487
Eksplorasi dan Identifikasi Bakteri Bacillus thuringiensis Berl. Rawa
Lebak dan Pasang Surut
Arsi1), Yulia Pujiastuti1) dan Siti Herlinda1,2)* 1
Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Faperta, Universitas Sriwijaya, Indralaya 2
Pusat Unggulan Riset PengembanganLahan Suboptimal(PUR-PLSO), Universitas Sriwijaya, Palembang
*)
Corresponding author: [email protected], [email protected] Telp. +62711580663, Fax. +62711580276
ABSTRACT
The purposes of the research were to explore, to isolate, to count colony of B. thuringiensis and to identify.Soil samples were taken from tidal areas in Tanjung Lago and Muara Telang sub-districts which were belonged to Banyuasin regency, Pemulutan sub-districts (belonged to Ogan Ilir regency) and Gandus sub-district (belonged to Palembang City). Isolation and identification of colony B. thuringiensis and bioassay against S.litura larvae were done in Laboratory of Phytopathology and laboratory of Entomology, Department of Plant Pests and Diseases, Faculty of Agriculture Sriwijaya University. This research was conducted from November 2012 until November 2013, with the condition of room temperature average of 26,8 oC and the relative humidity was 79,6%.The results of the exploration and identification of bacteria were 24 isolates of B. thuringiensis. The highest colony number was 703.7cfu/mL of BUA isolate while the lowest was 161.0 cfu/mL of SHA isolate
Key words: Bacillus thuringiensis, Spodopteraliruta, Swampy LanddanTidal Land
ABSTRAK
Penelitian yang dilakukan bertujuan untuk mengeksplorasi, mengisolasi, menghitung koloni B.thuringiensis. Pengambilan Sampel tanah dilakukan di daerah pasang surut kecamatan Tanjung Lago dan kecamatan Muara Telang (Kabupaten Banyuasin) dan daerah lebak di kecamatan Pemulutan (Kabupaten Ogan Ilir) dan kecamatan Gandus (Kota Palembang). Isolasi dan identifikasi bakteri di Laboratorium Fitopatologi dan Entomologi Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya Inderalaya. Penelitian dilakukan dari bulan November 2012 sampai November 2013, pada kondisi laboratorium dengan suhu rata-rata 26,8oC dan kelembaban nisbi ruangan dengan rata-rata 79,6%. Hasil eksplorasi dan identifikasi bakteri ditemukan 24 isolat B.
thuringiensis. Jumlah koloni bakteri tertinggi pada isolat BUA yaitu 703,7 cfu/mL
sedangkan terendah pada isolat SHA yaitu 161,0 cfu/mL.
Kata Kunci: Bacillus thuringiensis, Rawa Lebakdan Pasang Surut PENDAHULUAN
Bakteri Bacillus thuringiensis sebagai pengendalian hayati sudah banyak dilakukan seperti pada serangga dari ordo Lepidoptera, ordo Coleoptera, ordo Diptera, ordo Hymenoptera, ordo Homoptera, ordo Mallophaga. Selain itu juga bakteri ini dapat digunakan untuk mengendalikan kelas Acarina (Bravo et al., 1998). Bacillus thuringiensis merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang, aerobik dan membentuk spora (Bahagiawati 2002). Spora dari bakteri berbentuk oval. Kristal protein yang dimiliki oleh
488
Bacillus thuringiensis yang digunakan sebagai agens pengendali serangga menggandung
berbagai jenis protein kristal(Hofte & Whiteley 1989).
Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi, mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri entomopatogen yang menyerang ulat grayak (S. litura) yang terdapat di daerah PasangSurutdanLebak,
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan di lahan Pasang Surut dan Lebak Sumatera Selatan untuk pengambilan sampel tanahdan identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium Fitopatologi dan Entomologi Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya Inderalaya. Penelitian dilakukan dari bulan November 2012 sampai November 2013, dengan rata-rata suhu ruang26,8oC dan kelembaban nisbi ruangan rata-rata dan 79,6 %.
Penelitian ini dilakukan dengan cara mengambil sampel tanah dari lahan tanah pasang surut dan lebak kemudian dibawah ke Laboratorium untuk diisolasi bakteri entomopatogen. Hasil pengamatan yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel, gambar dan grafik serta dianalisis secara deskriptif serta menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL).
Penelitian 1. Eksplorasi dan Seleksi Bakteri Entomopatogen, B. thuringiensis
Wilayah Pengambilan Sampel Tanah meliputi 4 kecamatan dari wilayah pasang
surut dan lebak di Sumatera Selatan. Eksplorasi bakteri entomopatogen dilakukan dengan cara pengambilan sampel tanah diambil dari lokasi tanaman. Permukaan tanah dibersihkan, darirumputatautanamanlainnya diukur jarak sekitar 30 cm dari batang tanaman dengan kedalaman 5 cm dan diambil sampel tanah. Sampel tanah tersebut dimasukkan ke dalam plastik sebanyak 1 kg dan diberi label berdasarkan wilayah pengambilan tanah (Tabel 1).
Isolasi Bakteri B. thuringiensis. Sampel tanah diambil sebanyak 10 g kemudian
disuspensi ke dalam 90 mL air steril dalam erlenmeyer secara aseptik lalu dikocok 3-5 dan dipanaskan pada suhu sekitar 80 ºC selama 15 menit. Kemudian diambil sebanyak 1 mL supernatan contoh tanah tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril dan diencerkan sampai 106. Ambil sebanyak 1 mL, supernatant tersebutditebarkan pada cawan petri yang berisi media NGKG (NaCl Glycine Kim and Geofard) dan diratakan pada seluruh permukaan media tersebut dengan menggunakan spatel Drygalski dan diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 1-3 hari hingga koloni bakteri tumbuh. Setiap hari koloni yang tumbuh dicatat. Koloni bakteri yang tumbuh dilakukan pengujian dan dilakukan penyimpanan.
Pengamatan Mikrokopis. Pembuatan preparat olesan bakteri pada setiap bakteri
diambil dengan menggunakan jarum ose selanjutnya air steril diletakkan di atas permukaan gelas objek. Lalu diambil biakan bakteri dengan jarum ose kemudian diletakkan di atas tetesan air steril dan diratakan sampai seluas kira-kira 1 cm². Pewarnaan differensial dari spora dan kristal protein B. thuringiensis. Pada tahap ini uji yang dilakukan yaitu jarum ose biakan bakteri diletakkan pada objek, kemudian ditetesi larutan malakit green 5% dan dipanaskan dengan cara dilewat-lewatkan di atas bunsen selama kurang 10 menit. Setelah itu kelebihan pewarna pada preparat dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan. Setelah kering ditetesi dengan larutan safranin 0,5% selama 1 menit, kemudian dicuci kembali dengan air mengalir dan ditiriskan hingga kering. Kemudian dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Pengujian Bakteri Entomopatogen, B. thuringiensis. Pada pengujian B. thuringiensis
489
A. Uji Gram
Uji gram adalah pengujian ini dilakukan dengan cara mengambil dan meletakkan 1 ujung jarum ose biakan B. thuringiensis pada kaca preparat yang sebelumnya telah ditetesi dengan larutan KOH 3%, jika bakteri tidak berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri bergram positif, sedangkan bakteri yang menghasilkan lendir merupakan bakteri bergram negatif.
B. Uji Katalase
Larutan yang digunakan untuk menguji katalase, yaitu larutan hidrogen peroksida (H2O2). Diteteskan pada kaca preparat, selanjutnya bakteri digoreskan menggunakan jarum ose dan diletakkan pada kaca preparat.Kemudian diaduk sampai menghasilkan gelembung, pada bakteri gram positif tidak akan menghasilkan gelembung sedangkan pada bakteri gram negatif menghasilkan gelembung.
C. Reaksi Oksidasi
Pengujian ini untuk melihat perubahan warna yang terjadi pada kertas oxidase strip. Kertas oxidase strip merupakan kertas yang digunakan untuk menentukan bakteri bergram positif atau negatif. Kertas oxidase strip ditempelkan pada media kemudian diamati perubahannya setelah 10 detik.
Uji Skrining Toksisitas B. thuringiensis. Uji ini dilakukan setelah pengamatan
mikrokopis berdasarkan dari hasil yang didapat meliputi bentuk spora, jumlah spora dan pewarnaan kristal.Parameter pengamatan yaitu morfologi bakteri dan koloni bakteri,
Data perbedaan mortalitas larva antar perlakuan baik pada perlakuan isolat Analisys
of variance (ANOVA).Semua penghitungan dibantu dengan bantuan program SPSS
16.00.
HASIL DAN PEMBAHASAN Eksplorasi dan Seleksi Bakteri Entomopatogen
Tanah berasaldariwilayah Pasang surut ada dua kecamatan yang tanah digunakan pada penelitian ini yaitu, kecamatan Tanjung Lago dan kecamatan Muara Telang. Pada lahan lebak ada dua wilayah yang diambil tanahnya yaitu kelurahan Gandus dan
kecamatan Pemulutan. Kemudiantanahtersebutditumbuhkanpada media NGKG
kolonibakterimenunjukkan ciri-ciri yang sama yaitu bentuk koloni bundar berwarna putih susu, berlendir, tepi licin dan sangat bau busuk (Tabel 3). Bakteri ini dapat diperoleh dari tanah dan permukaan daun.Pada lingkungan yang baik dengan nutrisi yang cukup, bakteri ini akan membentuk spora. Spora tersebut akan terus hidup dan melanjutkan pertumbuhan vegetatifnya. B. thuringiensis dapat tumbuh diberbagai habitat tanaman yang ada baik pada tanaman padi, tanaman sayuran dan tanaman hutan (Khetan 2001).
Koloni B. thuringiensis yang tumbuh pada media memiliki yaitu, bentuk bundar, bewarna putih, berlendir, tepi licin dan berbau busuk (Gambar 1). Menurut Rusman (2000) yang menyatakan koloni bakteri yang tumbuh pada media pada berbentuk bulat, besarnya 5-10 mm, memiliki warna putih. Pada tepian bakteri ini sedikit mengkerut atau bergelombang. Bakteri ini memiliki elavansi timbul serta permukaannya kasar. Koloni-koloni bakteri yang tumbuh pada hari pertama sangat kecil dan hampir rata dengan dengan media, kemudian pada hari kedua bakteri akan membesar dan agak lebar tetapi tidak bersentuhan satu dengan yang lainnya. Pada hari ketiga bakteri yang tumbuh pada hari pertama akan membesar.
Sel bakteri tersebut berbentuk basil memiliki warna kebiruan. Pada penelitian ini sel bakteri juga ditemukan berbentuk basil dan berwarna hijau kebiruan. Pertama sel
490 bakteri berbentuk batang atau bacil kemudian sel bakteri tersebut akan membelah dan berbentuk oval (Gambar 2). Bakteri ini akan membentuk spora secara aerob dan pada waktu sporulasi bakteri ini akan membentuk kristal protein. Kristal protein yang terbentuk dikenal dengan nama delta-endotoksin (Khaswar et al.,2001).Reaksi gram yang dilakukan pada penelitian menunjukkan reaksi gram positif. Hal ini disebabkan apabila bakteri yang diberikan KOH 3% pada biakan bakteri yang diletakkan pada kaca preparat tidak ikut terangkat pada jarum ose. (Gambar 3). Uji katalase yang dilakukan dengan cara meletakkan satu jarum ose biakan B.thuringiensis pada kaca preparat yang sebelumnya sudah ditetesi larutan Hidrogen Peroksida (H2O2) 5% tidak menghasilkan buih maka bakteri tersebut bergram positif (Gambar 4).Reaksi oksidasi pada penelitian ini dengan cara menempalkan kertas oxidase strip pada media yang ada bakterinya. Apabila pada kertas oxidase strip tersebut berubah warna maka bakteri itu bergram positif (Gambar 5).
Uji gram, uji katalase dan uji oxsidase strip merupakan uji untuk menentukan genus bakteri tersebut. Sedang untuk uji spesies mengunakan media selektif yaitu NGKG (NaCl Glycine Kim and Geofard), hal ini bisa dilihat dari perubahan warna yang ditimbulkan pada media. Populasi koloniB. thuringiensis tertinggi dan terendah berasal tanah pasang surut. Tertinggi pada kode isolat BUA dengan rata-rata 703,7 cfu/mL sedangkan terendah kode isolat SHA dengan rata-rata 161,0 cfu/mL. Rata-rata populasi koloni B. thuringiensis yang tumbuh pada media NGKG sangat bervariasi antar asal tanah. Tanah-tanah yang diambil dapat membunuh serangga hama, hal ini disebabkan karena mengandungB.
thuringiensis (Salaki et al., 1997; Situmorang 1993).Kondisi yang lembab ini sangat cocok
untuk B. thuringiensis. Hal ini dikarenakanB. thuringiensis bersifat aerob, sedangkan pada kondisi lingkungan yang tidak tetap atau berubah-ubah membuat kondisi mikroorganisme di dalam tanah tersebut juga sedikit(Tabel 4). Menurut De lucca et al., (1981) menyatakan bahwa B. thuringiensis bisa dilakukan isolasi dari tanah. Tanah tersebut bisa digunakan dalam proses untuk mendapatkan bakteri tersebut.B. thuringiensis bisa hidup di semua tempat, sehingga untuk mengisolasi bisa dari beberapa sumber seperti yang dilakukan pada penelitian ini. Jumlah kerapatan sel pada masing-masing isolat sangat bervariasi.
KESIMPULAN
Simpulan yang dapat diambil dari penelitian ini yaitu Spesies bakteri entomopatogen yang ditemukan dari tanah lebak dan pasang surut Sumatera Selatan adalah
B. thuringiensis. Koloni bakteri tertinggi pada isolat BUA yaitu 703,7 cfu/mL sedangkan
terendah pada isolat SHA yaitu 161,0 cfu/mL.
SARAN
Perlu dilakukan uji penyimpanan baik terhadap isolat bakteri maunpun bioinsektisida.Dilakukan pengujian terhadap bakteri DNA dari B. thuringiensis untuk menentukan subspesies dan perlu dilakukan pengujian di lapangan untuk mengetahui tingkat toksisitas di lahan.
DAFTAR PUSTAKA
Bahagiawati. 2002. Penggunaan Bacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.
Bravo A, Sarabia S, Lopez L, Ontiveros H, Abarca C, Ortiz A, Ortiz M, Lina L, Villalobos FJ, Pena G, Nunez-Valdez M-E, Soberon M and Quintero R. 1998. haracterization
491 of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Appl nviron Microbiol 64: 4965-4972.
De Lucca AJ, JG Simonson, AD Larson. 1981. Bacillus thuringiensis Distribution in Soli of the United States Can. J. Microbiol. 27:865-870.
Hofte H dan HR Whiteley. 1989. Distribution of Bacillus thuringiensis. Microbiol. Rev. 53(2): 242-255.
Khaswar, Rahayuningsih M, dan Yulianti. 2001. Pengaruh Aerasi terhadap Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Subsp. Israelensis pada Bioindikator Tangki Berpengaduk dan Kolom Gelumbang. Jurusan Teknologi Indutri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor, volume 11(3), 92-100 Khetan SK. 2001. Microbial Pest Control. Maecell Dekker, Inc. USA.p.3-141
Rusman R. 2000. Makalah Faksafah Sains (Pps 702). Program Pascasarjana/S3. Institut Pertanian Bogor, Oktober, 2001.p
Situmorang J. 1993. Isolasi Bakteri Tanah Entomopatogenik (Bacillus spp.)di Daerah Yogyakarta dan Uji Patogenitasnnya terhadap Ulat Grayak (Spodoptera litura Fabr.). Biologi. Vol. Laboratotium Entomologi, Fakultas Biologi. UGM.
Salaki C, Situmorang J, Sembiring L. 1997. Isolation dan Characterization og Indonesia
indigenous bacteria (Bacillus thuringiensis) which are potential for biological
control agent against cabbage heart caterpillar (Crocidolomia binotalis Zell). Jurusan Hama dan Penyakit, Fakultas UNSRAT Manodo. Laboratorium Entomologi. Fakultas Biologi UGM. Laboratorium Mikrobiologi, Fakulta Pertanian UGM. Yogyakarta.
492 Gambar 1: Koloni B. thuringiensis yang berasal dari tanah yang tumbuh pada media
NGKG
Gambar 2Sel B. thuringiensis pada perbesaran 10 x 100
Gambar 3: Reaksi gram pada B. thuringiensis menggunakan larutan KOH 3% yang tidak
493 Gambar 4: Uji katalase pada B. thuringiensis menggunakan larutan H2O2 yang tidak
menghasilkan buih (gram positif)
A B
Gambar 5. Reaksi Oksidasi menggunakan kertas oxidase strip P. fluorescens (A) berubahwarna (gram negatif) danB. thuringiensis (B) tidak berubah warna (gram positif
Tabel1. Lokasieksplorasi bakteri entomopatogen, B. thuringiensis
No. Lokasi Tanah Tipe Ekosistem
Rawa Nama Tanaman
Kode Sampel Tanah
1. Desa Panca Mukti Pasang Surut Gelam PMG
Kec. Muara Telang Nangka PMN
2. Desa Sumber Hidup Pasang Surut Jabon SHJ
Kec. Muara Telang Akasia SHA
3. Desa Telang Rejo Pasang Surut Pisang TRP
Kec. Muara Telang Akasia TRA
4. Desa Sumber Mulyo Pasang Surut Rambutan SMR
Kec. Muara Telang Akasia SMA
5. Desa Muara sugih Pasang Surut Pisang MSPi
Kec. Tanjung Lago Padi MSP
Kelapa Sawit MSKS
Akasia MSA
6. Desa Banyu Urip Pasang Surut Akasia BUA
Kec. Tanjung Lago Pisang BUPi
Padi BUP
494
Kec. Pemulutan Mangga PIM
8. Desa Pemulutan Ulu Lebak Mangga PUM
Kec. Pemulutan Pisang PUPi
Kelapa PUK
9. Desa Pelabuhan
Dalam Lebak Ubi Kayu PDUK
Kec. Pemulutan Kelapa PDK
10. Gandus Lebak Akasia GA
Kec.Gandus Karet GK
Tabel 2. Pembuatan Mediumcair berbahan aktif bakteri entomopatogen
Media Cair Kode Media
Bt (NGKG) + Media Nutrien Borth A
Bt (NGKG) + Air Kelapa B
Bt (NGKG) + Cairan Limbah Tahu C
Bt (NGKG) + Air Rendaman Kedelai D
Bt (NGKG) + Air kelapa + Cairan Limbah Tahu E
Bt (NGKG) + Air kelapa + Air Rendaman kedelai F
Aquades G
Tabel 3: Ciri morfologi koloniB. thuringiensisyang diambil dari lahan tanah Pasang Surut dan Lebak
Kode isolat Bentuk Tepian Elevasi warna
PMG Bundar Licin Timbul Putih Susu
PMN Bundar Licin Timbul Putih Susu
SHJ Bundar Licin Timbul Putih Susu
SHA Bundar Licin Timbul Putih Susu
TRP Bundar Licin Timbul Putih Susu
TRA Bundar Licin Timbul Putih Susu
SMR Bundar Licin Timbul Putih Susu
SMA Bundar Licin Timbul Putih Susu
MSPi Bundar Licin Timbul Putih Susu
MSP Bundar Licin Timbul Putih Susu
MSKS Bundar Licin Timbul Putih Susu
MSA Bundar Licin Timbul Putih Susu
BUA Bundar Licin Timbul Putih Susu
BUPi Bundar Licin Timbul Putih Susu
BUP Bundar Licin Timbul Putih Susu
PIK Bundar Licin Timbul Putih Susu
PIM Bundar Licin Timbul Putih Susu
PUM Bundar Licin Timbul Putih Susu
PUPi Bundar Licin Timbul Putih Susu
495
PDUK Bundar Licin Timbul Putih Susu
PDK Bundar Licin Timbul Putih Susu
GA Bundar Licin Timbul Putih Susu
GK Bundar Licin Timbul Putih Susu
Tabel 4. Populasi B. thuringiensis dalam tanah di lahan Lebak dan PasangSurut
Kode Isolat Populasi dalam tanah (cfu /ml)
Kisaran Rata-rata PMG 306,00-489,00 420,33 defg PMN 244,00-407,00 342,67fg SHJ 258,00-346,00 304,00 g SHA 153,00-166,00 161,00 h TRP 506,00-568,00 539,33 abcd TRA 451,00-604,00 519,00 abcde SMR 385,00-518,00 468,00 bcdef SMA 574,00-682,00 619,33 abc MSPi 631,00-719,00 664,00 ab MSP 428,00-633,00 507,67 abcde MSKS 662,00-669,00 666,33 ab MSA 559,00-682,00 624,00 abc BUA 680,00-718,00 703,67 a BUPi 624,00-662,00 644,00 abc BUP 334,00-419,00 367,33 defg PIK 439,00-451,00 443,00 cdefg PIM 359,00-430,00 403,67 defg PUM 471,00-584,00 518,67 abcde PUPi 336,00-412,00 385,00 defg PUK 642,00-647,00 654,00 abc PDUK 524,00-582,00 547,67 abcd PDK 349,00-427,00 399,33 defg GA 528,00-613,00 557,67 abcd GK 578,00-534,00 558,00 abcd
Keterangan : Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama berbeda tidaknyata berdasarkan uji BNJ 5 % = 0,23 (Transformasi Log)
