

Peralatan untuk kolomkromatografi dirangkai, terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G ( E.Merck. Art. 7734 ) sebanyak 55 g dengan menggunakan kloroform 100 %, diaduk sampai homogen dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi lalu dielusi dengan

(5)

kloroform 100 % hingga bubur silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 18 g ekstrak kasar batang tumbuhan brotowali ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel. Sampel dibiarkan turun dan terserap dengan baik pada silika gel dipuncak kolom, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v) secara perlahan –lahan dan diatur sehingga liran fraksi yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam beberapa botol vial, lalu diuapkan diudara terbuka sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal alkaloida.

3.3.6. Pemurnian Kristal Hasil Isolasi

Dari analisis taip – tiap fraksi dengan kromatografi lapisan tipis, diperoleh noda – noda dengan harga Rf yang hampir sama, ykni pada fraksi 15 – 30. lalu fraksi tesebut digabungkan dan diuapkan, diperoleh larutan pekat berwarna Kuning kehijauan. Kemudian dicuci dengan pelarut etanol secara berulang – ulang sebanyak 3 kali, kemudian dikeringkan hingga terbentuk kristal berwarna kuning berbentuk jarum sebanyak 1,38 g

3.3.7. Analisis Kristal Hasil Isolasi

3.3.7.1. Analisis Pada Kromatografi Lapis Tipis

1. Kristal yang diperoleh dari hasil rekristalisasi ditimbang sebanyak 15 mg lalu dilarutkan dalam 10 ml etanol, lalu ditotolkan pada plat KLT

2. Larutan fasa gerak yaitu kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v ) dimasukkan kedalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan bantuan kertas saring. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkkan kedalam bejana kromatografi dan dielusi.

3. Plat dikeluarkan dari bejana kromatografi selanjutnya dikeringkan dan diamati dibawah sinar lampu UV yang memberikan warna biru, yang menunjukkan adanya alkaloid ( harga Rf dapat dilihat pada tabel 2 )

(6)

3.3.7.2. Uji Reaksi Warna Terhadap Kristal Hasil Isolasi Dengan Pereaksi Alkaloida

Larutan kristal dari prosedur 3.3.7.1 dibagi dalam empat tabung reaksi :

1. Tabung I ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Mayer memberikan endapan berwarna putih

2. Tabung II ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Wagner memberikan endapan berwarna coklat.

3. Tabung III ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Bouchardat memberikan endapan berwarna coklat.

4. Tabung IV ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Drangendorff memberikan endapan berwarna jingga.

3.3.7.3. Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni diletakkan diatas plat melting point apparatus, dihidupkan alat dan diatur temperaturnya. Lalu diamati temperatur sampai kristal melebur. Titik lebur kristal yang diperoleh 175 - 177 0C.

3.3.74. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi

Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT – IR dan spektrometer

1

H – NMR diperoleh dari Laboratorium Dasar Bersama FMIPA UNAIR Surabaya dengan menggunakan pelarut CDCl3 larutan standar TMS

(7)

BAGAN PENELITIAN Sampel kering, bubuk 1000 gr

← Diekstraksi secara maserasi dengan pelarut etanol (2 L) ← Disaring

← Diulangi pekerjaan sebanyak 4 kali

Ekstrak etanol Ampas

← Skrining Fitokimia

← Pekatkan dengan rotary evaporator

Ekstrak pekat etanol

Fraksi etil asetat

← Diskrining fitokimia ← Dipekatkan dipenangas air

← Diasamkan dengan HCl 2 M sampai pH 2,diaduk dengan magnetic stirer selama 3 jam, disaring

Larutan asam Lapisan Atas

← Dibasakan dengan NH4OH pekat sampai pH 10,aduk dengan magnetic stirer selama 3 jam,diamkan selama 3 jam

← Disaring

Endapan

← Dikeringkan dalam oven ← Dilarutkan dengan etanol

← Diekstraksi partisi dengan CHCl3 : air ( 1:1 v/v) 300 ml ulangi sebanyak 4 kali

← Diekstraksi secara partisi dengan pelarut etil asetat : air (1:1 v/v )sebanyak 3 kali

Fraksi air Dianalisis dengan KLT Diukur titik lebur Dianalisis dengan Spektrofotometer FT - IR Dianalisis dengan Spektrometer 1 H - NMR Ekstrak CHCl3

← Dicuci dengan aguadest sampai netral, keringkan dengan MgSO4 anhidreat 15 g,diamkan 1 malam dan disaring

Ekstrak CHCl3

Filtrat larutan basa

← Dipekatkan dengan rotarievaporator

Ekstrak CHCl3 pekat

← Diskrining Fitokimia

← Dianalisis KLT dengan pelarut kloroform 100% , Kloroform : etanol (5:1), (4:1),(3:1),(2:1),(1:1) v/v

← Dipisahkan dengan kolom kromatografi dengan fasa diam silica gel 60 G dan fasa gerak kloroform : etanol (4:1) V/V ← Ditampung tiap fraksi sebanyak 5 ml

← Dianalisis KLT dan digabung fraksi dengan Rf yang sama

Fraksi 15 -30

← Diuapkan pelarutnya

Residu warna kuning kehijauan

← Direkristalisaasi dengan pelarut etanol

(8)

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Hasil isolasi senyawa alkaloida dari ekstrak batang brotowali dengan cara maserasi dengan pelarut etanol. Setelah ekstrak etanol dipekatkan, kemudian diasamkan dan diaduk, kemudian disaring dan kemudian dibasakan sampai pH 10. Aduk selama 3 jam, diamkan, disaring dan diekstraksi secara partisi dengan kloroform : air, lalu dipisahkan. Ekstrak kloroform dipekatkan dan dianalisa dengan kolom kromatografi. Dari hasil analisa kromatografi dengan menggunakan silika gel 60 G sebagai adsorben dan dielusi dengan kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v ). Fraksi yang diperoleh dipekatkan dan residu yang terbentuk direkristalisasi dengan etanol berulang – ulang. Dari hasil rekristalisasi diperoleh kristal berwarna kuning, berbentuk jarum dengan titik lebur 175 – 177 0C.

Dari hasil analisa kromatografi dengan menggunakan fase gerak kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v ), menunjukkan noda tunggal berwarna biru yang daimati dibawah lampu UV, berarti kristal hasil isolasi adalah murni.

Hasil analisis dengan menggunakan spektroskopi Infra Merah (FT – IR ) pada kristal hasil isolasi menghasilkan pita – pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut :

1. Pada bilangan gelombang 3474,64 cm 2. Pada bilangan gelombang 2922,42 cm

-1

3. Pada bilangan gelombang 2851,14 cm

-1

-1 -1

(9)

8. Pada bilangan gelombang 1438,01 cm 9. Pada bilangan gelombang 1382,38 cm

-1

Spektrum infra merah komponen senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada lampiran B

-1

Hasil analisis spektroskopi resonansi magnetik inti proton ( 1H – NMR ) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut CDCl3

Pergeseran kimia (

dan TMS sebagai estándar memberikan signal – signal pergeseran kimia pada daerah sebagai berikut :

1

1. 0,881 – 1,106 menunjukkan puncak multiplet

H – NMR ) senyawa hasil isolasi (ppm) :

2. 1,262 – 1,396 menunjukkan puncak singlet 3. 1,809 – 1,960 menunjukkan puncak singlet 4. 2,043 – 2,248 menunjukkan puncak singlet 5. 3,551 – 3,817 menunjukkan puncak doblet 6. 5,484 – 5,565 menunjukkan puncak doblet 7. 7,296 menunjukkan puncak singlet

Spektrum magnetik inti proton komponenen senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada lampiran C

4.2. Pembahasan

Tumbuhan Brotowali(Tinospora crispa (L.)MIERS.)adalah merupakan salah satu dari famili menispermaceae yang merupakan tumbuhan merambat dengan panjang mencapai 2,5m atau lebih. Masyarakat sudah biasa menggunakan tanaman ini untuk pengobatan berbagai penyakit antara lain: rematik, demam, sakit kuning, kencing manis, dan penyakit kolera, dengan merebus batangnya dan air rebusan diminum yang berasa pahit.

(10)

Banyaknya manfaat tumbuhan ini mungkin berkaitan dengan banyaknya jenis senyawa kimia yang dikandungnya, antara lain, alkaloida, damar lunak, pati, glikosida, zat pahit, pikroretin, harsa, barberin, palmatin, kolumbin, dan jatrorhize. Zat pahit pikroretin merangsang kerja urat saraf sehingga alat pernafasan dapat bekerja dengan baik. Kandungan alkaloid berberin berguna untuk membunuh bakteri pada luka. Selain itu brotowali juga bermanfaat untuk menambah nafsu makan dan menurunkan kadar gula.

Isolasi senyawa alkaloida yang terkandung pada batang brotowali yang dilakukan secara ekstraksi sokletaasi dengan menggunakan pelarut etanol. Diharapkan senyawa – senyawa alkaloida yang terkandung didalamnya dapat terekstraksi seluruhnya .

Isolasi pemisahan dan pemurnian kristal untuk senyawa alkaloida sudah banyak dilakukan terhadap ekstrak tumbuh – tumbuhan. Beberapa metode yang umum dilakukan antara lain metode J.B.Harborne, Rifael dan Bouillard.I.

Dari hasil penelitian yang kami lakukan terhadap isolasi senyawa alkaloida dari batang brotowali dengan menggunakan metode Bouilllard.I. yang terlebih dahulu dimodifikasi yaitu dalam pemilihan absorben silika gel 60 G dan dielusi dengan kloroform : etanol ( 4: 1 v/v ). Kemudian dipekatkan dan residu yang diperoleh direkristalisasi dengan etanol, sehingga diperoleh kristal berbentuk jarum yang mempunyai titik lebur 175 – 177 0C.

Bila kita perhatikan spektrum kristal yang diisolasi dari batang brotowali dimana elusidasi struktur dengan data spektrofotometer (FT – IR) pada daerah bilangan gelombang tertentu yang spesifik serta data spektrometer magnet inti proton ( 1H-NMR )

dengan menggunakan pelarut CDCl3

1. Pergeseran kimia pada daerah 0.881 – 1,106 ppm terdapat puncak multiplet yang menunjukkan adanya proton CH atau gugus –C-CH

dan standar TMS bahwa pergeseran kimia dari kristal yang spesifik adalah sebagai berikut :

3 yang mempunyai proton

tetangga sehingga memberikan spektrum multiplet, ini didukung oleh data

(11)

menunjukkan karakteristik dari molekul CH3 yang merupakan vibrasi bending

dan didukung juga dengan dat vibrasi pada bilangan 1438,01 cm-1 dan 1382,38 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur asimetrik dari gugus CH3

2. Pergeseran kimia pada daerah 1,262 – 1,369 ppm terdapat puncak singlet yang menunjukkan adanya proton CH

.

3 yaitu yang terikat pada gugus –NH-CH3, ini

didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 3500 – 3100 cm-1 dari NH stretching dan juga muncul pada bilangan gelombang 1651,02 – 1438,01 cm-1

3. Pergeseran kimia pada daerah 1,809 – 1,960 ppm terdapat puncak singlet yang menunjukkan adanya proton CH

yang merupakan karakteristik dari molekul NH (grup amin ).

2 (metilen) yang diduga tidak mempunyai atom

tetangga dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 2851,14 cm-1 dan 875,10 cm-1

4. Pergeseran kimia pada daerah 2,043 – 2,248 ppm terdapat puncak singlet dari gugus –OH (hidroksil) dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 1227,77 cm

vibrasi stretching.

-1

5. Pergeseran kimia pada daerah 3,551 3,817 ppm terdapat puncakdoblet dari gugus –CH

yang merupakan vibrasi ulur dari gugus –OH (hidroksil) dengan serapan kuat dan tajam.

2-O atau gugus –CH2NO2 dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT –

IR pada bilangan gelombang 1503,79 cm-1 dan 1461,02 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur dan data ini diperkuat dengan kehadiran vibrasi stretching pada 730,41 – 655,99 cm-1

6. Pergeseran kimia pada daerah 5,484 – 5,565ppm terdapat puncak doblet dari

gugus CH (

=

<

H ) yang menjauhi TMS dan ini dipengaruhi oleh proton atom

tetangga yang bersifat elektronegatif tinggi dan ini didukung oleh data

spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 1026,84 cm-1

7. Pergeseran kimia pada daerah 7,296 ppm terdapat puncak singlet dari gugus CH aromatis yang menjauhi TMS serta proton – protonnya yang menunjukkan protonyang equivalen terhadap tetangga yang mengkibatkan terbentuk puncak singlet yang kuat dan bersifat elektromagnet tinggi dan ini didukung oleh data yang merupakan vibrasi ulur dari gugus metin ( –C-H )

(12)

spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 3030cm-1 dan cincin aromatik tersubstitusi oleh gugus lain yang mengakibatkan munculnya puncak pada bilangan gelombang 901,19 – 730,14 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur dari gugus CH aromatis.

Dari hasil pembahasan diatas, jelaslah bahwa kristal yang diisolasi dari batang tumbuhan brotowali adalah senyawa alkaloida, ini ditunjukkan oleh kehadiran atom N pada senyawa tersebut.

(13)

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1.Kesimpulan

1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 1000 g batang tumbuhan Brotowali ( Tinospora crispa (L.)MIERS) merupakan kristal kuning berbentuk jarum sebanyak 1,38 g. 2. Dari data spektrum FT-IR dan resonansi magnetik inti proton (1

3. Titik lebur kristal yang diperoleh adalah 175 - 177

H-NMR), diduga bahwa batang tumbuhan Brotowali ( Tinospora crispa (L.)MIERS ) mengandung senyawa alkaloida, ini ditunjukkan dengan kehadiran atom N pada senyawa hasil isolasi.

0

C

5.2.Saran

1. Perlu dilakukan penelitian terhadap batang tumbuhan Brotowali ( Tinospora crispa (L.)MIERS ) dengan menggunakan pelarut lain.

2. Perlu dilakukan analisis dengan Spektroskopi yang lain seperti Spektroskopi NMR 2 dimensi (COSY-NMR), MS, dan analisis elementer agar diperoleh data-data yang lebih mendukung untuk mendukung kebenaran struktur senyawa alkaloida hasil isolasi.