PROFIL HEMATOLOGI DAN PERTUMBUHAN IKAN MAS (Cyprinus carpio
Linn.) PADA PEMBERIAN ASAM HUMAT TANAH GAMBUT KALIMANTAN
HEMATOLOGY PROFILE AND GROWTH RESPONS OF CARP (Cyprinus carpio Linn.) ON ADMINISTRATION OF HUMIC ACID FROM KALIMANTAN PEAT SOILDiah Wulandari Rousdy1
*,
Nastiti Wijayanti21*Fakultas MIPA Universitas Tanjungpura, Pontianak Alamat pos: Jl. A. Yani Pontianak Telp/Faks: (0561) 577963
2Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta [email protected]
ABSTRACT
Peat is an organic soil type that has many potencies of humic substance. Humic acid substance in the peat are known to have many kind of biological activities such as animal growth stimulation. The study was designed to determine the effect of humic acid from Kalimantan peat soil on the growth response and hematology profile of carp (Cyprinus carpio Linn.). AResearch using Completely Randomized Design with four treatments and six replications. The treatment consists of normal control and treatment group of humic acid (1%, 3% and 5% v/v of the weight of the feed). Humic acid administrated orally through the feed for 21 days. The results showed that 1% humic acid administration gives the best weight gain (9,01%) of carp. Hematology results showed the highest number of erythrocytes is given by 1% humic acid treatment (1,37x106 cells / mm3) nor the highest
hematocrit value is given to the treatment of humic acid 1% (44.55%). Total leukocyte showed the highest value in the treatment of humic acid 3% (60,83x103 cells / mm3). However, 3% humic acid treatment also causes a decrease in hemoglobin levels. The results of this study indicate the potential use of humic acid in stimulating the growth of carp that can be used in the development of fish feed formulations.
Keywords: peat, humic acid, hematology, growth, carp
ABSTRAK
Gambut merupakan jenis tanah organik yang memiliki banyak potensi kandungan senyawa humat untuk dikembangkan.Asam humat yang terkandung dalam gambut diketahui mempunyai berbagai potensi biologis salah satunya sebagai stimulasi pertumbuhan hewan.Penelitian ini dirancang untuk mengetahui pengaruh pemberian asam humat dari tanah gambut Kalimantan terhadap respon pertumbuhan ikan mas (Cyprinus carpio Linn.) ditinjau dari parameter hematologi.Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan empat perlakuan dan enam ulangan.Perlakuan terdiri dari kontrol normal dan perlakuan asam humat (1%, 3% dan 5% dari berat pakan).Pemberian asam humat dilakukan secara oral melalui pakan selama 21 hari. Hasil penelitian menunjukkan pemberian asam humat memberikan kenaikan berat badan ikan mas terbaik pada perlakuan asam humat 1% yakni sebesar 9,01%. Hasil uji hematologi menunjukkan jumlah eritrosit tertinggi diberikan oleh perlakuan asam humat 1% yakni 1,37x106 sel/mm3 begitupula nilai hematokrit tertinggi diberikan pada perlakuan asam
humat 1% yakni sebesar 44,55%. Jumlah leukosit ikan mas menunjukkan nilai tertinggi pada perlakuan asam humat 3% yakni sebesar 60,83x103 sel/mm3. Namun perlakuan
mengindikasikan potensi penggunaan asam humat dalam menstimulus pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas sehingga dapat digunakan dalam pengembangan formulasi pakan ikan.
Kata kunci: gambut, asam humat, hematologi, pertumbuhan, ikan mas
1. PENDAHULUAN
Ikan mas (Cyprinus carpio Linn.) merupakan jenis ikan air tawar yang banyak dikonsumsi masyarakatsehingga diperlukan upaya untuk meningkatkan nilai produksinya.Salah satu upaya untuk meningkatkan pertumbuhan ikan mas adalah dengan menggunakan bahan alam yang berpotensi menstimulus pertumbuhanyaitu senyawa humat yang terkandung dalam tanah gambut. Indonesia sebagai negara dengan luas lahan gambut terluas ke-4 di dunia mempunyai potensi pemanfaatan gambut yang cukup besar.Distribusi lahan gambut di Indonesia sebagian besar berada di Kalimantan, Sumatera dan Papua. Pulau Kalimantan mempunyai luas lahan gambut sekitar 5,8 juta hektar [1].Senyawa asam humat dalam tanah gambut mempunyai struktur yang sangat kompleks dan berbeda untuk tiap jenis tanah[2].Perbedaan dalam karakteristik asam humat ini kemudian mengindikasikan perbedaan fungsi dari asam humat.
Senyawa humat merupakan hasil pemecahan materi organic tanaman oleh bakteri.Berbagai manfaat biologis senyawa humat dari gambut subtropis antara lain sebagai antitumor, antivirus danimunostimulant [3], [4], [5]. Senyawa humat telah digunakan luas dalam industri peternakan untuk menstimulus pertambahan berat badan ternak [6] dan kualitas produksi telur ayam [7].Suplementasi humat 10% dalam pakan babi secara nyata menunjukkan penambahan berat badan secara signifikan [8].
Penelitian mengenai pemberian senyawa humat dari gambut tropis Kalimantan terhadap respon pertumbuhan dan profil hematologi ikan mas (Cyprinus carpio Linn.) belum pernah dilaporkan.Mengingatbesarnya manfaat senyawa humat maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh suplementasi asam humat dari tanah gambut Kalimantan dalam pakan terhadap pertumbuhan dan profil hematologi ikan mas (Cyprinus
carpio Linn.).
2. BAHAN DAN METODE 2.1 Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain metanol, Giemsa 5%, larutan 6 M HCl, larutan 0,1 M NaOH, reagen Natt-Herrick, NaEDTA, minyak cengkeh, pellet ikan, akuades, kit titrasi DO dan amonia. Bahan uji yang digunakan adalah asam humat yang diekstraksi dari tanah gambut Kalimantan.Lokasi pengambilan sampel gambut yakni di
Hewan uji adalah ikan mas (Cyprinus carpio Linn.) berumur 2 bulan dengan panjang 10-15 cm.Ikan diaklimasi selama dua minggu dan diberi pakan pellet sebanyak 2% dari berat badan per hari. Volume air diganti 25% setiap hari untuk membersihkan sisa makanan dan feses. Paramater fisika dan kimia air diukur setiap minggu dan dipantau dalam kondisi optimum (DO:5,65±0,72mg/l; pH:7,41±0,82; ammonia:0,109±0,024 mg/l dan suhu 27-32 oC) [9].
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spuit steril 1cc, pipet pengencer darah, hemositometer, hemometer Hb, tabung mikrohematokrit, mikrotube, kaca benda, kaca penutup, peralatan gelas, mikropipet, mikrosentrifuge, timbangan analitik, mikroskop, wadah pemeliharaan ikan, aerator, kertas pH dan termometer.
2.2 Metodologi
Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat perlakuan dan enam ulangan.Tiap ulangan terdiri dari sembilan individu.Perlakuan terdiri dari kontrol normal danperlakuan asam humat (1%, 3% dan 5%dari berat pakan).Pengukuran berat badan ikan dilakukan hari ke-0 dan 21 selama pemberian asam humat. Parameter hematologi darah dilakukan pada hari ke-7, 14 dan 21. (Referencce?)
2.3 Ekstraksi Asam Humat
Metode ekstraksi asam humat mengacu pada metode IHSS [10]. yakni berdasarkan pengendapan dalam asam kuat dan kelarutan dalam basa lemah. Sampel yang telah bersih dari kerikil dan akar tumbuhan, ditimbang seberat 50 gram dan diekstrak dengan 0,1 M NaOH 500 mL selama 4 jam sambil dikocok menggunakan shaker. Campuran dibiarkan selama satu malam (+ 15 jam). Filtrat diambil dan disaring beberapa kali dengan kapas. Fraksi humin yang tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit.
Supernatan diendapkan dengan larutan asam kuat 6 M HCl hingga pH 1,5-2 sebanyak 1/3 volume supernatan. Campuran dikocok menggunakan shaker dandidiamkan selama + 15 jam. Filtrat disentrifugasi kembali (3500 rpm selama 20 menit) untuk memisahkan fraksi asam humat (endapan) dan asam fulvat (supernatan). Sentrifugasi diulangi beberapa kali sampai pemisahan sempurna sehingga diperoleh endapan asam humat. Ekstrak asam humat kemudian dibuat dalam konsentrasi larutan yang telah ditentukan. Larutan dicampur dengan pellet komersial dikeringkan dalam inkubator 50oC. Jumlah pellet yang diberikan setiap hari adalah 2% dari berat badan ikan.
2.4 Pengambilan Darah dan Penentuan Profil Hematologi
Ikan dibius dengan cara merendam ikan dalam larutan yang berisi minyak cengkeh 0,125 mL per L air. Sampel darah ikan diambil sebanyak ± 0,3 mL melalui arteri caudalis yang terletak di bawah vertebra dalam arcus hemalis,dengan cara jarum yang telah diisi NaEDTA 2% ditusukkan cukup dalam melalui garis medial tepat di belakang sirip analis ke arah dorsokranial [11]. Darah yang diambil digunakan untuk penentuan profil hematologi.
Kadar Hb ditentukan dengan metode Sahli, yaitu darah direaksikan dengan HCl 0,1N sehingga terbentuk senyawa hematin yang berwarna coklat tua [12].Hematokrit diukur berdasarkan persentase pengendapan sel terhadap total volume darah [12]. Jumlah eritrosit dan leukosit dihitung dengan hemositometer menggunakan larutan pengencer Natt-Herrick) [13].Sel darah putih diferensial dihitung menggunakan praparat apus darah dengan pewarna Giemsa [14].
2.4 Analisis Data
Data dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) dan uji lanjut Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) menggunakan SPSS versi 15. Data ditampilkan dalam bentuk rerata ± standar galat.
3. HASIL
3.1Rerata Peningkatan Berat Badan Ikan
Pemberian asam humat dalam bentuk suplementasi pakan memberikan pengaruh peningkatan berat badan (BB) ikan.Perlakuan asam humat 1% memberikan peningkatan
BB tertinggi (9,01%) dibandingkan kontrol normal,asam humat 3% dan 5% (Tabel
1).
3.2 Profil Hematologi Ikan Mas Selama Pemberian Asam Humat
Profil hematologi ikan dapat digunakan sebagai acuan kondisi kesehatandan fungsi fisiologis tubuh. Hasil uji hematologi secara umum menunjukkan jumlah sel eritrosit ikan selama pemberian asam humat tidak berbeda nyata (p>0,05) dengan kontrol meskipun memperlihatkan kecenderungan peningkatan pada perlakuan asam humat 1% dan 3% (Tabel 1).
Hasil penelitian ini juga menunjukkan perlakuan asam humat terjadi kenaikan nilai hematokrit secara signifikan (p<0,05) pada hari ke-21. Persentase hematokrit tertinggi diberikan oleh perlakuan asam humat 1% sebesar 44,55% sedangkan hematokrit untuk kelompok kontrol normal adalah 34,67% (Tabel 2).
Tabel 1. Jumlah eritrosit ikan mas selama pemberian asam humat
Perlakuan Eritrosit (10
6 sel/mL))
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 1,30 ± 0,04b 1,17 ± 0,07 a 1,22 ± 0,24 a
Asam humat 1% 1,27 ± 0,09 ab 1,27 ± 0,09 a 1,37 ± 0,08 a
Asam humat 3% 1,26 ± 0,05 ab 1,18 ± 0,19 a 1,29 ± 0,10 a
Asam humat 5% 1,24 ± 0,02 ab 1,28 ± 0,07 a 1,13 ± 0,16 a
Data ditampilkan dalam nilai rerata ± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
Tabel 2. Nilai hematokrit ikan mas selama pemberian asam humat
Perlakuan Hematokrit (%)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 30,98 ± 2,16 a 31,22 ± 0,75 a 34,67 ± 4,70 a
Asam humat 1% 38,77 ± 2,56 a 33,72 ± 2,95 a 44,55 ± 1,22b
Asam humat 3% 30,47 ± 4,74 a 37,02 ± 1,72 a 37,25 ± 2,66 ab
Asam humat 5% 31,50 ± 1,70 a 33,88 ± 2,36 a 34,73 ± 2,57 a
Data ditampilkan dalam nilai rerata ± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05).
Berbeda dengan parameter hematologi lain, kadar Hb darah ikan cenderung menunjukkan penurunan signifikan (p<0,05) pada hari ke-21 terutama untuk perlakuan asam humat 3% dan 5%. Kadar Hb tertinggi diberikan oleh perlakuan asam humat 1% (7,80 g/dL) lebih baik dibandingkan kontrol normal (7,63 g/dL).
Tabel 3. Kadar hemoglobin ikan mas selama pemberian asam humat
Perlakuan Hemoglobin (g/dL)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 8,33 ± 0,37a 7,63 ± 0,20 a 7,63 ± 0,18bc
Asam humat 1% 7,90 ± 0,10 a 7,67 ± 0,49 a 7,80 ± 0,11c
Asam humat 3% 7,53 ± 0,14 a 7,33 ± 0,08 a 7,07 ± 0,20 a
Asam humat 5% 7,47 ± 0,62 a 7,70 ± 0,58 a 7,30 ± 0,25 ab
Data ditampilkan dalam nilai rerata ± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
Jumlah leukosit ikan mas selama pemberian asam humat menunjukkan peningkatan signifikan (p<0,05) pada hari ke-21 sehingga berpotensi menstimulus sistem imunitas. Asam humat 3% memberikan jumlah leukosit tertinggi pada hari ke-21 sebesar 60,83 x103 sel/mL lebih baik dibandingkan kontrol normal 50,58 x103 sel/mL (Tabel 4).
Tabel 4. Jumlah leukosit ikan mas selama pemberian asam humat
Perlakuan Leukosit (10
3 sel/mL)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 49,75 ± 2,75a 45,17 ± 5,64 a 49,33 ± 1,17 a
Asam humat 1% 58,17 ± 3,77b 53,00 ± 1,09 a 55,58 ± 2,76 ab
Asam humat 3% 48,00 ± 4,02a 47,50 ± 8,75 a 60,83 ± 4,73 b
Asam humat 5% 48,08 ± 4,19a 55,17 ± 2,30 a 50,58 ± 3,31 a
Data ditampilkan dalam nilai rerata± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
Hasil perhitungan jenis leukosit diferensial pada darah ikan menunjukkan persentase granulosit, monosit dan limfosit tidak berbeda signifikan (p>0,05). Perlakuan asam humat 1% memberikan rerata persentase granulosit tertinggi (16,83%) dan rerata monosit tertinggi (13,5%) dibandingkan kelompok perlakuan asam humat lainnya (Tabel 5, Tabel 6). Rerata limfosit tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan asam humat 5% sebesar (79,00%) dan kontrol normal (80,00%) (Tabel 7).
Tabel 5. Persentase granulosit selama pemberian asam humat
Perlakuan Granulosit (%)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 10,33 ± 2,04a 10,33 ± 1,30 a 10,50 ± 2,02 a
Asam humat 1% 8,33 ± 2,17a 10,00 ± 2,08 a 16,83 ± 8,25 a
Asam humat 3% 11,17 ± 0,60a 13,83 ± 7,38 a 8,33 ± 1,69 a
Asam humat 5% 8,83 ± 1,64a 11,83 ± 3,17 a 9,33 ± 3,49 a
Data ditampilkan dalam nilai rerata ± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
Tabel 6. Persentase monosit selama pemberian asam humat
Perlakuan Monosit (%)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 11,50 ± 5,41a 8,33 ± 1,17 a 8,67 ± 1,58 a
Asam humat 1% 11,33 ± 2,62a 9,67 ± 0,88 a 13,50 ± 3,04 a
Asam humat 3% 25,67 ± 3,77b 15,83 ± 1,30 b 14,00 ± 2,64a
Asam humat 5% 13,33 ± 2,90a 13,83 ± 2,92ab 11,67 ± 2,89 a
Data ditampilkan dalam nilai rerata± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
Tabel 7. Persentase limfosit selama pemberian asam humat
Perlakuan Limfosit (%)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol normal 78,17 ± 6,83b 81,33 ± 2,40 a 80,83 ± 2,68 a
Asam humat 1% 80,33 ± 1,59b 80,33 ± 1,20 a 69,67 ± 9,77 a
Asam humat 3% 63,17 ± 4,19a 70,33 ± 7,72 a 77,67 ± 3,44 a
Asam humat 5% 77,83 ± 1,30b 74,33 ± 0,88 a 79,00 ± 3,21 a
Data ditampilkan dalam nilai rerata ± standar galat. Huruf yang berbeda pada setiap nilai di kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
4. PEMBAHASAN
Pertambahan berat badan ikan pada pemberian asam humat mengindikasikan senyawa ini dapat meningkatkan status kesehatan ikan dengan cara mengoptimalkan pertumbuhan dan sistem pencernaan. Penggunaan asam humat telah dikenal dapat meningkatkan pertumbuhan hewan ternak. Suplementasi humat ke dalam pakan ayam diketahui mampu meningkatkan produksi telur dan asupan pakan ayam [7] dan suplementasi humat dalam pakan ternak babi mampu meningkatkan berat badan ternak secara signifikan [8].
Mekanisme pengaruh humat terhadapt pertumbuhan belum diketahui namun diduga melalui efisiensi penyerapan nutrien. Stevenson [2] dan von Wandruszka [15] menyatakan bahwa struktur asam humat yang berupa makro-koloid dapat membentuk lapisan seperti membran, dengan sisi hidrofilik berorientasi ke luar dan sisi hidrofobik berorientasi ke dalam. Struktur mirip membran ini memungkinkan asam humat memberikan perlindungan membran mukosa saluran pencernaan dan meningkatkan efisiensi penyerapan nutrien. Pemberian asam humat 1% dapat dikatakan optimal untuk meningkatkan berat badan dibandingkan asam humat dengan konsentrasi lebih tinggi (3% dan 5%).
Hasil uji hematologi secara umum menunjukkan adanya peningkatan tidak signifikan nilai hematokrit dan jumlah eritrosit.Salasia et al.[11] menyatakan bahwa nilai hematokrit normal ikan mas antara 30-48%, sehingga peningkatan hematokrit yang terjadi pada hari ke-21 pada semua kelompok perlakuan masih berada pada kisaran normal. Namun perlakuan asam humat juga menyebabkan penurunan kadar hemoglobin secara tidak signifikan. Penurunan kadar Hb ikan selama pemberian asam diduga selain disebabkan oleh faktor eksternal seperti kadar DO juga disebabkan oleh sifat khelator ion oleh asam humat [16]. Hal ini diduga menyebabkan asam humat tanah gambut lebih mudah mengkelat ion Fe2+ selama berada dalam aliran darah sehingga produksi pigmen respirasi Hb menurun.
Korelasi antara jumlah eritrosit, hemoglobin dan hematokrit berhubungan dengan status kesehatan, nutrisi dan pertumbuhan ikan [11].Ikan dengan pertumbuhan yang baik ditandai dengan jumlah eritrosit, hemoglobin dan hematokrit yang normal.Hemoglobin yang terkandung dalam eritrosit berperan dalam mengikat oksigen yang diperlukan bagi metabolisme seluler semua sel hidup [17].Dengan demikian, peningkatan pertumbuhan untuk perlakuan asam humat 1% erat kaitannya dengan status kesehatan ikan yang dilihat dari parameter hematologi jumlah eritrosit (1,37x106 sel/mL) dan hematokrit (44,55%) serta tidak terjadi penurunan Hb sebagaimana kelompok asam humat lainnya.
Peningkatan jumlah leukosit ikan mas yang diberikan pakan mengandung asam humat menunjukkan bahwa asam humat diduga mampu memicu proliferasi sel-sel darah putih dalam jaringan hematopoietik. Sel darah putih memiliki peranan penting dalam sistem imun yakni sebagai pertahanan seluler terhadap infeksi patogen. Efek proliferatif senyawa humat gambut dilaporkan dalam penelitian Joone et al. [18] menggunakan kultur sel limfosit manusia penderita HIV. Hasil penelitian tersebut menyatakan bahwa pemberian oxihumat (senyawa humat dari batu bara) akan meningkatkan proliferasi sel limfosit dan sekresi interleukin-2 (IL-2). Fungsi dari IL-2 berperan dalam menstimulus maturasi sel leukosit laindalam tubuh [19]. Stimulus pelepasan sitokin juga dilaporkan oleh Vetvitcka et al.[20] yang menyatakan bahwa penggunaan asam humat bersama imunostimulan glukan (rasio 1:1) dapat menstimulus secara optimal sekresi enam jenis sitokin yakni IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, dan MPC-1.
Leukosit ikan mas (Cyprinus carpio L.) dibagi menjadi tiga jenis utama yakni granulosit (neutrofil atau heterofil, eusinofil, basofil), monosit dan limfosit.Monosit dan granulosit bersifat sangat mobil dan fagositik, sedangkan limfosit tidak bersifat mobil namun berperan memproduksi antibodi[21].Proses fagositosis diawali dengan gerak kemotaksis sel-sel fagosit menuju partikel asing, ditandai dengan pembentukan juluran sitoplasma sel berupa pseudopodia..Kemotaksis sel fagosit ini dimediasi oleh sitokin. Junek et al. [22] menduga bahwa senyawa polianionik asam humat bersifat menstimulus sekresi sitokin selama proses inflamasi dan fagositosis.
Limfosit berperan dalam imunitas spesifik yakni mensekresikan antibodi ke dalam aliran darah [23].Limfosit B yang telah diaktivasi oleh asam humat akan berubah menjadi sel plasma yang memproduksi antibodi. Mekanisme peningkatan jumlah limfosit juga berkaitan dengan efek proliferatif sel darah terhadap pemberian asam humat serta kemampuan asam humat dalam meningkatkan sintesis interleukin [24].
5. PUSTAKA
[1]. Wahyunto & Suryadiputra, I.N.N. Peatland Distribution in Sumatera and
Kalimantan. Wetland International;2008.
[2]. Stevenson, F.J. Humus Chemistry, Genesis, Composition, Reaction. John Willey & Sons Inc.; 1994
[3]. Kodama, K., Denso & Nakagawa, J. Protection Against Atypical
Aeromonassalmonicida Infection in Carp (Cyprinus carpio) by Oral
Administration of Humus Extract. Journal Veterinary Medical Science . 2007; 69(4):405-408.
[4]. Kodama, H & Denso. 2007. Antitumor Effect of Humus Extract on Murine Transplantable L1210 Leukimia. Journal Veterinary Medical Science. 2007; 69(10):1069-1071
[5]. Tohid, T., Hasan, G. & Alireza, T. Efficacy of Mannanoligosaccharides and Humate on Immune Response to Avian Influenza (H9) Disease Vaccination in Broiler Chickens. Veterinary Research Community. 2010; 34:709–717.DOI 10.1007/s11259-010-9444-8
[6]. Agazzi, A., Cigalino, G., Mancini, G., Savoini, G. & Dell’Orto, V. Effects of Dietary Humates on Growth and An Aspect of Cell-mediated Immune Response in Newborn Kids. Small Ruminant Research. 2007; 72:242–
245.doi:10.1016/j.smallrumres.2006.10.020
[7]. Yoruk, M.A., Gul, I.M.,Hayirli, A., Macit, M. The Effects of Supplementation of Humate and Probiotic on Egg Production and Quality Parameters During the Late Laying Period in Hens. PoultryScience.2004; 83:84–88.
[8]. Wang, Q., Chen, Y.J., Yoo, J.S., Kim, H.J., Cho, I.H., Kim, I.H. Effects of Supplemental Humic Ssubstances on Growth Performance, Blood
Characteristics and Meat Quality in Finishing Pigs. Livestock Science.2008; 117:270–274.doi:10.1016/j.livsci.2007.12.024
[9]. Kumari, J. & Sahoo, P.K. Non-specific Immune Response of Healthy and Immunocompromised Asian Catfish (Clarias batrachus) to Several Immunostimulants. Aquaculture.2006; 255:133-141.
[10]. International Humic Substances Society. Isolation of IHSS Soil Fulvic and
Humic Acids [internet]. 2012 [cited29 Februari 2012]. Available from :
www.humicsubstances.org
[11]. Salasia, S.I.O., Sulanjari, D. & Ratnawati, A. Studi Hematologi Ikan Air Tawar.
[12]. Zainun, Z. Pengamatan Parameter Hematologis Pada Insang Ikan Mas yang Diberi Imunostimulan, Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur.2007; 6:45-49. [13]. Suarjana, P. Teknik Pemeriksaan Darah Ikan Laut Budidaya. Buletin Teknik
Litkayasa Akuakultur. 2003; 2:1-4.
[14]. Gunarso, W. Mikroteknik. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Pusat Studi Ilmu Hayati, IPB. Bogor; 1989.
[15]. Von Wandruszka, R. Humic Acids: Their Detergent Qualities and Potential Uses in Pollution Remediation. Geo. Trans. 2000; 2:1-6. DOI: 10.1039/b001869o [16]. Lasmi, L. Studi Adsorpsi Kompetitif Logam Ag(I), Cu(II) dan Cr (III) Pada Asam
Humat . Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada (Tesis); 2013 [17]. Ganong W.F. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi ke-22. Penerbit Buku
Kedokteran EGC. Jakarta; 2005
[18]. Joone, K.T., Dekker, J. & van Rensburg, C.E.J. Investigation of
Immunostimulatory Properties of Oxihumate. Naturforsch.2003; 58:263-267. Doi: 0939D5075/2003/0300D0263
[19]. Davies H. 1997. Introductary Immunobiology. Chapman and Hall. London [20]. Vetvicka, V., Baigorri, R.,Zamarreiio, A.M., Garcia-Mina, J.M. & Yvin, J. Glucan
and Humic Acid: Synergistic Effects on the Immune System. Journal of
Medicinal Food.2010; 13(4):863-869. 001: 10.1089/jrnf.2009.0178
[21]. Takashima, F. & Hibiya, T. (Eds). An Atlas of Fish Histology Normal and
Pathological Features. Kodansha Ltd. Tokyo; 1995.
[22]. Junek, R., Morrow, R., Schoenherr, J., Schubert, R., Kallmeyer, R., Phull, S. & Klocking, R. Bimodal Effect of Humic Acids on The LPS-induced TNF-α
Release from Differentiated U937 cells. Phytomedicine2009; 16:470– 476.doi:10.1016/j.phymed.2008.10.003
[23]. Iwama, G. & Nakanishi, T (Eds). The Fish Immune System, Organism,
Pathogen and Environment. Academic Press. California; 1996
[24]. Chen, C., Liu, J., Lu, F., Yang, M., Lee, Y. & Huang, T. The Effect of Humic Acid on The Adhesibility of Neutrophils. Thrombosis Research. 2003; 108: 67– 76.doi:10.1016/S0049-3848(02)00384-5
