Aji Pramono (130342615342) Zackiyatul Miskiyah (130342615 )
BAB 13
KONJUGASI PADA BAKTERI
Konjugasi adalah suatu proses transfer informasi genetik satu arah yang terjadi melalui kontak sel langsung antara suatu sel bakteri donor dan suatu sel bakteri resipien (Russel, 1992). Sel bakteri donor dipandang sebagai yang berkelamin jantan, sedangkan sel resipien dipandang sebagai yang berkelamin betina. Konjugasi merupakan satu peristiwa, selain transformasi dan transduksi, yang menyebabkan terjadinya rekombinasi pada bakteri.
Tabel 13.1 persamaan dan perbedaan rekombinasi yang terjadi melalui transformasi, transduksi, dan konjugasi pada bakteri (Gardner, dkk,. 1991)
Proses Rekombinasi Kriteria
Dibutuhkan kontak sel Sensitif terhadap Dnase
transformasi Tidak Ya
Transduksi Tidak Tidak
Konjugasi Ya Tidak
Peristiwa konjugasi ditemukan pada E. coli. Lederberg dan Tatum mempelajari dua strain E. coli yang berbeda kebutuhan nutrisinya, yaitu strain A dan B (Russel, 1992; Klug dan Cummings. 2000). Strain A bergenotip mei-bio- thr+ leu+ thi+, sedangkan strain B bergenotip met+
bio+ thr leu thi. Strain yang memiliki gen mutan membutuhkan tambahan nutrisi terkait dalam
medium pertumbuhannya agar dapat hidup, sedangkan strain yang memiliki genetik wild-type tidak membutuhkan tambahan nutrisi terkait dalam medium pertumbuhannya.
Pada Gambar 13.1 pada percobaan tersebut strain A dan B dicampur dan ditumbuhkan pada cawan yang berisi medium minimal. Sebagai kontrol ke dua strain ditumbuhkan pada medium minimal secara terpisah. Kedua strain yang dikultur secara terpisah pada medium minimal memang tidak tumbuh (tidak ada koloni), sebaliknya pada medium tempat kultur campuran A dan B, ternyata beberapa koloni dapat tumbuh. Kenyataan tersebut membuktikan bahwa koloni-koloni tersebut mampu membuat/ mensintesis sendiri nutrisi tertentu yang kurang atau bahkan tidak tersedia dalam medium minimal.
Bakteri
Mutan (Auxotrop) Wild Type (Prototroph)
Butuh tambahan nutrisi pada medium tumbuh Tidak butuh tambahan
nutrisi pada medium tumbuh
Strain A
Strain B
Asam amino metionin dan Vitamin biotin
Asam amino teronin dan Vitamin tiamin
Sel-sel bakteri yang berkemampuan menjadi donor selama proses konjugasi, memiliki karakteristik pembeda berupa adanya jalur tambahan serupa rambut di permukaan sel yang disebut sebagai F pili atau sex pili ( Gardener, dkk., 1991).
Pembentukan F pili berada dibawah kontrol beberapa gen (sekitar sembilan) yang terletak pada suatu molekul DNA sirkuler kecil yang disebut juga sebagai kromosom mini (Gardner, dkk., 1991). Kromosom mini tersebut disebut sebagai F (fertility)factor, sex faktor, ataupun plasmid F, dan berukuran panjang sekitar 94.500 pasang nukleotida. Jumlah gen yang terletak pada F faktor selengkapnya sekutar 19 gen (Klug dan Cummings, 2000), termasuk 9 gen yang bertanggung jawab terhadap pembentukan F pili. Gen-gen lain (tidak termasuk ke-9 gen tersebut) bertanggung jawab terhadap transfer informasi genetik.
Bakteri F+, F-, dan Hfr
Suatu sel donor yang mengandung faktor F yang otonom tidak terintegrasi disebut sebagai sel F+, sebaliknya sel yang tidak mengandung faktor F disebut sel F- (sel resipien). Sel F+
mempunyai kemampuan membentuk F pili maupun tabung konjugasi serta akhirnya melakukan transfer materi genetik, sedangkan F tidak memiliki kemampuan seperti sel F+, jika suatu
populasi sel F+ dicampur dengan satu populasi sel-sel F, lambat laun pada generasi-generasi
berikutnya tidak lagi dijumpai populasi sel F. Seluruh sel turunan merupakan populasi sel F+
(Gardner, dkk., 1991).
Pada 1953, W. Hayes mengisolasi strain lain yang juga memperlihatkan laju atau frekuensi rekombinasi yang serupa (sangat tinggi). Strain-strain yang memiliki laju atau frekuensi rekombinasi yang sangat tinggi ini disebut sebagai strain Hfr (High-frequency recombination), dapat dinyatakan pula bahwa sebenarnya strain Hfr merupakan suatu starin F+
khusus.
Strain-strain Hfr terbentuk melalui suatu peristiwa pindah silang tunggal yang berdampak terintegrasinya faktor F kedalam kromosom bakteri (Russel, 1992). Suatu sel Hfr memiliki faktor F yang berintegrasi dengan kromosomnya. Dalam keadaan terintegrasi dengan kromosom inang, faktor F tidak bereplikasi secara babas, tetapi bereplikasi bersama bagian kromosom inang yang lain. Oleh karena itu gen faktor F yang terintegrasi masih fungdional, maka sel Hfr juga dapat berkonjugasi dengan sel F. Pada saat proses konjugasi berlangsung, peristiwa yang serupa pada konjugasi F+><F-. Dalam hal ini faktor F yang terintegrasi terputus
pada salah satu dari kedua unting DNAnya dan berlangsung replikasi. Transfer genetik selama proses konjugasi bersangkut paut dengan replikasi yang didahului oleh terputusnya salah satu unting DNA faktor F tau disebut lingkaran berputar (rolling circelereplication). Sebagai sel F+
khusus, sel Hfr memiliki karakterisitik yang membedakannya dengan sel F+ biasa, yaitu:
(1) Terbentuk melalui pindah silang tunggal yang berdampak pada terintegrasinya faktor F ke dalam kromosom bakteri.
(2) Memiliki faktor F yang terintegrasi dengan kromosom inangnya.
(3) Faktor F bereplikasi bersama bagian kromosom inang sehingga gen faktor F masih funsional dan bisa berkonjugasi dengan sel F-.
(4) Faktor F yang terintegrasi terputus pada salah satu dari kedua unting DNAnya dan bergerak pindah ke dalam sel resipien. Barulah kemudian kromosom bakteri donor ikut ditransfer ke dalam sel resipien dan terjadi rekombinasi.
(5) Proses rekombinasi yang terjadi disebabkan oleh peristiwa pindah silang ganda antara DNA donor unting ganda yang sudah memasuki sel resipien dan DNA resipien unting ganda. (6) Kromosom rekombinan sel resipien diwariskan kepada sel-sel turunan melalui replikasi
(7) Setelah rekombinasi, sel F- tidak akan pernah berubah menjadi sel F+ ataupun sel Hfr. Ini
karena sel resipien tidak menerima faktor F secara utuh yang sebagian ditranfer saat awal konjugasi dan sisanya ada pada ujung kromosom donor.
(8) Konjugasi dengan sel resipien F- biasany terhenti sebelum seluruh materi genetik ditransfer.
Transfer genetik dimulai dengan faktor F pada suatu celah yang terbentuk oleh enzim endonuklease yang terbentuk pada tapak yang spesifik. Yang ditransfer adalah ujung 5’ dari unting DNA yang terpotong. Replikasi yang berhubungan dengan transfer materi genetik selama proses konjugasi adalah replikasi lingkaran berputar (rolling circle replication).
Faktor F1
Kadang-kadang terlepasnya faktor F dari kromosom inang berlangsung tidak sesuai dengan ukurannya pada saat terintegrasi. Faktor F yang terlepas mengakibatkan dapat mengandung sebagian kecil kromosom inang, yang letaknya berdekatan dengan faktor F disaat berlangsungnya integrasi. Fenomena semacam ini merupakan sebab terbentuknya faktor F1 (F
prime). Faktor F1 adalah faktor F yang mengandung sebagian kromosom bakteri9, atau
mengandung gen-gen bakteri (Russel, 1992)
Percobaan Konjugasi yang Terputus dari E. Wollman dan F. Jacob
Diketahui bahwa faktor F dapat berintegrasi di berbagai tapak pada kromosom sirkuler E. coli. Dalam hal ini tampak integrasi menentukan asal-usul karakter transfer suatu starin Hfr. Tambahan lagi, integrasi faktor F menentukan apakah urutan penanda kromosom yang ditransfer itu searah atau berlawanan dengan arah jaru jam dalam hubungannya dengan peta kromosom E. coli.
Pemetaan Kromosom E. coli atas Dasar Hasil Percobaan Konjugasi Terputus
Pada percobaan konjugasi terputus memperlihatkan bahwa transfer kromosom Hfr kedalam sel F berlangsung dalam polar liniear (Gardner, dkk., 1992). Dalm hal ini tiap gen penanda dalam wujud tipe rekombinan terdeteksi pada waktu yang berlainan saling menyusul setelah proses konjugasi berlangsung. Transfer sebuah kromosom lengkap dari suatu sel Hfr ke satu sel F- berlangsung dalam waktu 90-100 menit, tergantung pada macam starin yang
digunakan sebagai strain Hfr maupun F-. Interval waktu kemunculan tipe rekombinan antara
suatu gen penanda dengan yang lainnya kemudian dapat digunakan sebagai suatu ukuran jarak genetik.
Wollman mengajukan postulat bahwa wujud kromosom E. coli bersifat sirkuler (Klug dan Cummings, 2000). Dalam hubungan ini dinyatakan bahwa jika awal O berbeda-beda antar strain, maka urutan gen akan ditransfer berbeda-beda pula, tetapi yang menetukan O. Diduga bahwa pada berbagai strain Hfr faktor F berintegrasi ke dalam kromosom pada titik-titik yang berbeda, dan posisi titik itu menentukan tapak O.
- Pemetaan Kromosom E. coli atas dasar Percobaan Konjugasi yang Tidak Terputus Percobaan konjugasi yang tidak terputus dapat juga digunakan untuk melakukan pemetaan kromosom E. coli (Gardner, dkk., 1991). Contoh persilangan E. coli antara strain Hfr dan strain F-. Pada percobaan ini konjugasi dibiarkan berlangsung selama 1-2 jam tanpa
terputus. Dalam hal ini frekuensi penanda rekombinan menurun sebagai suatu fungsi jaraknya dari penanda rekombinan patokan Ithr+ leu+ str+, semakin jauh jaraknya dari penanda patokan
thr+ lue+, frekuensi tiap penanda rekombinan lain jarang berkurang. Pada kenyataannya frekuensi
tiap penanda rekombinan lain (aiz+ ton+ lac+ gal+), identik dengan gambaran frekuensi
penanda-penanda itu, yang terungkap pada percobaan konjugasi terputus.
BAB 14
REKOMBINASI PADA FAG BAKTERI
Sekitar tahun 1947 beberapa tim penelitian membuktikan bahwa rekombinasi terjadi dilingkungan fag bakteri
- Rekombinasi Intergenik dan Pemetaan Fag Bakteri
Rekombinasi genetik pada fag bakteri ditemukan selama percobaan-percobaan infeksi campuran. Percobaan ini melibatkan dua lokus ( dua strain yang berbeda), maka rekombinasi yang terjadi tergolong bersifat intergenik.
Satu contoh percobaan yang menggunakan sistem E. coli T2. Fag induk yang digunakan bergenotip h+r (rentang inang wild type, lisis cepat) dan hr+ (rentang inang lebar, lisis normal).
bergenotip h+r dan hr+. Pada rangkain percobaan itu, jumlah fag yang diintroduksi cukup untuk
menginfeksi tiap bakteri dengan jumlah sekitar lima buah. Setelah satu jam, sebagian besar atau seluruh bakteri sudah pecah dan sampel turunan fag yang berasal dari sekitar 40.000 bakteri di tiap persilangan selanjutnya dibiakkan dalam cawan petri yang telah mengandung suatu campuran E. coli strain B dan B/2. Pada percobaan itu ditemukan juga genotip rekombinan hr+,
dan hr disamping genotip-genotip induk.
Pada lingkungan eukariot, perhitungan frekuensi rekombinan dihitung atas dasar rumus (h+r+) + (hr) / plak total x 100 = frekuensi rekombinan. Nilai frekuensi rekombinan itu
merefleksikan jarak antar gen. Pertukaran genetic yang menyebabkan berlangsungnya rekombinasi intergenik yang terjadi pada fag bakteri T2 yang sebagian datanya tampak bersifat resiprok.
Dengan adanya kelompok pautan tertentu seperti yang telah dikemukakan, atas dasar percobaan-percobaan yang telah dilakukan, Hershey dan Rotman menemukan bahwa, mengacu pada frekuensi rekombinan yang kecil banyak gen yang terangkai bersama (berdekatan) sebagai satu kelompok, selalu menunjukkan jarak kelompok pautan yang sama sebesar 30%. Hershey mengajukan hipotesis yang menyatakan bahwa ada tiga kelompok pautan pada fag T2; dinyatakan pula bahwa proses penggabungan atau (kombinasi) secara bebas (independent assortment) antara kelompo-kelompok pautan itu ditandai oleh frekuensi rekombinasi sebesar 30% dan bukan sebesar 50% sebagaimana yang biasanya diharapkan pada makhluk hidup yang lebih tinggi. Atas dasar hasil percobaan-percobaan yang dilakukan Hershey dan Rotman (yang menggunakan strain-strain fag T2) memang terungkap bahwa, sekalipun ditemukan berbagai jarak pautan, tidak ada satupun yang pernah melampaui frekuensi 30%.Hasil percobaan yang memanfaatkan infeksi simultan tiga strain itu bahkan digunakan untuk pemetaan gen fag. Hershey dan Chase sudah melakukan upaya itu, dengan menggunakan tiga strain fag T2.
Kejadian rekombinasi hanya dapat terjadi karena ada pertukaran genetik antara ketiga strain. Pertukaran genetik berlangsung melalui dua cara yaitu 1) terjadi kedua rekombinasi berurutan dalam sel yang sama; rekombinasi pertama berlangsung antara kromosom dua strain, sedangkan rekombinasi kedua berlangsung antara strain rekombinan yang telah terbentuk dan strain ketiga; 2) terjadi “perkawinan serempak” antara ketiga kromosom dari ketiga strain pada waktu yang sama.
Kejadian unik yang menyebabkan berlangsungnya rekombinasi pada fag, ternyata juga berdampak terhadap nilai interferensi genetik, yang bersangkut paut dengan perhitungan frekuensi rekombinasi pada daerah kromosom fag yang berdekatan. Pindah silang pada suatu daerah kromosom akan meningkatkan kejadian pindah silang pada daerah kromosom didekatnya. Pada kondisi semacam ini nilai frekuensi rekombinasi ganda (akibat pindah silang ganda) yang diobservasi lebih tinggi dibandingkan nilai harapan.Penjelasan tentang nilai inteferensi genetik yang negatif pada fag bersangkutan paut dengan dua keunikan reproduksi kromosom fag. Salah satu penjelasan itu adalah karena lebih dari satu putaran “perkawinan” dapat terjadi antara kromosom-kromosom fag. Dalam hal ini satu kromosom yang sebelumnya telah mengalami satu kejadian rekombinasi dapat “kawin lagi” dan dapat mengalami rekombinasi kembali pada suatu daerah (interfal) kromosom yang berdekatan.
Peningkatan frekuensi rekombinasi ganda pada fag sebagaimana yang telah dikemukakan, tampaknya tidak terjadi karena ada peningkatan pertukaran genetik simultan yang riil pada dua interval kromosom berdekatan (Strickberger, 1985). Fenomena semacam itu pertama kali dicatat oleh Visconti bersama Delbruck dan disebut sebagai interferensi negatif rendah karena mempunyai efek yang relatif kecil.
Berkenaan dengan peningkatan frekuensi rekombinasi ganda pada fag sebenarnya ada fenomena lain yang disebut interferensi negatif tinggi (Strickberger, 1985). Pada fenomena ini frekuensi rekombinasi ganda dapat meningkat mencapai nilai yang 30 kali lebih tinggi daripada frekuensi harapan.
- Rekombinasi Intragenik
Rekombinasi intragenik sebagaimana yang ditemukan dilingkup makhluk hidup seluler termasuk yang eukariotik dan ternyata juga ditemukan pada fag. Rekombinasi intragenik pada fag ini dilaporkan pada fag T4 yang merupakan buah karya kesohor dari Seymour Benzer.
Benzer melakukan pengamatan dan pengkajian rinci terhadap lokus rll fag T4 (Klug dan Cummings, 2000). Benzer berhasil mengungkap keberadaan rekombinan-rekombinan genetik yang sangat jarang terjadi akibat pertukaran yang berlangsung dalam gen, Hasil akhir dari kerja Benzer adalah terungkapnya peta rinci dari lokus rll. Oleh karena informasi yang terungkap sangat rinci, kerja Benzer tersebut disebut juga sebagai analisis struktur halus dari gen. Karya inipun tidak ternilai harganya karena terungkap melalui percobaan yang dilaksanakan sebelum teknik DNA-sequencing dikembangkan.
Dalam proses kerjanya upaya pertama yang dilakukan Benzer adalah melakukan isolasi atas sejumlah besar mutan didalam lokus rll fag T4 (Klug dan Cummings, 2000). Dalam hal ini ternyata, mutan-mutan dalam lokus rll tersebut menghasilkan plak-plak berlainan (Klug dan Cummings, 2000).
Dalam hubungan ini Benzer memanfaatkan teknik pengenceran serial (Klug dan Cummings, 2000); dan dengan teknik ini Benzer mampu menentukan mutan rll yang dihasilkan pada E.coli B maupun jumlah total rekombinan wild-type yang melakukan lisis terhadap E.coli K12 ().
Benzer menemukan bahwa E.coli K12 (λ) trnyata juga mengalami lisis (Klug dan Cummings, 2000). Pada mulanya hal ini membingungkan, karena seharusnya hanya strain rII wild-type yang dapat menyebabkan E.coli K12 (λ) yang mengalami lisis. Penjelasan dari fenomena yang sangat membingungkan itu diperoleh melalui uji komplementasi, karena Benzer berpendapat bahwa selama melakukan infeksi secara bersamaan, tiap strain mutan itu memberikan sesuatu yang tidak memiliki oleh strain lainnya; dan jika hal itu terjadi maka fungsi atau kemampuan starain wild-type akan pulih.
Atar dasar contoh protocol percobaan rekombinan, secara operasional persentase rekombinan dapat ditentukan pertama kali dengan menghitung jumlah plak pad pengenceran yang tepat ditiap kasus. Jumlah rekombinan adalah sebanyak 4 x 103/ml sedanagkan jumlah
turunan adalah 8 x 109 /ml.
Setelah beberapa tahun melakukan percobaan rekombinasi genetic dalam daerah cistron A dan B lokus rII fag t4, Benzer berhasil mengungkap gambaran peta genetic kedua cistron tersebut.
Hasil karya benzer ini sangat spektakuler karena berhasil diungkap mendahului kajian molekuler gen rinci yang baru mampu dilaksanakan pada decade 1960. Pada masanya Benzer memang berhasil membuktikan (1955) bahwa suatu gen bukanlah suatu partikel yang tidak dapat dibagi; dibuktikan bahwa gen adalah unit-unit mutasi dan rekombinasi yang tersusun dalam suatu susunan spesifik, gen atau per unit itu adalah bagian dari molekul DNA yang tersusun dari nukleotida-nukleotida.
Pertanyaan dan jawaban :
1. Bagaimana percobaan yang dilakukan oleh Ledberg dan Tatum yang membuktikan rekombinasi seksual pada sel-sel E.coli?
Jawab :
Rekombinasi pada percobaan Ledberg dan Tatum pada E. coli adalah sebagai kejadian pertukaran genetik. Peristiwa tersebut terjadi pada perlakuan campuran strain A dan B yang ditumbuhkan bersama pada medium minimal dan beberapa koloni bisa tumbuh. Sehingga campuran strain A dan B sebagai auxotroph berubah menjadi prototroph atau bakteri yang tidak membutuhkan nutrisi tambahan dalammediumnya dan dapat tumbuh pada medium minimal.
2. Bagaimana menentukan nilai frekuensi rekombinan? Jawab:
Pada lingkungan eukariot, perhitungan frekuensi rekombinan dihitung atas dasar rumus (h+r+) + (hr) / plak total x 100 = frekuensi rekombinan. Nilai frekuensi rekombinan itu
merefleksikan jarak antar gen. Pertukaran genetic yang menyebabkan berlangsungnya rekombinasi intergenik yang terjadi pada fag bakteri T2 yang sebagian datanya tampak bersifat resiprok.
